全 文 ：J Surg Concepts Pract 2010, Vol.15, No.3
随着工业化的进程和人口老龄化的发展，以动
脉硬化闭塞症（atherosclerosis obliterans, ASO）为主
的缺血性疾病的发病率正逐年增加，已成为危害人
类健康的重要疾病之一。 较为积极有效的治疗方
法是重建狭窄或闭塞的动脉， 但 40%～60%的病人
在术后 3～6 个月可因内膜增生再狭窄导致手术失
败[1]。因此，再狭窄的防治一直是血管外科领域研究
的热点和难点。
动脉术后再狭窄的防治相当棘手，现阶段尚无
有效手段。目前临床防治内膜增生的常用药物以西
药为主，相当一部分为进口药物，费用昂贵。中医药
是我国传统医学的瑰宝，我们希望利用已有的宝贵
资源，探索中药防治动脉再狭窄的可行性。 葛根对
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）有保护作用 [2]，
并具有扩血管和解除血管平滑肌细胞 （vascular
smooth muscle cells, VSMCs）痉挛的作用；西红花可
活血通络[3]；毛冬青能清热解毒和活血通脉。鉴于这
3 味中药在血管及血液学方面独特的药理特性，为
·论著·
复方冬红合剂对血管平滑肌细胞作用的实验研究
邱结华， 黄 英， 李维敏， 陆信武， 黄新天， 陆 民， 蒋米尔
（上海交通大学医学院附属第九人民医院血管外科 上海交通大学血管病诊治中心，上海 200011）
[摘要] 目的：探讨复方冬红合剂对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）的作用。 方法：分别用
稀释度为 1∶800～1∶200 的复方冬红合剂培养液孵育兔主动脉的 VSMCs；用 MTT 法检测 VSMCs 的增殖，以划痕实验
检测其移行状态；用 PI-Annexin Ⅴ双标记及 caspase-3 检测细胞的凋亡状态，并与正常对照组作比较。 结果：①复方
冬红合剂可抑制 VSMCs 增殖，其抑制作用随稀释度降低而增强，并在稀释度为 1∶200 时最为显著（P<0.05）；②复方
冬红合剂可抑制 VSMCs 移行，其抑制作用也随稀释度降低而增强，并在稀释度为 1∶200 时最显著（P<0.05）；③复方
冬红合剂并不导致 VSMCs 凋亡。 结论：复方冬红合剂可能通过抑制 VSMCs 的增殖和移行，而并非经调节其细胞凋
亡，来发挥抑制内膜增生的作用。
关键词：复方冬红合剂； 血管平滑肌细胞； 增殖； 移行； 细胞凋亡
中图分类号：R331.3+6 文献识别码：A 文章编号：1007-9610（2010）03-0278-05
Experimental study on the effects of “Fu Fang Dong Hong He Ji” on the vascular smooth muscle cells QIU Jie-
hua, HUANG Ying, LI Wei-min, LU Xin-wu, HUANG Xin-tian, LU Min, JIANG Mi-er. Department of Vascular Surgery,
Shanghai Ninth Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Vascular Center, Shanghai Jiao Tong
University, Shanghai 200011, China
[Abstract] Objective To investigate the effects of “Fu Fang Dong Hong He Ji” on the vascular smooth muscle
cells (VSMCs). Methods Rabbit aortic VSMCs were co-cultured with DMEM which contained “Fu Fang Dong Hong He
Ji” at dilutions ranged from 1∶800 to 1∶200. VSMCs’ status of proliferation and status of migration were detected by MTT
and scratch assay, respectively; and their status of apoptosis was detected by PI-Annexin V double-marker using flow
cytometry and the expression of primary and activated caspase-3 by means of Western blot analyses at different intervals.
All results were compared to that of the normal controls. Results ① “Fu Fang Dong Hong He Ji” was shown to have
inhibited VSMCs proliferation, and this effect was enhanced while lowering the dilution rate of this mixture, and achieved
a peak level at a dilution rate of 1:200 (P<0.05). ② “Fu Fang Dong Hong He Ji” was also shown to have inhibited
VSMCs’ status of migration, and the effect was also enhanced while lowering the dilution rate of the mixture, and achieved
a peak level at a dilution rate of 1:200 (P<0.05). ③ “Fu Fang Dong Hong He Ji” did not induce apoptosis in the VSMCs.
Conclusions “Fu Fang Dong Hong He Ji” shows its effects of reducing intimal hyperplasia through inhibiting VSMCs
proliferation and migration, while avoids inducing apoptosis in the VSMCs.
Key words: “Fu Fang Dong Hong He Ji”; Vascular smooth muscle cells (VSMCs); Proliferation; Migration;
Apoptosis
基金项目：上海市浦江人才计划基金项目；上海市科委基金
项目（074119619）
通讯作者：黄 英，E-mail: yvhuang77@yahoo.com
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DOI:10.16139/j.1007-9610.2010.03.002
外科理论与实践 2010 年第 15 卷第 3 期
避免长期使用单剂可能对机体造成的损害，经前期
研究，我们将此 3 味中药按不同配比制成复方冬红
合剂，并通过兔髂动脉再狭窄模型证实其安全性和
有效性[4]。 复方冬红合剂防治内膜增生的作用机制
尚不明了， 鉴于 VSMCs 的增殖和移行在再狭窄发
生、发展中的重要作用，拟通过研究复方冬红合剂
对 VSMCs 的作用， 以阐明此合剂防治动脉再狭窄
的可能作用机制。
材料与方法
一、材料
实验动物：新西兰大白兔 2 只（上海宝牧实验
动物养殖场），雌雄不限，体重(1.5±0.5) kg，用于主
动脉取材 VSMCs培养。
主要试剂和器材：复方冬红合剂（上海交通大
学医学院附属第九人民医院院内制剂 ， 批号
090702， 批件号 YL05005）、DMEM 培养液 （美国
Hyclone 公司）、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）
（美国 Gibco公司）、α-肌动蛋白（α-actin）抗体（英国
Abcam 公司）、 全长及活化 caspase-3 抗体 （美国
Santa Cruz 公司）、 辣根过氧化物酶标记羊抗兔/鼠
二抗（美国 Santa Cruz 公司）、PI-Annexin Ⅴ（美国
BD 公司 ）、 甲基噻唑基四唑 （methyl thiazolyl
tetrazolium, MTT）（美国 Sigma 公司）、二甲基亚砜
（dimethyl sulfoxide, DMSO）（上海生工）、十二烷基
磺酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）（上海生工）；
倒置相差显微镜（美国 Beckman公司）；图像处理软
件（美国 Image-Pro Plus 公司）；酶标仪（Safire 2 型,
美国 Tecan 公司）、流式细胞仪（FACScabilur 型, 美
国 BD 公司）、荧光图像分析仪（LAS-4000 型, 中国
富士公司）等。
二、方法
1. 兔主动脉 VSMCs 原代培养及鉴定：组织块
贴壁法原代培养兔主动脉 VSMCs，用含 20%FBS的
DMEM培养液培养，待细胞基本融合后传代并改用
含 10%FBS的 DMEM培养液。 取第 3代 VSMCs细
胞爬片行 α-肌动蛋白免疫组化检测， 取阳性率>
95%的 VSMCs用于进一步实验研究。
2. MTT 法检测 VSMCs 增殖：调整 VSMCs 密度
至 2×104/mL，种植于 96 孔板，每孔 0.1 mL，5 个复
孔，过夜后去培养液，分别加入不含复方冬红合剂
培养液（正常对照组）及按体积比稀释度为 1∶800、
1∶600、1∶400 和 1∶200 的含复方冬红合剂的培养液，
于孵育 12、24 和 48 h 后， 用 MTT 法检测 VSMCs
增殖，酶标仪 490 nm波长检测光密度（OD）值。
3. 划痕实验检测 VSMCs 移行：6 孔板培养细
胞，待 VSMCs 融合至 80%～90%后，用 200 μL 枪头
在培养皿中央及距其两旁 0.5 cm 处划 3 条水平直
线，洗尽划痕内的 VSMCs[5]，再分别加入不含复方冬
红合剂以及不同稀释度的含复方冬红合剂的培养
液，于孵育 12 和 24 h 后，用倒置相差显微镜观察
VSMCs移行， 用图像处理软件计算 VSMCs 在划痕
内的移行距离。
4. 细胞凋亡检测
（1）流式细胞仪 PI-Annexin Ⅴ双标记检测细胞
凋亡：12 孔板培养细胞， 待 VSMCs 融合至 80%左
右，再分别加入不含复方冬红合剂及不同稀释度的
含复方冬红合剂的培养液， 孵育 24 和 48 h 后，胰
酶消化呈单个细胞，行 PI-Annexin Ⅴ双标记，流式
细胞仪检测细胞凋亡。
（2）Western 印迹检测细胞凋亡相关蛋白
caspase-3：收集分别用不含复方冬红合剂及不同稀
释度的含复方冬红合剂的培养液孵育 24 和 48 h
的 VSMCs，Bradford 法蛋白定量，12% SDS-聚丙烯
酰胺凝胶电泳， 再分别用全长 caspase-3 抗体和活
化 caspase-3 抗体进行 Western 印迹检测相对应蛋
白的表达。 活化 caspase-3可检测早期细胞凋亡。
三、统计学分析
所有计量资料均采用平均值±标准差表示，t 检
验进行统计分析，采用 SPSS 10.0 统计分析软件包，
P<0.05表示存在统计学差异。
结 果
一、MTT法检测 VSMCs增殖
复方冬红合剂对 VSMCs 增殖有一定的抑制作
用，其抑制作用随稀释度降低而增高，并在稀释度
为 1∶200 时最为明显；而当稀释度相同时，此合剂
对 VSMCs 增殖的抑制作用则随作用时间的延长而
增强。 与正常对照组相比，复方冬红合剂与 VSMCs
共同孵育 12 h 后，稀释度为 1∶400 和 1∶200 的复方
冬红合剂组均可显著抑制 VSMCs 增殖 （P<0.05），
而稀释度为 1∶800 和 1∶600 时，其抑制 VSMCs 增殖
的作用不明显（P>0.05）；共同孵育 24 h 后，稀释度
为 1∶600、1∶400 和 1∶200 的复方冬红合剂组均可显
著抑制 VSMCs增殖（P<0.05），但稀释度为 1∶800时，
其抑制 VSMCs 增殖的作用仍不明显 （P>0.05）；共
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同孵育 48 h 后， 各稀释度组均能显著抑制 VSMCs
增殖（P<0.05）（见图 1）。
二、划痕实验检测 VSMCs 移行
复方冬红合剂对 VSMCs 移行有一定的抑制作
用，其抑制作用随稀释度降低而增强，并在稀释度
为 1∶200 时最为明显。 与正常对照组相比，稀释度
为 1∶600、1∶400 和 1∶200 的含复方冬红合剂的培养
液与 VSMCs 共同孵育 12 h 就能明显抑制其移行
（P<0.05），而稀释度为 1∶800 时，其抑制 VSMCs 移
行的作用不明显（P>0.05）；孵育 24 h 后，稀释度为
1 ∶400 和 1 ∶200 的复方冬红合剂仍能明显抑制
VSMCs 移行（P<0.05），而稀释度为 1∶800 和 1∶600
的复方冬红合剂组及正常对照组中划痕间的
VSMCs 已全部融合（见图 2、3）。
三、细胞凋亡检测
1. 流式细胞仪 PI-Annexin Ⅴ双标记检测细胞
凋亡：结果显示，与正常对照组相比，不同稀释度的
复方冬红合剂与 VSMCs 共同孵育 24 和 48 h 后，
各组均未发生明显的细胞凋亡（见图 4）。
2. Western 印迹检测 caspase-3 表达：与正常对
照组相比， 不同稀释度的复方冬红合剂与 VSMCs
共同孵育 24 和 48 h 后， 各组 VSMCs 蛋白全长
caspase-3 的表达均无统计学差异（P>0.05），并且其
活化片段 caspase-3均无明显表达（见图 5）。
注：1∶800、1∶600、1∶400和 1∶200为各稀释度的复方冬红合剂；*P<0.05
图 1 MTT 法检测复方冬红合剂对 VSMCs 增殖的作用
倒置相差显微镜下观察，与 VSMCs 共同孵育 12 h 后，稀释度为 1∶600、1∶400 和 1∶200 复方冬红合剂组能明显抑制 VSMCs 移行（P<0.05）；共同
孵育 24 h 后，稀释度为 1∶400 和 1∶200 复方冬红合剂仍能明显抑制 VSMCs 移行（P<0.05）
图 2 划痕实验检测复方冬红合剂对 VSMCs 移行的作用
*P<0.05
图 3 图像分析软件测定复方冬红合剂
作用下 VSMCs 的移行距离
1∶2001∶800 1∶600 1∶400正常对照
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不同稀释度的复方冬红合剂与 VSMCs 共同孵育 24 和 48 h 后，各组 VSMCs 均未发生明显的细胞凋亡（P>0.05）
图 4 流式细胞仪 PI-Annexin Ⅴ双标记检测复方冬红合剂对 VSMCs 凋亡的作用
讨 论
ASO 的发病率在我国正逐年增加， 目前治疗
ASO较为积极有效的方法为各种血管重建术，但术
后的血管再狭窄又提出了新的挑战。再狭窄发生的
关键是 VSMCs 的异常增殖和移行， 进而导致内膜
增生再狭窄[6]。 目前临床防治内膜增生的常用药物
以西药为主，鉴于中医药在某些疾病治疗中取得了
良好疗效，已越来越受到全世界的广泛关注。 我们
经前期研究筛选出葛根、西红花和毛冬青，并制成
可口服的复方冬红合剂，经兔髂动脉再狭窄模型证
实其安全性和防治再狭窄的有效性 [4]，但具体作用
机制尚不清楚。 基于 VSMCs 的异常增殖、移行和
凋亡在血管成形术后再狭窄发生、发展中的重要作
用[6,7]，本研究拟通过复方冬红合剂对 VSMCs 增殖、
移行和凋亡的影响，阐明其防治动脉重建术后再狭
窄的可能作用机制。
一、复方冬红合剂对 VSMCs 增殖和移行作用
本研究预初实验结果显示， 复方冬红合剂稀释
度在 1∶100以下时对 VSMCs 有一定的损伤作用，而
稀释度在 1∶800 时对抑制 VSMCs 移行的作用不明
显， 同时与 VSMCs共同孵育 48 h 后才能明显抑制
其增殖， 因此在本研究中复方冬红合剂的稀释度选
择在 1∶800～1∶200之间。研究结果显示这一稀释度范
围的复方冬红合剂对 VSMCs 增殖有一定的抑制作
用，其抑制作用随稀释度的降低而增强，以稀释度
1∶200 时最为明显；在相同稀释度条件下，较低稀释
度（1∶200）的合剂与 VSMCs共同孵育 12 h 就能明显
抑制 VSMCs 增殖，而较高稀释度（1∶800）的合剂则
需与 VSMCs 共同孵育 48 h 才能明显抑制其增殖。
与此同时，进一步研究表明复方冬红合剂还能
不同稀释度的复方冬红合剂与 VSMCs 共同孵育 24 和 48 h 后， 各组 VSMCs 蛋白全长 caspase-3 的表达均无显著差异 （P>0.05）， 其活化片段
caspase-3 均无明显表达
图 5 Western 印迹检测 VSMCs 蛋白 caspase-3 的表达
β-tublin
全长 caspase-3
活化 caspase-3
24 h 48 h
正
常
对
照
1∶2
00
1∶6
00
1∶4
00
1∶8
00
55 ku
32 ku
17 ku
1∶2
00
1∶6
00
1∶4
00
1∶8
00
正
常
对
照
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抑制 VSMCs 移行，与抑制 VSMCs 增殖类似，其抑
制作用亦随稀释度的降低而增强，并在 1∶200 时最
为显著，而稀释度为 1∶800时无明显抑制 VSMCs 移
行的作用。
研究结果也显示复方冬红合剂在抑制 VSMCs
增殖和移行的药物浓度上基本一致， 其稀释度在
1 ∶600～1∶200 时均能同时抑制 VSMCs 的增殖和移
行，并且在相同稀释度条件下，其抑制作用在时间
上也基本一致，如稀释度为 1∶200时与 VSMCs 共同
孵育 12 h 就可产生显著抑制细胞增殖和移行的作
用。 因此，复方冬红合剂在体外不仅可抑制 VSMCs
的增殖，还能抑制其移行，为进一步阐明其在体内
是否可通过抑制 VSMCs 的增殖和移行来防治动脉
重建术后再狭窄提供了理论依据。
二、复方冬红合剂对 VSMCs 凋亡的作用
细胞凋亡在动脉重建术后再狭窄发生机制中
的作用已逐渐被认识 。 我们前期的研究表明 ，
VSMCs 增殖和凋亡的失衡在动脉重建术后再狭窄
中起重要作用，术后第 7 天新生内膜细胞（主要成
分为 VSMCs）凋亡达到高峰，而增殖指数在术后第
14～28 天最高，早期的大幅度细胞凋亡可能诱导以
后的增殖反应，导致再狭窄[7]。 因此，如体外研究能
明确复方冬红合剂对 VSMCs 凋亡产生作用， 也将
从细胞凋亡角度进一步阐明其防治动脉重建术后
再狭窄的可能机制。
本研究通过 PI-Annexin Ⅴ双标记流式细胞仪
检测 VSMCs，PI 阳性表示细胞死亡，Annexin Ⅴ阳
性表示早期细胞凋亡，PI-Annexin Ⅴ双标记阳性表
示晚期细胞凋亡，结果显示复方冬红合剂对 VSMCs
凋亡无明显影响。 此外，在正常情况下 caspase-3以
32 ku 酶原形式存在于胞质中，在凋亡早期阶段，其
可被激活生成活化的 caspase-3，后者由 2 个大亚基
（17 ku）和 2 个小亚基（12 ku）组成，裂解相应的胞
质、 胞核底物， 最终导致细胞凋亡， 因此活化的
caspase-3 是细胞凋亡的标志性产物 [8]。 我们采用
Western 印迹技术检测 17 ku 活化的 caspase-3 在
不同稀释度的复方冬红合剂孵育后 VSMCs 蛋白中
的表达，也再次证明其对 VSMCs 凋亡无明显影响。
因此， 我们推断复方冬红合剂可能不通过调节
VSMCs 凋亡来发挥其抑制内膜增生的作用。
三、复方冬红合剂对 VSMCs 作用机制的探讨
中药复方是中医临床用药的主要形式，包含着
中医学独特的医理、药理、思辨和配伍规律。中药复
方是一个复杂体系，其整体功效不等于方内各药功
效的简单累加，其化学成分也非单味药化学成分的
简单相加。我们前期在兔髂动脉再狭窄模型的药物
筛选过程中，曾将单味药丹参、葛根、西红花和毛冬
青等分别进行研究，但其防治血管再狭窄的作用均
不如由葛根、西红花和毛冬青这 3 味药配伍制成的
复方冬红合剂，为进一步明确其作用机制，我们以
在再狭窄中起重要作用的 VSMCs 为观察对象，将
其与不同浓度复方冬红合剂共同培养，结果显示此
合剂对 VSMCs 增殖和移行有一定的抑制作用，从
某种程度上也解释了其在再狭窄模型中的可能作
用机制。 葛根、西红花和毛冬青经配伍后各成分发
生了反应，产生新的化合物或新的动态变化而出现
新的生物活性，因而可能具备单味药所没有的临床
疗效， 而阐明其确切作用机制则需联合生物化学、
中药化学和药理学等多专业进行协同研究。
总之， 复方冬红合剂可能通过抑制 VSMCs 增
殖和移行，而非调节其凋亡来发挥其抑制内膜增生
的作用， 其抑制 VSMCs 增殖和移行的具体机制还
有待进一步研究。上述结果为复方冬红合剂防治动
脉重建术后再狭窄机制的研究提供了理论基础，并
为深入研究其作用机制提供了可行性依据。
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（收稿日期：2009-11-18）
（本文编辑：林有矞）
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