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滇龙胆根基因组ＤＮＡ
和可溶性总蛋白质的提取和检测
费 燕 秋　胡 恩 香①
（玉溪师范学院 资源环境学院，云南 玉溪６５３１００）
［关键词］滇龙胆；基因组ＤＮＡ；蛋白质；检测
［摘　要］运用ＣＴＡＢ法成功提取和检测出滇龙胆根中的基因组ＤＮＡ，该方法试验成本低、步
骤简单、易于操作，且提取的基因组ＤＮＡ纯度较高，其中的少量杂质则可以通过酚氯仿除去，因
此是适合滇龙胆基因组提取的一种有效方法．
［作者简介］费燕秋，本科，研究方向：生物化学与分子生物学．
［中图分类号］Ｑ７［文献标识码］Ａ［文章编号］１００９－９５０６（２０１３）０８－００６４－０４
滇龙胆（Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ），又名坚龙胆、小秦艽、蓝花根、炮仗花、苦草，为龙胆科龙胆属植物，是中
国特有物种［１］，也是常用的大宗药材，具有清热泻火、保肝、健脾和杀菌等功效［２］．滇龙胆为多年生草本植
物，主要分布在云南、贵州、四川和广西等地，多生长在海拔１　１００ｍ～３　０００ｍ的山坡草地、林下、灌木丛及
山谷中［３］．滇龙胆是龙胆泻肝汤、龙胆泻肝片、泻肝安神胶囊等１８０多种中成药的原料．近年来，由于滇龙
胆的市场需求量逐渐增加，野生资源已被大量破坏，急需解决滇龙胆的野生资源保护问题．而由于地域性
的原因，目前对滇龙胆的分子生物学研究较少．本研究对滇龙胆根中的基因组ＤＮＡ和可溶性总蛋白质进
行提取和检测，以期为滇龙胆的进一步研究提供参考．
１　材料与方法
１．１　植物材料
滇龙胆幼苗由云南省农业科学院药用植物研究所提供，幼苗带回后在花盆中使用腐殖土和黄土等体
积混合后进行栽培．试验前取滇龙胆幼苗新鲜幼嫩的根组织备用．
１．２　基因组ＤＮＡ的提取
采用ＣＴＡＢ法进行提取，具体步骤如下：
①使用高精度电子分析天平称取滇龙胆新鲜的根１００ｍｇ，放入预冷的研钵中，加入液氮充分研磨，并
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玉溪师范学院学报（第２９卷）２０１３年第８期　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｙｕｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｖｏｌ．２９Ｎｏ．８Ａｕｇ．２０１３
① 指导教师：张晓东，博士，研究方向：植物代谢基因工程．Ｅｍａｉｌ：ｚｘｄ９５＠１２６．ｃｏｍ．
将磨好的材料转入２ｍＬ的离心管中．其后，向离心管中加入９００μＬ预热到６５℃的２％ＣＴＡＢ缓冲液（Ｔｒｉｓ
－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１００ｍＭ，ＥＤＴＡ　２０ｍＭ，ＮａＣｌ　１．４Ｍ，ＣＴＡＢ　２％）及１０μＬβ－巯基乙醇，于６５℃水浴２０ｍｉｎ
后取出冷却．在水浴的过程中，需每隔２～３ｍｉｎ上下颠倒轻轻混匀一次．
②加入５００μＬ氯仿－异戊醇（ｖ／ｖ＝２４：１）混合液，上下颠倒混匀，于室温下７　５００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ后
转移上清液至新的１．５ｍＬ离心管中．再次加入氯仿－异戊醇５００μＬ，充分摇匀，在室温下、７　５００ｒｐｍ离心
１０ｍｉｎ，将上清液转移到新的离心管中，加入１／１０体积３Ｍ醋酸钠（ｐＨ５．２）和等体积异丙醇，混匀，在４℃、
１２　０００ｒｐｍ下离心２０ｍｉｎ．弃上清液，用７５％乙醇清洗两次后，干燥，用含 ＲＮａｓｅ的１×ＴＥ（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）１０ｍＭ，ＥＤＴＡ　１ｍＭ）溶解后，３７℃水浴３０ｍｉｎ．
③取提取的ＤＮＡ样品５μＬ进行电泳，剩余的置于－２０℃冰箱保存．
１．３　基因组ＤＮＡ的检测
①琼脂糖凝胶的制备：称取０．１６ｇ琼脂糖粉，加入电泳缓冲液１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ－醋酸４０ｍＭ，ＥＤＴＡ
２．５ｍＭ）２０ｍＬ，微波炉加热溶解，待溶胶冷却至６０℃后，加入３μＬ花菁核酸染料（厦门百维信公司），摇
匀，倒入装配好梳子的胶槽内．
②上样：取上述基因组ＤＮＡ样品５μＬ，加入１／６体积的６×ＤＮＡ　Ｌｏｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ＳＤＳ　１％，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ
５０％，Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ　Ｂｌｕｅ　０．０５％），再加入１×ＴＡＥ　Ｂｕｆｆｅｒ，使体系总体积至２０μＬ，然后使用枪头吸打混匀
后上样．
③电泳：电压设定为为５Ｖ／ｃｍ，根据前端的溴酚蓝和后端的二甲基苯氰指示剂，当溴酚蓝指示剂到达
琼脂糖凝胶长度的１／２处时停止电泳，置于凝胶成像系统中，观查结果并进行拍照．
１．４　可溶性总蛋白质的提取
①使用电子天平称量新鲜的滇龙胆根１．０００　０ｇ，放入预冷的研钵中，使用液氮充分研磨，直至成粉末
状，再向研钵中加入提取液，再次充分研磨至水状．
②在４℃下、１２　０００ｒｐｍ离心２０ｍｉｎ．
③将上清液液转移至新的离心管中，加入５×ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｇｌｙｃｉｎｅ　３９ｍＭ，Ｔｒｉｓ　４８ｍＭ，ＳＤＳ
０．０３７％）．沸水浴处理１０ｍｉｎ．
④取蛋白提取液３０μＬ进行上样，其余的置于－２０℃冰箱保存．
１．５　可溶性总蛋白质的检测
①聚丙烯酰胺凝胶的制备．使用７５％酒精清洗玻璃胶板，组装电泳装置．按以下配方制备分离胶和浓
缩胶，１２％ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ（１０ｍＬ）：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ（４．２５ｍＬ），Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｂ（２．７ｍＬ），ｄｄＨ２Ｏ（３ｍＬ），ＡＰＳ（１２５μＬ），
ＴＥＭＥＤ（６．５μＬ）；４％ｓｔａｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ（３．３３ｍＬ）：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ（０．５３ｍＬ），Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｃ（０．８８ｍＬ），ｄｄＨ２Ｏ（２ｍＬ），
ＡＰＳ（４５μＬ），ＴＥＭＥＤ（６μＬ）．
②向组装好的制胶器中灌胶，然后小心用正丁醇或异丙醇覆盖，以除气泡；０．５～１ｈ胶凝固后，倒掉异
丁醇，水冲洗，滤纸吸干．
③按表１制备浓缩胶，倒胶，插上梳子，保证浓缩胶厚度（梳子底端与分离胶的间距）达到５ｍｍ．
④待浓缩胶完全凝固后，拔去梳子，装入电泳槽．
⑤电泳：浓缩胶使用６０Ｖ，分离胶使用８０Ｖ，等到溴酚蓝完全跑出凝胶后，停止电泳，取出玻璃板．
１．６　凝胶的染色、脱色和拍照
①用塑料板撬开凝胶两侧的玻璃板，切除浓缩胶，用水冲下分离胶，置于固定液ＴＣＡ中，常温摇床固
定３０ｍｉｎ．
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费燕秋　胡恩香：滇龙胆根基因组ＤＮＡ和可溶性总蛋白质的提取和检测
②回收固定液，常温下用至少５倍体积的考马斯亮蓝染色液、摇床４０ｒｐｍ染色１ｈ．
③回收染色液，加脱色液，常温下摇床４０ｒｐｍ脱色至蛋白条带清晰可见．
④回收脱色液，加入ｄｄＨ２Ｏ，常温继续脱色或保存．
④对脱完色后的凝胶进行照相，或者加入去离子水保存于４℃冰箱中．
２　结果与分析
２．１　滇龙胆根基因组ＤＮＡ提取和检测
使用ＣＴＡＢ法提取滇龙胆根基因组后，使用０．８％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图１．图１中，
在第１泳道可以看到清晰的、浓度较高的滇龙胆根基因组ＤＮＡ条带，第２、３泳道的负对照由于不含ＤＮＡ
样品而未显示条带，第４泳道菠菜基因组ＤＮＡ正对照也显示出较清晰的牛角条带．
图１下方有隐约的条带，是未被完全消化的ＲＮＡ，这可能是因为在试验过程中，ＲＮａｓｅ　Ａ加入后处理
时间较短（１０ｍｉｎ）引起的．此外，四个上样孔内有白亮的区域，这是因为在试验过程中，作者将花菁核酸染
料加入ＤＮＡ上样缓冲液所致，或者也有可能是由未除净的杂蛋白引起的．
图１　滇龙胆根基因组ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳结果　　　　　图２　滇龙胆根可溶性总蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳结果
２．２　可溶性总蛋白的提取和检测
通过ＰＶＰＰ法提取滇龙胆根可溶性总蛋白后，使用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳进行分离，经固定、染色、脱色
后，得到的结果如图２．图２中，１为正对照滇龙胆叶片可溶性总蛋白；２为蛋白质标准分子量（Ｃｏｄｅ：Ｄ５３１，
Ｔａｋａｒａ）；３和４为滇龙胆根可溶性总蛋白．从图２看，滇龙胆根中可溶性总蛋白显示出几ｋＤａ到１１６ｋＤａ
粗细不同的很多条带，其中最显著的特征是，在９７．２ｋＤａ附近有一条最粗的条带，它可能代表该时期根中
大量表达的蛋白．正对照在该处也显示出一条较粗的条带，它可能与根中的相同或不同．总体上，与龙胆叶
可溶性总蛋白相比，根中的颜色浅，且条带存在很多差异．这可能是因为根和叶的结构不同，因此其代谢活
动也不同，如叶片中存在叶绿体，进行光合作用，光合作用相关的蛋白是叶片特有的．
３　讨　论
滇龙胆是云南省道地药材，也是龙胆科植物中的主要入药物种，但是由于经济利益的驱使，野生滇龙
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玉溪师范学院学报
胆资源遭到严重破坏，保护滇龙胆野生资源的工作已刻不容缓．而对滇龙胆的有效成分及其生物合成途径
进行深入研究，并采用基因工程的手段生产市场上需要的龙胆苦苷等有效成分，可极大地缓解对野生滇龙
胆资源的破坏，是解决该问题的“治本”之策．
基因组ＤＮＡ是分子生物学研究的基础，而足量的高纯度基因组ＤＮＡ是开展ＤＮＡ相关研究的必要
条件．对于基因组学研究而言，稳定、快速和便捷的ＤＮＡ提取方法具有十分重要的意义［４］．同时，基因组
ＤＮＡ的提取是基因组测序、目的基因ＯＲＦ序列和启动子序列扩增、基因组拷贝数分析、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等
研究的前提．随着人类、秀丽新线虫、酵母、拟南芥、玉米、水稻、苹果、梨、番茄和烟草等基因组测序的完成，
转录组和蛋白质组学已成为后基因组时代研究的重要手段．而不同物种的蛋白质提取和检测方法又是进
行蛋白质研究的基础．基于此，本研究分别采用ＣＴＡＢ法和ＰＶＰＰ法对龙胆根基因组ＤＮＡ和可溶性总蛋
白进行了提取与检测，以期为对滇龙胆的分子生物学研究提供参考．
在本研究中，我们运用ＣＴＡＢ法成功提取和检测出滇龙胆根中的基因组ＤＮＡ，该方法具有试验成本
低、步骤简单、易于操作等优点，且提取的基因组ＤＮＡ纯度较高，其中的少量杂质则可以通过酚氯仿除
去，因此是适合滇龙胆基因组提取的一种有效方法．研究过程中，我们还运用ＰＶＰＰ法成功提取和检测出
滇龙胆根中的可溶性总蛋白，且获得的可溶性总蛋白具有很多清晰的条带．以上研究为下一步进行滇龙胆
中重要基因序列的克隆和相关蛋白的测序工作也奠定了一定的基础．
参考文献：
［１］朱卫萍，赵磊，张国华，等．栽培滇龙胆的化学成分研究［Ｊ］．云南中医学院学报，２０１０，（５）：８－１２＋１６．
［２］李智敏，刘莉，李婉谊，等．滇龙胆的药用资源研究与开发进展［Ｊ］．云南大学学报（自然科学版），２００９，３１（ｓ１）：４８５－
４８７．
［３］杨雁，邵爱娟，金航，等．云贵高原滇龙胆不同居群形态特征变异研究［Ｊ］．中草药，２０１２，４３（８）：１６０４－１６１０．
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ
ａｎｄ　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｒｏｏｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａ
ＦＥＩ　Ｙａｎｑｉｕ　ＨＵ　Ｅｎｘｉａｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｙｕｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｕｘｉ，Ｙｕｎｎａｎ　６５３１００，Ｃｈｉｎａ）
Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ；ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｂｏｔｈ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　ＣＴＡＢ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｆ　Ｇｅｎｔｉａｎａ　ｒｉｇｅｓｃｅｎｓ　ｂｅｃａｕｓｅ　ｉｔ　ｈａｓ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｌｏｗ　ｃｏｓｔ，ｓｉｍｐｌｅ　ｏｐｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔ
ｗｉｔｈ　ｓｍａｌ　ａｍｏｕｎｔ　ｏｆ　ｉｍｐｕｒｉｔｙ　ｒｅｍｏｖｅｄ　ｂｙ　Ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ
收稿日期：２０１３年４月１１日
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费燕秋　胡恩香：滇龙胆根基因组ＤＮＡ和可溶性总蛋白质的提取和检测