全 文 ：　[收稿日期] 　2009-09-18;2010-03-09修回
　[基金项目] 　贵州省教育厅自然科学研究项目“黔产竹节参保护生物学及其特征药用化学成分研究”(黔教科 2005224)
　[作者简介] 　赵荣飞(1977-),男 ,讲师 ,在读硕士 ,从事植物次生代谢产物研究。 E-mai l:zrfbelieve@163.com
[ 文章编号] 1001-3601(2010)03-0141-0039-03
黔产竹节参总皂苷含量测定条件的优化
赵荣飞1 , 2 , 田维恩1 , 刘 和1 , 张 来1
(1.安顺学院 化学系 , 贵州 安顺 561000;2.贵州师范大学 化学与材料科学学院 , 贵州 贵阳 550001)
　　[摘　要] 为确定香草醛-硫酸-甲醇分光光度法测定黔产竹节参总皂苷含量的优化条件 ,利用酸性条件
下 ,香草醛与人参皂苷生成有色化合物 ,进行比色测定 ,通过正交试验对影响比色反应的因素进行优化 。结果显示:有色化合物在 496 nm 有最大吸收 , 优化条件下制备的总皂苷回归方程为:A =0.001 2 +
0.004716C ,相关系数 r=0.999 1 ,线性范围为 0.007 ～ 0.035mg/mL ,平均加标回收率为:99.15%, RSD=
0.17%(n=5)。表明:该条件下测定黔产竹节参总皂苷含量 ,结果准确 、可靠 ,重复性好 。[关键词] 竹节参;总皂苷;优化条件;香草醛-硫酸-甲醇法;分光光度法[中图分类号] S567.5+3 [文献标识码] A
Optimization of Determination Conditions of Total Saponin
Content in Panax japonicus Produced in Guizhou
ZHAO Rong-fei1 , 2 , TIAN Wei-en1 , LIU He1 , ZHANG Lai1
(1.Department of Chemistry , Anshun College , Anshun , Guizhou 561000;2.School o f Chemisrty and Materials ,
Guizhou Normal University , Guiyang , Guizhou 550001 , China)
　　Abstract:The orthogonal test w as used fo r opt imizing facto rs af fecting colo rimetric reaction o f the
chemical compound o f vanillin and saponin from Panax japonicus produced in Guizhou.The re sults
show ed that the maximum absorption of the co lored compound w as at 496nm , the reg ression equation fo r
preparation of to tal saponin w as A=0.001 2+0.004716C and its correlated coef ficient , linear range , mean
recovery and RSD were 0.999 1 , 0.007 ～ 0.035mg/mL , 99.15% and 0.17%(n =5) respectively.
Therefo re , the vanillin-sulfuric acid-methanol spect ropho tometer method for dete rmining to tal saponin
content has accurate , reliable and good repeatable advantag es.
Key words:Pana x japonicus;to tal saponin;optimizat ion;vani llin-sulfuric acid-methano l spect ropho-
tometer method
　　竹节参(Panax japonicus C.A.Meyer)为五
加科人参属植物 ,是我国常用的中药 ,具有滋补强
壮 ,止血化淤及消肿镇痛等功能 。国内外许多学者
对竹节参已做了大量的研究 ,对其皂苷成分及含量
的研究最早是在 20世纪 40年代日本开始的 ,我国
学者吴征镒 、蔡平等分别在 70年代中期 、80年代初
期对该项目进行了研究[ 1-3] 。在天然皂苷含量的测
定中 ,分光光度法是应用较普遍的一种定量方法 ,目
前常用的显色体系主要有:香草醛-冰醋酸-高氯
酸[ 4] , 香草醛-冰醋酸-硫酸[ 5] 和香草醛-乙醇-硫
酸[ 6] ,笔者将上述方法应用于黔产竹节参总皂苷测
定时 ,所购香草醛(分析纯 ,湘南试剂厂)与上述溶剂
系统的融合出现问题 ,不能很好溶解。理论上香草
醛溶于冰醋酸和甲醇 ,也能较好地溶于硫酸 ,但使用
硫酸作为溶剂在浓度较高时溶液呈现很深的颜色 ,
并有碳化现象发生。多次试验表明 ,硫酸-甲醇作为
混合溶剂 ,既能使香草醛溶解又能使溶液不呈现较
深的颜色 。故将香草醛-硫酸-甲醇显色体系用于竹
节参总皂苷测定 ,可获得较理想的效果 ,而此显色体
系用于竹节参总皂苷含量的测定目前尚未见文献报
道 。本文通过正交试验方法对香草醛-硫酸-甲醇法
的优化条件进行了研究 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 药材 药材为黔竹节参的地下茎 , 2007年
9月购于贵州织金县 ,经安顺学院化学系植物学博
士张来鉴定。人参皂苷 Rg1为对照品(中药固体制
剂制造技术国家工程研究中心提供)。
1.1.2 试验仪器及药品 主要设备:上海分析仪
器总厂 UV751GD 紫外/可见分光光度计;MET-
T LER TO LEDO 电子分析天平;江苏金坛市中大仪
器厂四孔恒温水浴锅。主要药品:无水甲醇(分析
纯 ,含量≥99.5%,天津市百世化工有限公司)、硫酸
(优级纯)、香草醛(分析纯 ,湘南试剂厂)。
1.2 试验方法
1.2.1 总皂苷的提取 称取一定量已粉碎的黔竹
节参粗粉样品 ,置于索氏提取器内 ,加入适量无水乙
　贵州农业科学　2010 , 38(3):39 ～ 41　Guizhou Ag ricultural Science s
醚水浴回流 24 h ,取出样品待乙醚挥发后 ,又转入索
氏提取器内 ,加入适量无水甲醇水浴回流 24 h 。再
将甲醇提取液减压回收溶剂至黏稠状 ,用少量蒸馏
水溶解后 ,移入分液漏斗内 ,先用石油醚萃取 6 ～ 8
次 ,然后再用水饱和正丁醇萃取 6 ～ 8次 。合并正丁
醇萃取液 ,减压回收正丁醇后 ,用少量甲醇溶解 ,倾
倒入 8 ～ 10倍量的丙酮中 ,有大量淡黄色或白色精
制总皂苷生成 ,减压过滤并抽干可得精制总皂苷粉
末。
1.2.2 溶液的配制
1)溶剂:无水甲醇和硫酸按体积 1∶2配制。
2)香草醛溶液:迅速准确称取香草醛 0.22 g
于滤纸上 ,立即转入 10mL 容量瓶内 ,迅速加入硫
酸-甲醇溶剂(1∶2),振荡使其溶解并定容至刻度 ,
所得溶液浓度为 2.2%。由于香草醛溶液稳定性较
差 ,故当日配制当日使用 。
3)对照品溶液的配制:取人参皂苷 Rg1 对照
品适量 ,精密称定为 21.1mg ,置于 10mL 烧杯内 ,
加入适量甲醇使其溶解 ,然后转移到 10mL 容量瓶
中并定容至刻度 ,摇匀 ,得浓度为 2.11mg/mL 的对
照品储备液。
4)供试品溶液的配制:精确称取黔产竹节参精
制总皂苷样品 100.8mg 置于 25mL 烧杯内加适量
甲醇使其溶解 ,然后转移到 25mL 容量瓶中并定容
至刻度 ,制得 4.032mg/mL 的测试液 ,摇匀 ,备用 。
1.2.3 测定波长的选择 分别精确吸取对照品溶
液和供试品溶液适量 ,置于两支 10mL 具塞试管
中 ,另取 2支 10mL 具塞试管 ,分别加入与对照品及
供试品溶液同量的甲醇 ,然后 ,向上述各试管中加入
2.2%的香草醛 0.30mL ,硫酸 1.50mL ,置于 38℃
的水浴中加热 15min ,取出冷却后 ,加硫酸-甲醇溶
剂稀释至 10.0mL ,摇匀 ,静置 1h 后 ,以甲醇试管作
空白 ,在波长为 480 ～ 510 nm 的范围内扫描。
1.2.4 显色反应优化条件的确定 取 5 支 10mL
具塞试管按Ⅰ ～ Ⅴ编号 ,准确量取供试品溶液和对
照品溶液 60.0μL 分别置于其中 ,分别考察香草醛
和硫酸溶液的用量 、反应时间及温度对待测样品吸
光度的影响。
1)香草醛溶液用量:各加入 2.2%香草醛溶液
0.10mL 、0.20mL 、0.30mL 、0.40mL 和 0.50mL ,
分次加入硫酸 1.50mL ,然后在 38℃的水浴中加热
15min ,取出冷却至室温 ,加硫酸-甲醇溶剂稀释至
10.0mL ,静置 1h后 ,测定其吸光度 。
2)硫酸用量:各加入 2.2%香草醛 0.30mL
后 ,分别加入硫酸 0.50mL 、1.00mL 、1.50mL 、
1.75mL和 2.00mL , 然后在 38℃的水浴中加热
15min ,取出冷却至室温 ,加硫酸-甲醇溶剂稀释至
10.0mL ,静置 1h后 ,测定其吸光度 。
3)反应温度:各加入 2.2%香草醛0.30mL ,分
别在 20℃、30℃、35℃、40℃和 45℃水浴中加热
15min ,取出冷却至室温 ,加硫酸-甲醇溶剂稀释至
10.0mL ,静置 1 h后 ,测定其吸光度 。
4)反应时间:各加入 2.2%香草醛0.30mL ,分
别在 38℃下水浴中加热 10min 、15min 、20min 、
25min和 30min ,取出冷却至室温 ,加硫酸-甲醇溶
剂稀释至 10.0mL ,静置 1h 后 ,测定其吸光度。
1.2.5 稳定性试验 在确定上述优化条件后 ,取 2
支试管编号后进行稳定性试验。在 0号试管中量取
60μL 甲醇溶液 ,在 2号试管中准确量取 60.0μL 供
试品溶液后 , 2 支试管内各加入 2.2%香草醛
0.30mL和硫酸 1.50mL , 放入 38℃水浴中加热
15min后 ,加硫酸-甲醇溶剂稀释至 6.0mL ,分别静
置 0min 、30min 、60min和 90min后 ,测定吸光度。
1.2.6 建立回归方程与样品测定 在上述优化条
件下 ,进行回归分析试验及样品含量测定 。
1)回归分析试验 。取 6支10mL 具塞试管 ,按
0 ～ 5 顺序编号后 , 分别准确量取 Rg1 标准溶液
20.0 、40.0 、60.0 、80.0 、100.0μL 置于 1 ～ 5号试管
中 ,另取 100.0μL 甲醇置于 1 号试管内作为空白 ,
各加入 2.2%香草醛 0.30mL 、硫酸 1.50mL ,放入
38℃水浴中加热 15m in 后 ,分别用硫酸-甲醇溶剂
稀释至 6.0mL ,静置 1 h后 ,测定其吸光度 。
2)样品测定。取 6支 10mL 具塞试管 ,按 0 ～ 5
顺序编号后 ,分别准确量取 60.0μL供试品溶液置于
1 ～ 5号试管中 ,并在5号试管中加入 10.0μL Rg1标
准溶液;另取60.0μL 甲醇置于 0号试管内作为空白 ,
其余操作按回归分析试验中的方式进行。
2 结果与分析
2.1 测定波长的确定
对测定波长进行的选择结果(表 1)显示 ,黔产
竹节参皂苷测试在香草醛-硫酸-甲醇显色体系中的
最大吸收波长是 496 nm ,与对照品溶液基本重叠。
故确定 496nm 为测定波长。
表 1 供试品(黔产竹节参)及对照品(人参皂苷 Rg1)吸光度-波长测定值
Table 1　The absorption deg ree of Panax j aponicus samples and CK(Rg1)by different waveleng ths
项目 组号Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ VI Ⅶ Ⅷ Ⅸ
供试品(黔产竹节参)
波长/nm 485 490 492 494 496 500 505 510 515
吸光度/A 0.635 0.690 0.693 0.697 0.701 0.697 0.672 0.627 0.572
对照品(人参皂苷 Rg1)
波长/nm 480 484 490 492 496 500 502 504 510
吸光度/A 0.703 0.788 0.848 0.866 0.863 0.821 0.796 0.767 0.659
·40· 　　　　　　　　　　　　 　　　　贵 州 农 业 科 学 2010 , 38 卷
表 2 黔产竹节参总皂苷含量测定显色反应优化条件
　　　　　　Table 2　Optimization of colorimetric reaction conditions fo r de te rmining to tal saponin content
in Panax japonicus produced in Guizhou
试管
编号
2.2%香草醛
体积/
mL
吸光度/A
供试品 对照品
硫酸
体积/
mL
吸光度/A
供试品 对照品
水浴温度
温度/
℃
吸光度/A
供试品 对照品
加热时间
时间/
min
吸光度/A
供试品 对照品
Ⅰ 0.10 0.171 0.545 0.50 0.080 0.210 20 0.041 0.115 10 0.247 0.708
Ⅱ 0.20 0.181 0.588 1.00 0.209 0.607 30 0.045 0.126 15 0.431 1.195
Ⅲ 0.30 0.215 0.618 1.50 0.201 0.589 35 0.052 0.148 20 0.408 1.107
Ⅳ 0.40 0.200 0.583 1.75 0.223 0.648 40 0.032 0.087 25 0.402 1.093
Ⅴ 0.50 0.114 0.583 2.00 0.190 0.556 45 0.045 0.120 30 0.409 1.145
表 3 在 1.5 h内供试品溶液的吸光度变化
　Table 3　The absorption deg ree of the tested sample
so lution a t differ ent determination times
组号 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
时间/min 0 30 60 90
吸光度/A 0.703 0.701 0.699　　 0.693
2.2 显色反应优化条件的确定
2.2.1 香草醛溶液用量对显色反应的影响 香草
醛溶液用量对显色反应试验结果(表 2)表明 ,当香
草醛用量为 0.30mL 时 ,供试品溶液和对照品溶液
吸光度较大 ,故香草醛的用量以 0.30mL 为宜 。
表 4 对照品溶液回归方程
Table 4　The reg ression equation o f CK solution
试管编号 Rg1 标准溶液体积/μL
标液浓度/
(μg/ 6mL) 吸光度/ A
1 0.0 0.000 0.000
2 20.0 42.200 0.198
3 40.0 84.400 0.407
4 60.0 126.600 0.602
5 80.0 168.800 0.775
6 100.0 211.000 1.009
回归方程式 A=0.0012+0.004716C
相关系数 r=0.9991
线性范围/(mg/m L) 0.007～ 0.035
表 5 黔产竹节参总皂苷样品测定结果与误差分析
Table 5 The dete rmination results of to tal saponin content in Panax japonicus samples and er ro r analy sis
试管
编号 溶液体积/μL
测试液吸
光度/ A
浓度/
(μg/ 6m L)
总皂苷
含量/ %
加标回
收率/ %
0 60.0(甲醇) 0.000 0.000 0.000 0.000
1 60.0(测试液) 0.502 106.190 43.890 99.470
2 60.0(测试液) 0.500 105.770 43.720 100.710
3 60.0(测试液) 0.503 106.400 43.980 98.850
4 60.0(测试液) 0.505 106.830 44.160 97.580
5 60.0(测试液)+10.0(Rg1 标准溶液) 0.661 139.910 33.900
平均 43.94 99.15
标准偏差(s) 0.172
置信区间(P=95%) 43.94±0.27
2.2.2 硫酸用量对显色反应的影响 硫酸加入后
Ⅰ ～ Ⅳ组的吸光光度随硫酸加入量增加而增加(表
2),但从第Ⅳ组起 ,随着硫酸浓度的增大 ,观察到空
白液的颜色较第 Ⅱ 、Ⅲ组明显加深。且第Ⅴ组存放
后有微小碳粒出现。故硫酸用量以 1.50mL为宜。
2.2.3 反应温度对显色反应的影响 由表 2 可
见 ,反应温度在 35℃时的吸光度最大 , 45℃时次之 ,
此外 ,当温度达到 40℃时 ,空白液颜色加深 ,肉眼难
以区分空白液和供试品溶液。表明 ,香草醛与硫酸
显色的副反应增强 ,将对结果产生较大的影响 ,故该
体系的反应温度以 35 ～ 40℃为宜 。
2.2.4 加热时间对显色反应的影响 从加热时间
对显色反应的影响(表 2)可见 , 当加热时间为
15min时 ,供试品溶液吸光度较大 ,故加热时间在
15min左右最佳 。20min以上吸光度基本趋于一个
稳定值。
2.3 稳定性试验
由表 3可见 ,显色反应完成以后的 60min ,供试
品溶液的吸光度变化幅度较小 ,基本稳定。平均值
为 0.699 , 标准偏差为 0.004 32 , 变异系数为
0.618%。
2.4 回归方程建立与样品测定
在上述优化条件下 ,进行回归分析试验及样品
含量测定。
2.4.1 回归分析试验 由表 4可见 ,在优化条件
下对照品有很好的线性回归 ,所得回归方程可靠。
说明该方法可用于竹节参总皂苷含量的测定。
2.4.2 黔产竹节参总皂苷样品测定 误差分析
(表 5)表明 ,将上述优化条件用于具体测定时可信
度较好其加标回收率平均值为 99.15%,在可信度
允许范围。
3 小结
1)研究结果表明 ,以硫酸-甲醇为溶剂 ,香草
醛-硫酸-甲醇为显色体系测定黔产竹节参总皂苷含
量时 ,其最佳测定条件是:以 496nm 为最大吸收波
长;香草醛浓度为(2.2±0.2)%、用量 0.30mL;硫
酸用量为 1.5mL;水浴温度在(38±2)℃,加热时间
15min 。
(下转第 45 页)
·41·　第 3 期 赵荣飞 等　黔产竹节参总皂苷含量测定条件的优化
表 6 不同时间活性炭脱色效果和多糖保留率
　　　Table 6　The decoloriza tion ra te and po ly saccharide reserv ed r ate of the crude polysaccha ride so lution treated by
ac tive carbon pow der unde r different time
时间/ min T ime
10 20 30 40 50 60
脱色率/ % 85.35 88.71 86.71 91.29 92.29 93.47
多糖保留率/ % 67.22 63.58 71.85 76.49 96.03 81.13
表 7　不同加入量 H 2O2脱色效果和多糖浓度
　　　　Table 7　The decoloriza tion ra te and po ly saccharide reserv ed r ate of the crude polysaccha ride so lution added
by diffe rent amount o f H2O 2
H 2O 2加入量/m L Adding amount o f H2O 2
5 10 20 40 0
脱色率/ % 31.650 55.250 68.300 78.550 0
总糖浓度(A400) 0.279 0.389 0.606 1.542 0.148
硫酸苯酚法颜色 黄色 浅黑 黑色 黑色 浅黄色
3 结论
试验结果表明 ,大孔树脂 S-8 和活性炭粉末脱
色效果多糖保留率最好。H 2O 2脱色虽然简单快捷 ,
但是多糖被氧化分解严重 ,脱色率不高 ,不建议采
用。采用 S-8 脱色的最佳条件是多糖浓度为 2%,
流速 0.75mL/min时脱色率为 97.44%,多糖保留
率为 85.27%。S-8再生先采用 70%乙醇在 pH3的
条件下洗脱 , 再分别用 0.5mol/L 的 N aOH 和
0.5mol/L的 HC l洗脱 ,蒸馏水洗至中性即可完成
再生 。活性炭脱色的最佳条件为脱色温度为 60℃,
在摇床上振荡 50min ,脱色率达 92.29%,多糖保留
率为 96.03%。工业上要求活性炭加入量不能大于
3%,因此本试验加入量采用 2%。因为酸性条件下
对多糖稳定性有影响 ,所以试验中不调 pH 值 。
[ 参 考 文 献]
[ 1 ] 周正贤.中国杜仲[ M] .贵阳:贵州科学出版社 , 1993.
[ 2] 江苏新医学院.中药大词典(上)[ M] .上海:上海科技
出版社 , 1997:1031.
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究[ J] .食品与发酵工业 , 2007 , 33(2):141-143.
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[ 6] 黄文书 , 杨海燕 ,李焕英.枸杞多糖的脱色工艺[ J] .食
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[ 7] 付学鹏 ,杨晓杰.植物多糖脱色技术的研究[ J] .食品
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多糖含量的研究[ J] .食品科学 , 2007 , 28(4):276-
278.
(责任编辑:聂克艳)
(上接第 41 页)
　　2)在测定黔产竹节参皂苷含量时 ,笔者考察了
香草醛-冰醋酸-高氯酸[ 4] 、香草醛-冰醋酸-硫酸[ 5] 和
香草醛-乙醇-硫酸[ 6] 3 种方法 ,结果表明 , 3种方法
均表现出溶解性差等缺点。香草醛-硫酸-甲醇体系
测定黔产竹节参皂苷含量时 ,具有样品溶解性好 ,测
定结果准确 、可靠 、重复性好。该方法是否适用于其
他产地竹节参皂苷及其他天然产物皂苷含量的测定
有待进一步研究 。
[ 参 考 文 献]
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(责任编辑:杨晓容)
·45·　第 3 期 龚桂珍 等　杜仲叶多糖脱色的研究