全 文 ：收稿日期:2004-09-29;修回日期:2005-05-09
基金项目:中国科学院百人计划项目基金;国家自然科学基金资助项目(NSFC20021001);甘肃省自然科学基金
资助项目(ZS021-A25-011-Z)
作者简介:陈 娟(1975-), 女 , 湖南邵阳人 , 博士;师彦平 , 联系人 , Tel:0931-4968208, E-mail:shiyp@lzu.edu.cn
高效液相色谱法测定粘毛鼠尾草石油醚提取物中
一种新吉玛烷型倍半萜
陈 娟 1 , 李 亚 1 , 师彦平 1 , 2
(1.中国科学院兰州化学物理研究所 甘肃省天然药物重点实验室 , 甘肃 兰州 730000;
2.兰州大学 应用有机化学国家重点实验室 , 甘肃 兰州 730000)
摘 要:建立了高效液相色谱分离测定粘毛鼠尾草中一种新吉玛烷型倍半萜 , 3β , 6β , 8α_三乙酰氧基_4β ,5α_环氧
吉玛_1_烯的方法 。 采用 Kromasil C18反相色谱柱 , 以甲醇-水(体积比 75∶25)为流动相 , 流速 0.8mL/min , 检测
波长 204 nm , 在 10 min内分离检测该倍半萜 。结果线性范围 0.065 ～ 32.5μg , 相关系数 0.999 , 检出限 0.01μg ,
平均回收率 98%, RSD 3.1%。 测得粘毛鼠尾草全草石油醚提取物中该吉玛烷倍半萜的含量为 20.9mg/g。
关键词:植物成分分析;高效液相色谱法;唇形科;粘毛鼠尾;吉玛烷倍半萜
中图分类号:O657.72;Q949.777.6 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2005)05-0098-03
Determination of Germacrane Sesquiterpene in Petroleum Ether Extract from
the Whole Plant of Salvia Roborwskii Maxim by High Performance
Liquid Chromatograghy
CHEN Juan1 , LI Ya1 , SHI Yan_ping1 , 2
(1.Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province , Lanzhou Institute of Chemical Physics , Chinese Academy of
Sciences , Lanzhou 730000 , China;2.State Key Laboratory of Applied Organic Chemistry , Lanzhou University ,
Lanzhou 730000 , China)
Abstract:A simple , rapid and accurate high_performance liquid chromatographic technique coupled with pho-
todiode array detection was developed for the determination of a new germacrane sesquiterpene , named 3β ,
6β , 8α_triacetoxy_4β , 5α_epoxygermacr_1(10)E_ene.HPLC was performed within 10min on a Kromasil C18
column(250 mm×4.6 mm.i.d , 5μm)using methanol-water(75∶25 by volume)as the mobile phase at
a flow rate of 0.8 mL/min , and 204 nm as the detection wavelength.The result showed that there was a good
linear relationship in the range of 0.065-32.5μg with the correlation coefficient being 0.999.The detec-
tion limit was 0.01μg , and the mean recovery was 98%with a relative standard deviation of 3.6%.The
content of germacrane sesquiterpene in the petroleum ether extract from the whole plant of Salvia roborwskii
maxim was 20.9 mg/g.
Keywords:Analysis of plant constituents;High performance liquid chromatography;Labitatae;Salvia robor-
wskii maxim;Germacrane sesquiterpene
唇形科(labitatae)鼠尾草属(salvia)植物全球约有 1 000余种 , 广泛分布于热带 、亚热带和温带地区。
30多种鼠尾草属植物已在全国各地作为丹参代用品药用[ 1] , 其中粘毛鼠尾草(salvia roborwskii Maxim)在
甘肃省境内分布较为广泛 , 资源丰富。 研究表明 , 鼠尾草属植物的化学成分主要为萜类(包括单萜 、倍
半萜 、二萜 、二倍半萜 、三萜)和酚性类(主要包括酚性芳香酸 、黄酮 、鞣质 、花青素等)[ 2] , 其中二萜类
为主要的活性成分 , 如最具代表性的是中药丹参 , 它的主要活性成分为丹参酮[ 3] , 二萜醌类是该属植物
的代表性成分 [ 4 , 5]。 本课题组对采自甘肃漳县的粘毛鼠尾草进行了化学成分的系统研究 , 从中获得了
20个化合物 , 并得到了一种新结构的吉玛烷倍半萜 , 命名为 3β , 6β , 8α_三乙酰氧基_4β , 5α_环氧吉玛_1_
烯 [ 6] , 该倍半萜的生物活性实验正在进行当中。
第 24卷 第 5期 分析测试学报 Vol.24 No.5
2005年 9月 FENXI CESHI XUEBAO(Journal of Instrumental Analysis) 98～ 100
图 1 吉玛烷倍半萜的分子结构
Fig.1 Molecular structure of the
germacrane sesquiterpene
高效液相色谱是目前使用最为广泛的一种分离分析植物有效成分的手段之一 , 采用高效液相色谱
对植物中的中小极性倍半萜类的分离分析报道较少 。 本文首次建立了粘毛鼠尾草石油醚提取物中一种
新吉玛烷倍半萜的反相高效液相色谱二极管阵列检测(RP-HPLC/DAD)测定法 , 为今后制备大量该化合
物提供一定的参考价值 , 也为粘毛鼠尾草的开发利用和质量控制提供一定的实验依据。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Waters 系列高效液相色谱仪 , 包括四元梯度泵(δ_600E), 二极管阵列检测器(2996型), 色谱数据工
作站(Millennium32)。 3β , 6β , 8α_三乙酰氧基_4β , 5α_环氧吉玛_1_烯对照品从粘毛鼠尾草中分离获得 , 经
红外光谱(IR), 超导核磁共振波谱(NMR)和质谱(MS)等确定结构为吉玛烷倍半萜 [ 6](结构如图 1所示)。
粘毛鼠尾草石油醚提取物为全草(50 g)用 95%的工业乙醇室温浸泡 3次后得到的浸膏 , 溶于水后用石
油醚萃取所得(0.9 g)。甲醇为色谱纯 , 水为重蒸馏水 , 其余试剂均为分析纯 。Bio_beads SX 3(37～ 147
μm)为美国 BIO_RAD公司产品。
1.2 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱:Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm.i.d , 5μm , 中国科学院
大连化学物理研究所);流动相:甲醇-水(体积比 75∶25);流速:
0.8 mL/min;柱温:25 ℃;检测波长:204 nm;进样量:10μL。
在上述色谱条件下 , 待测峰和样品中其它组分色谱峰达到基线分
离 , 分离度大于 1.5;以待测峰计算柱效 , 其理论塔板数(N)为 6 100 ,
不对称因子(As)为 0.87。
1.3 样品预处理
准确称取石油醚提取物 0.1 g , 用 3 mL甲苯溶解 , 通过 Bio_beads SX3柱(Bio_beads SX3首先用适量
甲苯浸泡 , 待充分溶胀后 , 湿法装入内径为 20 mm的柱内 , 最后下沉后的柱高为 10 cm), 用甲苯洗脱 ,
弃去初始洗脱液 20 mL , 收集 50 mL , 减压回收甲苯 , 残渣用流动相溶解并定容至 5 mL , 过 0.45μm有
机系微孔滤膜 , 作为供试品溶液。
2 结果与讨论
2.1 样品预处理方法的选择
曾采用流动相为提取溶剂 , 直接进样 , 发现杂质干扰严重 , 色谱柱易受污染 , 柱效下降 。 为了解决
这一不足 , 本文采用 Bio_beads SX 3凝胶类吸附剂 , 柱层析过滤 , 除去石油醚提取物中大量的色素 , 从而
能有效消除干扰 , 减轻对色谱柱的损害 。
2.2 色谱条件的选择
2.2.1 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器(DAD)对进样后的吉玛烷倍半萜对照品进行全波长扫
描 , 结果在 204 nm有最大紫外吸收 , 因此选定检测波长为 204 nm。
2.2.2 流动相的选择 考察了甲醇含量对其保留行为以及与提取物中杂质之间分离的影响 。 随甲醇
含量的降低(85%※65%), 待测峰的保留时间增加 , 并与杂质峰的分离度增大 。 甲醇含量超过 80%时 ,
待测峰与杂质峰几乎不能分离 , 而小于 70%时 , 分离度增加 , 但待测峰展宽 , 当流动相中甲醇含量为
75%时 , 待测物与杂质基线分离 , 分析时间较短 , 且峰形尖锐对称 , 通过二极管阵列检测器对待测峰的
起点 、顶点和终点进行峰纯度检测 , 并应用 Millennium32软件中的峰纯度角理论判定 , 该峰的纯度良好 ,
为一纯组分峰。 最终选定流动相为甲醇-水(体积比 75∶25)。
2.3 对照品纯度检查
取吉玛烷倍半萜对照品 16.25mg , 加流动相制成 3.25mg/mL的溶液 , 注入液相色谱仪 , 峰面积归一
化法计算 , 纯度为 98.6%, 满足定量分析的要求。
第 5期 陈 娟等:高效液相色谱法测定粘毛鼠尾草石油醚提取物中一种新吉玛烷型倍半萜 99
图 2 吉玛烷倍半萜(TET)(A)和粘毛鼠尾草全草石油醚
提取物(B)的色谱图
Fig.2 Chromatogram of the standard(marked as TET)(A)
and the petroleum ether extract from the whole plant of Salvia
roborwskii maxim(B)
参考文献:
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2.4 线性关系考察
精密称取对照品 16.25 mg , 用流动相配制成质量浓度分别为 3.25 、 1.625 、 0.650 、 0.325 、 0.130 、
0.065 、 0.006 5 mg/mL的溶液。 以上述色谱条件测定峰面积 , 以进样量(μg , X)为横坐标 , 峰面积(Y)
为纵坐标 , 绘制标准曲线 , 得回归方程为 Y=9.293×105 X+1.065×105 , r=0.999。 结果表明该化合物
在 0.065～ 32.5μg范围内线性关系良好 。 按信噪比 S/N=3计 , 检出限为 0.01μg 。
2.5 精密度及重复性实验
精密吸取对照品溶液(0.325 mg/mL)10μL , 于同日内连续测定 5次 , 以保留时间和峰面积计算日内
精密度 , 求得 RSD分别为 0.9%和 1.3%。 连续 5天(每日 1次)进行测定 , 计算日间精密度 , 求得保留
时间和峰面积的 RSD 分别为 1.7%和
3.3%。
取粘毛鼠尾草石油醚提取物 , 按 “1.3
样品制备” 项下方法制备 5份供试品溶液 ,
依法测定 , 并计算含量 , 结果 RSD 为
5.0%。
2.6 回收率实验
精密称取已知含量的石油醚提取物适
量 , 共 5份 , 分别加入一定量对照品 , 按照
前述样品制备方法进行处理 , 依法测定 ,
结果见表 1。
2.7 样品测定
将对照品溶液(0.325 mg/mL)和供试品
溶液 , 注入高效液相色谱仪 , 测得粘毛鼠
尾草全草石油醚提取物中含 3β, 6β , 8α_三
乙酰氧基_4β , 5α_环氧吉玛_1_烯为 20.9
mg/g。 对照品和样品的色谱图见图 2。
表 1 加样回收率实验
Table 1 Recovery testing results
Sample Original Added Found Recovery Average RSD
m/ g mO/g mA/g mF/ g R/% R/% sr/ %
0.104 7 2.188 1.02 0.996 97.6
0.102 4 2.140 1.21 1.228 101.5
0.087 3 1.825 2.22 2.209 99.5 98 3.1
0.081 6 1.705 2.07 1.944 93.9
0.123 7 2.585 1.67 1.595 95.5
100 分析测试学报 第 24卷