全 文 ：中 国 酿 造
2014年 第 33卷 第 2期
总第 264期
黑三棱系黑三棱科植物黑三棱（Sparganium stoloni-
ferumBuch.-Ham.）的块茎，其去皮干燥块茎为中药三棱，
是临床常用破血药。中药三棱性平味苦，入肝、脾经，具有
破血行气、消积止痛之功效[1]，用于治疗肿瘤、心血管疾病
以及子宫肌瘤、子宫内膜异位症等妇科疾病，属于活血化
瘀中药。已报道的三棱化学成分有苯丙素类、黄酮（苷）类、
皂苷类以及有机酸类和挥发油[2]，药物化学研究证实，三
棱富含黄酮苷类与生物碱成分[3-8]，三棱黄酮在体内、外实
验时均表现为与三棱适应症相关的药理活性[9]，产生显著
的干扰内分泌、抑制细胞周期相关生长因子表达及抑制血
管生成相关生长因子表达的多重毒理作用[10-13]，可以抑制
A549、MCF-7恶性肿瘤细胞的增殖活性、阻滞细胞周期进
行、干扰细胞骨架形态建成并诱导细胞凋亡[14-15]，是三棱
抗癌的活性成分部位。《中国药典（2005年版）》尚未将三
棱的活性黄酮类成分纳入该药材的鉴定与质量控制检测
范围[16]。目前，对于黑三棱中黄酮的提取率测定也有报道[17]。
而对于黑三棱中黄酮的提取工艺则罕见报道。因此，用
Box-BehnkenDesign（BB）试验设计及响应面分析的方
法，对黑三棱中黄酮类化合物的提取工艺参数进行优化，
以确定最佳提取工艺，为黑三棱药材抗癌黄酮活性成分
的提取利用提供科学的理论依据。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
黑三棱：于2012年10月甘肃省张掖市湿地公园采集
（河西学院农业与生命科学学院张勇教授鉴定），用水洗
净，自然风干，粉碎过60目筛，备用。
芦丁：美国Sigma公司；乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2均
为国产分析纯。
1.2仪器与设备
DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱：上海琅环实验设
基于响应面分析法优化的黑三棱黄酮提取条件
林 敏，李 伟，吴冬青，安红钢，任雪峰
（河西学院 甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000）
摘 要：在单因素试验的基础上，对乙醇浓度、提取时间、液固比和提取温度4因素进行Box-Behnken组合试验设计并通过响应面分
析，优化黑三棱中黄酮类化合物的提取工艺。结果表明：提取黑三棱中黄酮类化合物的最佳工艺参数为乙醇体积分数66%、提取时间
61min、液固比40∶1，提取温度81℃。在此条件下，黄酮类化合物的实际提取率为33.79mg/g，与预测值33.77mg/g基本一致。在4个因素
中，乙醇体积分数对提取率影响最大，其次是提取温度，而提取时间、液料比对黄酮类化合物提取率影响较小，并且提取时间和提取
温度的交互作用对黄酮提取率有较小影响，其他的因素间无交互作用。
关键词：黑三棱；黄酮类化合物；提取条件；响应面方法
中图分类号：O623.54 文献标识码：A 文章编号：0254-5071（2014）02-0055-04
doi：10.3969/j.issn.0254-5071.2014.02.013
OptimizationofflavonoidsextractionconditionsfromSparganiumstol iferum
byresponsesurfacemethodology
LINMin,LIWei,WUDongqing,ANHonggang,RENXuefeng
（KeyLaboratoryofHexiCorridorResourcesUtilizationofGansuUniversities,HexiUniversity,Zhangye734000,China)
Abstract:Onthebasi ofsingle-factortest,theextractiontechnologyoftotalflavonoidsfromSparga iumst niferumwasoptmizedbyBox-Behnken
designonethanolconcentration,extractiontime,liquid-to-solidratioandextractiontemperature.Theresultsshowedthattheoptimalextractioncon-
ditions were as follows: ethanol concentration 66%, extraction time 61min, liquid-to-solid ratio 40∶1, and extraction temp rature 81℃. Under such
conditions,theextractionratewas33.79%, in good agreement with the predicted one of33.77%. In these four factors, ethanol volume fraction had
thegreatestinfluenceonextractionyield,followedbytheextractiontemperature.Theextractiontime,liquidratiohadlessaffectionontheextraction
rateofflavonoids.Theinteractionofextractiontimeandtemperaturehadlessimpactontheextractionrateofflavonoids,andtherewerenointerac-
tionsamongotherfactors.
Keywords:Sparganiumstoloniferum;flavn ids;extractionconditions;responsesurfacemethodology
收稿日期：2014-01-04
基金项目：甘肃省教育厅研究生导师资助项目（1009-）；甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室科研资助项目（XZ1203）
作者简介：林 敏（1967-），女，副教授，本科，研究方向天然产物有效成分提取与分析。
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2014 Vol.33 No．2
Serial No．264
备有限公司；FW177型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器
有限公司；WFJ2100型可见分光光度计：上海尤尼柯仪器
有限责任公司；GB204型电子天平：Mettler Toledo公司；
SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司。
1.3实验方法
1.3.1芦丁标准曲线制作
吸取质量浓度为0.1600mg/mL的芦丁对照液0、0.50mL、
1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL、3.50mL，分别
置于10mL容量瓶中，加水补至4mL，再加入5%亚硝酸钠
0.4mL，摇匀后放置6min，加入10%硝酸铝0.4mL，摇匀后
放置6min，然后加入5%氢氧化钠溶液4.0mL，补体积分数为
70%的乙醇至刻度，放置10min后，在波长507nm处测定其
吸光度值（以试剂空白作参比）。以芦丁质量浓度C为横坐
标，吸光度值A为纵坐标作标准曲线（见图1），得回归方程：
A=15.343C-0.0478（R2=0.997）。
1.3 2样品中黄酮得率测定
准确称取一定量的原材料3份于圆底烧瓶中，加入不
同体积分数、不同体积的乙醇作提取剂，设定温度水浴加
热下冷凝回流一定时间，然后抽滤得提取液。定容至50mL，
用1.3.1方法测定其黄酮得率。
黄酮得率=
cvd
m
×100%
式中：c为待测液中黄酮的质量浓度，mg/mL；v为待测液的
体积，mL；d为稀释倍数；m为取样的质量，mg。
1.3.3单因素试验
分别考察提取剂（乙醇）体积分数，提取温度、提取时间、
液固比对黑三棱黄酮得率的影响，提取及测定方式同1.3.2。
1.3.4黄酮类化合物提取工艺优化
在单因素试验结果的基础上，对提取时间、乙醇体积
分数、提取温度和液固比4个影响黄酮得率的主要因素进
行优化试验。采用Box-Behnken组合设计方法，试验因素
与水平设计见表1。
2 试验结果
2.1单因素试验结果与分析
2.1.1提取温度对黄酮提取率的影响
称取0.5000g原材料3份于50mL圆底烧瓶中，加入10mL
体积分数为70%的乙醇作提取剂，不同水浴温度条件下冷
凝回流1.0h，然后抽滤得提取液。定容至50mL，用1.3.1方法
测定其吸光度值。提取温度对黄酮得率影响结果见图2。
从图2可知，随着温度的升高黄酮得率也增加，当水浴
温度为80℃左右时，提取物中黄酮得率最高，高于80℃后，杂
质物溶出量增多，阻碍黄酮类物质溶出，故选择提取温度
80℃为宜。
2.1.2提取时间对黄酮得率的影响
准确称取0.5000g原材料3份于50mL圆底烧瓶中，加
入10mL体积分数为70%的乙醇作提取剂，80℃水浴加热
条件下冷凝回流0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h，然后抽滤得提
取液。定容至50mL，用1.3.1方法测定其吸光度值。提取时
间对黄酮得率的影响结果见图3。
表1 黄酮提取条件优化试验的因素水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for
flavoniods extraction optimization
A提取时间/
h
B乙醇体积
分数/%
C提取温度/
℃
D液固比
（mL∶g）
-1 0.5 60 70 30∶1
0 1.0 70 80 40∶1
1 1.5 80 90 50∶1
水平
图2 提取温度对黄酮得率的影响
Fig. 2 Effect of extraction temperature on extraction yield of flavonoids
图3 提取时间对黄酮得率的影响
Fig. 3 Effect of extraction time on extraction yield of flavonoids
图1 芦丁标准曲线
Fig. 1 Standard curve of rutinum
ResearchReport56· ·
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从图3可知，当提取时间在1h时，提取物中黄酮提取率
最高，随着提取时间的增加，提取物中黄酮提取率反而降
低，因为提取时间长，醇溶性物质增多，部分黄酮类物质可
能被氧化使黄酮提取率下降。因此，提取时间选择1h为宜。
2.1.3乙醇体积分数对黄酮得率的影响
准确称取0.5000g原料3份，加入10mL不同体积分数的
乙醇，80℃水浴加热条件下冷凝回流1.0h，然后抽滤得提取
液。定容至50mL，用1.3.1方法测定其吸光度值。乙醇体积
分数对黄酮得率影响结果见图4。
从图4可知，当乙醇体积分数为70%时，提取物中黄酮
得率最高，随着乙醇体积分数的增大，提取物中黄酮得率
反而降低。说明乙醇体积分数过高，醇溶性和脂溶性物质
溶出量增多，导致黄酮类化合物溶出率下降，故乙醇体积
分数选择70%为宜。
2.1.4液固比对黄酮得率的影响
用体积分数70%的乙醇，分别以不同的液固比，在80℃
水浴加热条件下冷凝回流1.0h，然后抽滤得提取液。定容
至50mL，用1.3.1方法测定其吸光度值。液固比对黄酮得率
的影响结果见图5。
从图5可知，黄酮得率随着液固比的增加而上升，当液
固比超过40∶1后，黄酮得率有所下降。溶剂用量少，提取不
完全，超过40∶1后杂质溶解会增加，且成本会增大，故选择
40∶1为宜。
2.2黄酮类化合物提取工艺优化
根据Box-Behnken试验方案进行试验后，对试验数据
进行二次回归拟合，得到合适的回归方程，对此方程所代
表的面进行分析，可以得到最佳条件在试验中所覆盖的区
域，或是指明在哪些方向上在进行试验可得到更好的结
果。试验设计与统计分析软件为DesignExpert8.06。设计
试验方案及试验结果见表2。
采用DesignExpert8.06进行统计分析，得到黑三棱中
黄酮类化合物的提取率与各因素变量间的函数关系为：
Y=33.33+0.20A-2 01B+ .75C+0.21D-0.040AB-
0.96AC-0.08AD+0.28BC+0.52BD+0.20CD-
1.08A2-2.55B2-2.26C2-1.46D2
为了说明回归方程的有效性及各因素对提取率的影
响程度，对回归方程进行了方差分析，结果见表3。
图4 乙醇体积分数对黄酮得率的影响
Fig. 4 Effect of ethanol volume fraction on extraction yield of flavonoids
图5 液固比对黄酮得率的影响
Fig. 5 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of flavonoids
表2 Plackett-Burman试验设计方案及试验结果
Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiment
试验号 A B C D 黄酮得率/（mg·g-1）
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
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1
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0
0
0
30.71
31.98
27.19
28.31
29.11
30.07
28.47
30.23
29.75
30.71
30.87
31.50
29.43
25.11
31.18
27.99
29.27
30.39
31.98
29.27
32.14
26.39
31.66
27.99
33.74
33.90
33.26
32.62
33.10
研究报告 57· ·
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Serial No．264
从表3可以看出，乙醇体积分数和提取时间对黄酮类
化合物的提取率影响极显著；二次项对黄酮类化合物提取率
均达到极显著水平；交互项中除AC外对提取率无影响。此
模型的决定系数R2为0.9511，经拟合检验可知，P=0.0001<
0.01差异极显著，说明该方程与实际情况拟合很好，能够
正确反映黑三棱中黄酮类化合物的提取率与乙醇体积分
数、提取时间、提取温度和液料比之间的关系。失拟检验P=
0.2453>0.05，不显著，说明本试验无其他因素的显著影响，
模型是适合的[19]。
2.3最佳工艺参数
由统计软件分析得到，黑三棱中黄酮类化合物的最佳
提取工艺为乙醇体积分数66.15%、提取时间61.20min、提
取温度81.33℃、液料比40.13∶1。此时黄酮类化合物的理论
提取率最大为33.77mg/g。考虑实际操作情况，确定黑三棱
中黄酮类化合物的最佳提取工艺参数为乙醇体积分数
66%、提取时间61min、提取温度81℃、液料比40∶1
在此条件下，重复试验3次，得到黑三棱中黄酮类化合
物的提取率分别33.77mg/g、33.79mg/g、33.81mg/g，平均
33.79mg/g，与预测值基本一致，证实了该模型的有效性。
3 结论
提取黑三棱中黄酮类化合物的最佳工艺条件为乙醇体
积分数66%、提取时间61min、提取温度81℃、液料比40∶1。
在此条件下，黄酮类化合物的提取率为33.79mg/g，与预测
值基本一致。
乙醇体积分数和提取温度是影响黑三棱中黄酮类化
合物提取率的主要因素，其中乙醇体积分数对提取率影响
最大，其次是提取温度，而提取时间、液料比对黄酮类化
合物提取率影响较小，并且4因素之间，提取时间和提取
温度的交互作用对黄酮提取率有较小影响，其他的因素
间无交互作用。
参考文献：
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表3 回归方程的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression equation
方差来源 总和 自由度 均方 F值 PrA-A
B-B
C-C
D-D
AB
AC
AD
BC
BD
CD
A2
B2
C2
D2
模型
参差
失拟误差
纯误差
总和
0.48
48.49
6.67
0.54
6.380E-003
3.67
0.026
0.31
1.08
0.16
7.52
42.33
32.99
13.76
128.52
6.60
5.55
1.05
135.12
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
14
14
10
4
8
0.48
48.49
6.67
0.54
6.380E-003
3.67
0.026
0.31
1.08
0.16
7.52
42.33
32.99
13.76
9.18
0.47
0.56
0.26
1.01
102.79
14.14
1.15
0. 14
7.79
0.054
0.66
2.29
0.34
15.95
89.74
69.93
29.17
2.11
0.3310
<0.0001
0.0021
0.3009
0.9091
0.0144
0.8194
0.4292
0.1528
0.5702
0.0013
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
0.2453
**
**
*
**
**
**
**
**
R2=0.9511Radj=0.9023C.V.=2.27%
注：“**”为差异极显著（P<0.01）；*为差异显著（P<0.05）。
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