全 文 ：水蔓菁滴丸中总黄酮和木犀草素的含量测定
刁海鹏， 杜 艳， 丁 红* ， 孙体健
(山西医科大学，山西 太原 030001)
收稿日期:2009-11-30
基金项目:山西医科大学大学生创新基金资助项目(2007077)
作者简介:刁海鹏(1976 －)，男，讲师，硕士，研究方向:药物新剂型、植物有效成分的提取及应用。Tel:13513649581 E-mail:diaohaip@ 163.
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* 通讯作者:丁 红(1949 －)，女，教授，研究方向:药物新剂型、植物有效成分的提取及应用。Tel:(0351)4690137 E-mail:qdh26@ sohu.
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关键词:水蔓菁滴丸;高效液相色谱法;总黄酮;木犀草素
摘要:目的:本实验对水蔓菁滴丸中总黄酮和木犀草素含量测定方法进行了研究，使其能够对水蔓菁滴丸质量进行控制。
方法:利用分光光度法对水蔓菁滴丸中总黄酮进行含量测定;采用质谱法、薄层色谱法、高效液相法确定水蔓菁滴丸的水
解产物中的化学成分。采用高效液相色谱法对水蔓菁滴丸中的木犀草素进行含量测定。结果:测得水蔓菁止咳滴丸中
每丸含总黄酮为 6. 17%;测得水蔓菁滴丸每丸含木犀草素为 0. 22%。结论:本实验测定方法合理、准确、方便可行，可以
为该药制定质量标准作为参考。
中图分类号:R927. 2 文献标识码:B 文章编号:1001-1528(2010)07-1263-03
水蔓菁为玄参科细叶婆婆纳属水蔓菁(Veronica linari-
ifolia)，具有清热解毒、利尿、止咳化痰等作用［1］。主要化学
成分为芹黄素、木犀草素苷等黄酮类化合物［2］，现已有用水
蔓菁制成的片剂，临床用于治疗慢性气管炎、肺化脓症、咳吐
脓血、急性肾炎、尿路感染等疾病［3］。但是片剂存在服用量
大，生物利用度低等问题。为满足临床用药的需要，本课题
组提取出水蔓菁的有效部位，制备成滴丸(制备方法另文撰
述)。本实验对水蔓菁滴丸中总黄酮和木犀草素含量测定方
法进行了研究，以希望用总黄酮含量和木犀草素含量对水蔓
菁滴丸质量进行控制并为该药制定质量标准提供参考。
1 仪器与试药
仪器:LC-20A 高效液相色谱仪 (日本岛津);质谱仪:
Quattro Premier Waters—2659(美国 Waters 公司);紫外分光
光度计(上海菁华仪器);760CRT双光束紫外-可见分光光度
计(上海精密分析仪器厂);FA1004 电子天平(上海分析天
平仪器厂);真空干燥箱(DEG-402 型天津天宇技术实业有
限公司)。
试药:乙腈为色谱纯试剂;磷酸、氯仿、甲醇、甲酸、三氯
化铝、醋酸钾均为分析纯;芦丁对照品(中国药品生物制品检
定所 批号:1521-200401);木犀草素对照品(中国药品生物
制品检定所 批号:1477-200418);水蔓菁药材，经山西省药检
所鉴定为细叶婆婆纳属水蔓菁，产自山西省万荣县。
2 方法与结果
2. 1 可见分光光度法测定水蔓菁滴丸中总黄酮含量［4，5］
2. 1. 1 供试品溶液的配制
对照品溶液的制备:精密称取在 120 ℃减压干燥至恒重
的芦丁对照品 3. 1 mg，置 50 mL 量瓶中，加适量 60%乙醇，
超声使之溶解，再用 60%乙醇稀释至刻度，得对照品溶液
(0. 062 mg /mL)。
样品溶液的制备:取水蔓菁滴丸 15 粒，研细，过 80 目
筛，精密称取滴丸粉末 0. 05 g，置 25 mL量瓶中，加 60%乙醇
适量，超声使之溶解，加 60%乙醇至刻度并摇匀。精密量取
1 mL，置 10 mL量瓶中，用 60%乙醇稀释至刻度，摇匀即得。
2. 1. 2 测定波长的选择
精密吸取样品溶液及对照品溶液各 1. 0 mL，分别置 10
mL量瓶中，0. 1 mol /L AlCl3 溶液 2 mL，0. 1 mol /L KAc溶液
3 mL，再加 60%乙醇至刻度，放置 30 min。在 200 nm ～ 500
nm范围内扫描得测定波长为 410 nm。
2. 1. 3 标准曲线的制定
分别精密吸取芦丁对照品溶液 0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0
mL，置 10 mL量瓶中，各加 0. 1 mol /L AlCl3 溶液 2 mL，0. 1
mol /L KAc溶液 3 mL，再加 60%乙醇至刻度，摇匀，放置 30
min，在 410 nm处测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，以
浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y = 0. 034 9X
－ 0. 000 5，r = 0. 999 9，表明芦丁浓度在 3. 1 ～ 24. 8 μg /mL
范围内呈良好线性关系。
2. 1. 4 显色稳定性考察
量取芦丁对照品液 2 mL，按 2. 1. 3 项下方法，显色 10
min后，每隔 5 min测其吸光度值。结果表明，前 20 min吸收
度增大速度快，30 ～ 40 min吸光度稳定。故确定显色时间为
30 min。
2. 1. 5 精密度考察
取芦丁对照品溶液，按 2. 1. 3 项下方法，重复进行 5 次
试验，结果表明，RSD为 0. 32%，仪器精密度良好。
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2. 1. 6 重复性考察
精密称取同一批水蔓菁滴丸，按样品溶液的制备方法，
平行制备 6 份供试品溶液，按 2. 1. 3 项下方法进行试验，结
果表明，RSD为 1. 1%，本方法重复性良好。
2. 1. 7 回收率试验
取已知总黄酮含量的水蔓菁滴丸，分别加入高、中、低剂
量的芦丁对照品，按样品溶液的方法制备供试液，测定总黄
酮含量，计算回收率，结果见表 1。
表 1 水蔓菁滴丸加样回收率试验结果(n =3)
样品
号
样品量
/mg
加入量
/mg
测得量
/mg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
3. 00 2. 52 5. 50 99. 12
1 3. 00 2. 45 5. 42 98. 63 99. 2 0. 7
3. 00 2. 49 5. 49 99. 93
3. 00 3. 05 6. 06 100. 32
2 3. 00 2. 97 6. 00 101. 02 100. 3 0. 7
3. 00 3. 11 6. 10 99. 65
3. 00 3. 49 6. 50 100. 21
3 3. 00 3. 64 6. 62 99. 45 100. 0 0. 5
3. 00 3. 66 6. 67 100. 33
结果表明:水蔓菁滴丸回收率符合方法学要求，方法准
确可行。
2. 1. 8 水蔓菁滴丸总黄酮含量测定
分别取 3 批滴丸各 15 粒，研细，称取滴丸粉末约 0. 05 g
各 3 份，精密称定，按 2. 1. 1 项下方法制备样品溶液，同
2. 1. 3 项下操作，得水蔓菁滴丸中总黄酮平均含量为:
6. 17% ± 0. 3%。
2. 2 样品水解成分结构鉴定
经试验发现制备的水蔓菁滴丸中目前没有可用于高效
液相法进行含量测定的特征性成分。但其含有木犀草素苷，
经试验发现其水解产物中含有木犀草素。
根据对水解时间，所加水解溶剂的体积、浓度等方面的
考察［6］，最终确定水解条件为，精密称取 0. 5 g 水蔓菁滴丸
粉末，置 50 mL锥形瓶中，精密加入 15 mL的 2. 5 mol /L的盐
酸甲醇液，水解 1 h，放冷后补足重量，过滤，取滤液 0. 2 mL，
置 50 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。对水解液分
别进行质谱法、薄层色谱法及高效液相法进行结构鉴定。
2. 2. 1 质谱法进行样品水解成分结构鉴定［7，8］
从图 1 ～ 4 可知木犀草素对照品与水解样品中结构一
致。木犀草素对照品碎片中含有 285. 13 的峰，变换电压后，
有 285. 13、133. 08 两个峰;而水解样品中，相应的有 285. 07
的峰，变换电压后有 285. 29 和 132. 98 两个峰，与木犀草素
对照品相对应，初步确定水解样品中含有木犀草素成分。
图 1 木犀草素对照品质谱图 1
图 2 木犀草素对照品质谱图 2
图 3 水蔓菁滴丸水解样品质谱图 1
图 4 水蔓菁滴丸水解样品质谱图 2
2. 2. 2 硅胶薄层鉴别
取木犀草素对照品加甲醇制成每 1 mL 含 0. 1 mg 的溶
液作为对照品溶液 1。取水蔓菁滴丸的甲醇溶液，作为供试
液 2。取水蔓菁滴丸水解液两份，浓缩，用甲醇溶解作为供
试液 3，4。吸取上述溶液各 5 μL，分别点样于同一硅胶 G薄
层板上，以 CHCl3-甲醇-甲酸(20 ∶ 4 ∶ 0. 8)为展开剂，置预饱
和 15 min的展开缸内，展开，取出，晾干，喷三氯化铝试液，
置紫外光灯(365 nm)下检视发现［9］，供试液 3 和 4 斑点中，
在与对照品相同比移值位置上显相同颜色的荧光斑点，而供
试品 2 在与对照品色谱相应位置上，无荧光斑点，说明水蔓
菁水解液中存在木犀草素。
2. 2. 3 高效液相法对水解产物进行定性鉴别
用反相高效液相法对水解产物进行定性鉴别后，发现对
照品与水解产物在9. 8min均有保留峰出现(见图5、图6)。
图 5 木犀草素对照品 HPLC色谱图
图 6 水蔓菁滴丸 HPLC图
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说明水解样品中含有木犀草素。
2. 3 HPLC法测定水蔓菁滴丸中木犀草素含量［10］
2. 3. 1 色谱条件
色谱柱:C18(5 μm，4. 6 mm × 250 mm)(迪马公司);测
定波长:350 nm;流动相:乙腈-0. 4%磷酸(30 ∶ 70);流速:
1. 0 mL /min;柱温:23 ℃。
2. 3. 2 对照品和供试品溶液的制备
对照品溶液的制备:精密称取木犀草素对照品约 1. 6
mg，置于 50 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀。制成木
犀草素浓度为 32 μg /mL的对照品溶液。
供试品溶液:精密称取 0. 5 g 水蔓菁滴丸粉末，置于 50
mL锥形瓶中，精密加入 15 mL的 2. 5 mol /L的盐酸甲醇液，
水解 1 h，放冷后补足重量，过滤，取滤液 0. 2 mL，置 50 mL
量瓶，用甲醇定容，摇匀，即得。
2. 3. 3 标准曲线的制定
分别精密量取木犀草素对照品溶液 0. 1、0. 5、1. 0、1. 5、
2. 0 mL分别置 10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，吸取上述
溶液各 20 μL进样，以峰面积(Y)对进样量(X)进行回归计
算，得标准曲线方程:Y = 2 863 820. 99X － 7 169. 2，r =
0. 999 4，试验结果表明:木犀草素在 3. 2 ～ 64 μg /mL范围内
呈良好线性关系。
2. 3. 4 稳定性试验
取供试品溶液，分别在 0、2、4、6、8 h进样 20 μL，测得样
品中木犀草素峰面积值，结果表明:供试品溶液 3 ～ 8 h内稳
定性良好。
2. 3. 5 精密度试验
精密量取同一份木犀草素对照品溶液 20 μL，重复进样
6 次，木犀草素峰面积的 RSD为 0. 6%。
2. 3. 6 重复性试验
精密称取同一批水蔓菁滴丸 6 份，按 2. 3. 2 项下供试品
溶液的制备方法，平行制备 6 份供试液，分别进样 20 μL，
RSD值为 0. 6%。
2. 3. 7 回收率试验
取已知木犀草素含量的滴丸约 1. 5 g，精密称定，置 50
mL锥形瓶中，按 2. 3. 2 项下供试品溶液制备方法，制备供试
液后，分别加入木犀草素对照品溶液。分别进样 20 μL，计
算回收率，结果见表 2。
2. 3. 8 样品含量测定
精密称取水蔓菁滴丸粉末0 . 5g3份，按2 . 3 . 2项操作，
表 2 水蔓菁滴丸加样回收率试验结果(n =3)
序号
样品量
/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均回收
率 /%
RSD
/%
1. 36 1. 09 2. 44 99. 08
1 1. 36 1. 14 2. 50 100. 00 99. 39 0. 53
1. 36 1. 11 2. 46 99. 10
1. 36 1. 40 2. 75 99. 29
2 1. 36 1. 35 2. 70 99. 26 99. 52 0. 42
1. 36 1. 44 2. 80 100. 00
1. 36 1. 64 3. 00 100. 61
3 1. 36 1. 70 3. 05 99. 41 99. 80 0. 70
1. 36 1. 62 2. 97 99. 38
制备供试品溶液，进行含量测定，结果水蔓菁滴丸中木犀草
素的含量为 0. 22% ± 0. 02%。
3 讨论
本实验利用可见分光光度法和 HPLC 法建立了水蔓菁
滴丸总黄酮和木犀草素含量的测定方法，该测定方法合理、
准确、方便可行，可以为该药制定质量标准提供参考，并为该
药的进一步应用奠定基础。
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