全 文 ：第 29 卷第 1 期 河 北 科 技 大 学 学 报 Vol.29 , No.1
2008 年 3 月 Journal o f Hebei Univ ersity of Science and Technolog y Mar.2008
　　文章编号:1008-1542(2008)01-0027-03
高质量冬青卫矛 DNA 提取方法
张春晓 , 张　莹
(河北科技大学生物科学与工程学院 ,河北石家庄　050018)
摘　要:为了从富含多酚和多糖的冬青卫矛叶片中分离高质量基因组 DNA ,比较了SDS法 、CTAB
法 、高盐低 pH 值法及改良的CTAB法等提取 DNA 的方法 ,获得了一种以 CTAB法为基础的分离
高质量完整 DNA 的简便 、快速方法。结果表明 ,使用该方法从冬青卫矛叶片中分离得到高纯度 、
高产量的 DNA , A260/ A280为 1.84 ,1 g 鲜叶的 DNA 产量为 213.5 μg ,表明该方法可有效地从富含
多酚和多糖的药用植物组织中提取高质量 DNA 。
关键词:冬青卫矛;DNA 提取;改良 CTAB 法
中图分类号:Q783.1　　　文献标识码:A
Isolation method for high quality genomic DNA of
Euonymus japonica Thunb
ZHANG Chun-xiao ,ZHANG Ying
(Co lleg e of Bio science and Bioeng ineering , H ebei Univer sity of Science and Techno log y , Shijiazhuang Hebei 050018 , China)
Abstract:To obtain high quality genomic DNA f rom E uonymus japonica Thunb , diffe rent DNA isolation methods w ere stud-
ied.A modified CTAB DNA ext raction method w as go t by com paring different methods , such a s SDS me thod , C TAB me thod ,
high salt low pH method and modified C TAB method.The results show that isolated DNA posse sses the character s of high pu-
rity(A260/ A280 is 1.84)and high y ield(213.5 μg/ g fre sh leaves).So the method can iso late DNA effectiv ely fr om hydroxy-
benzene and sugar abundant medicinal ma te rials.
Key words:Euonymus j aponica Thunb;DNA isso lation;modified CTAB method
　　收稿日期:2007-05-30;修回日期:2007-10-18;责任编辑:李　穆
基金项目:河北科技大学校立基金资助项目(QD200416 , XL2006053)
作者简介:张春晓(1971-),女 ,河北安国人 ,副教授 ,博士 ,主要从事植物分子生物学方面的研究。
　　冬青卫矛(Euonymus japonica Thunb)又称大叶黄杨 ,是卫矛科 (Celastraceae)卫矛属(Euonymus
Linn)常绿灌木和小乔木树种 ,常用于园林绿化[ 1] 。卫矛属植物含有黄酮类 、生物碱类 、萜类等化学成分 ,
具有抗肿瘤 、抗炎 、免疫调节 、降血糖等多种药理活性 ,而且还有耐缺氧 、杀虫 、预防和治疗性传播疾病等功
效 , 在运动医学 、保健医学和植物保护等方面都具有十分重要的意义[ 2] ,因此通过提取其基因组 DNA 用以
克隆黄酮类 、生物碱类合成的关键酶基因已成为科学研究中的常用方法 。植物 DNA 提取方法很多 ,如
CTAB法 、SDS法 、氯化苄法 、高盐低 pH 值法 、果胶酶法等[ 3] ,但不同植物材料的组分各异 ,一些模式植物的
DNA 提取方法并不适用于所有植物 。冬青卫矛叶片含有较厚的角质层 ,细胞内含有大量的多糖 、多酚等次
生代谢物 ,影响 DNA的产量及质量。笔者以冬青卫矛为研究材料 ,采用多种 DNA 提取方法并进行适当的
改进 ,探索适宜提取冬青卫矛 DNA 的方法 ,为取得适于分子遗传分析和分子生物学研究的高质量冬青卫矛
基因组 DNA 奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
冬青卫矛幼嫩叶片 ,采自河北科技大学校园内 。
乙二胺四乙酸钠(EDTA ·N a2)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸 、十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基三
乙基溴化铵(CTAB)、氯仿 、异戊醇 、Tris饱和酚等 ,均为国内厂家生产 。DNA 标准分子质量和 EcoR Ⅰ酶
为 Takara产品。
1.2　DNA提取方法
采用 5种 DNA 提取方法提取冬青卫矛叶片基因组 DNA ,分别是 SDS法[ 4] 、CTAB法[ 5] 、高盐低 pH 值
法[ 6] 、CTAB-A 处理法和 CTA B-B处理法 。CTAB-A 处理法是在 CTAB 法的基础上 ,改变细胞提取液中
β -巯基乙醇的质量分数 ,设为 3个水平 ,分别为 2%, 4%和 6%。CTAB-B 处理法是当细胞提取液中 β -巯
基乙醇质量分数为 4%时 ,将 65℃恒温水浴时间设为 3 个水平 ,分别是 40 , 60 , 80 min ,其他操作程序同
CTAB法 ,即 12 000 r/min ,离心 10 min;取上清液加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1 ,体积比), 12 000 r/min
离心 10 min;取上清液加入等体积 0 ℃异丙醇 ,12 000 r/min离心 10 min ,沉淀用无菌水溶解。
1.3　DNA检测方法
琼脂糖凝胶电泳检测法 ,将提取的 DNA 样品点样于 0.8%(质量分数)琼脂糖凝胶上 ,在 5 V/cm 的电
压下 ,采用 DYY-6B稳压稳流电泳仪进行电泳 ,电泳时间为 1.5 h ,电泳结束后在 A ITM-26(Alpha公司)凝
胶成像仪上观察和拍照。
紫外分光光度计法 ,将提取的 DNA稀释 103 ～ 104 倍 ,在 UV-2000型紫外分光光度计上分别测定 260
nm 和 280 nm 下的光吸收值(A),计算 A260/ A280的比值以判断 DNA 提取质量[ 7] 。
1.4　限制性内切酶酶切分析方法
将 10 μg 基因组 DNA 样品在 50 μL 反应体系中 , 1μg EcoRⅠ用 5 U于 37 ℃进行过夜酶切 ,酶切产物
用 0.8%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳(电压为 1 V/cm)分离 ,并在 AITM-26凝胶成像仪上观察和拍照 。
2　结果与分析
2.1　凝胶电泳检测结果
采用 5种 DNA 提取方法获得的冬青卫矛总 DNA 结果见图 1 。从图1中可看出 ,高盐低 pH 值法(泳道
5)不适于冬青卫矛 DNA 提取 ,肉眼未分辨出 DNA 电泳条带 。SDS 法(泳道 1-2)提取得到的 DNA所含杂
质较少 ,但 DNA产量很低 ,DNA条带稍稍能看清 。而 CTAB法获得的 DNA 产量较高 ,但点样孔中有残留
杂质 , 获得的 DNA呈浅褐色 , 说明多酚类等物质去除不完全(泳道 3—4)。CTAB-A 处理法(泳道 6—8)结
图 1　不同方法提取冬青卫矛基因组 DNA 的电泳图
Fig.1　DNA electropho resis of different DNA ex traction methods
28 河 北 科 技 大 学 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　2008 年　
果表明 ,细胞提取液中 β-巯基乙醇质量分数为 2%(泳道 6)时 ,杂质去除不彻底;当 β -巯基乙醇质量分数达
到 4%(泳道 7—8)时 ,能有效地避免细胞中多酚类物质的干扰 ,获得的 DNA 颜色透明 ,纯度高。CTAB-B
处理法(泳道 9-11)结果表明 ,保温时间为 40 min时(泳道 9),获得的 DNA 纯度高 ,DNA 条带亮度高 。当
延长保温时间至 60 min和 80 min(泳道 10和泳道 11),获得的 DNA 产量虽有所增加 ,但点样孔中有杂质滞
留 ,使其纯度略有下降。
2.2　紫外吸收检测结果
DNA 的紫外分光光度计测定分析结果见表 1 ,其与凝胶电泳检测结果一致。高盐低 pH 值法(序号 5)
未能得到其 A260/ A280值 ,进一步说明该方法不适于冬青卫矛 DNA的提取。SDS法(序号 1-2)提取得到的
DNA 所含杂质较少 , A260/ A280在 1.7 ～ 1.8之间 ,但 DNA 产量低 ,平均 1 g 鲜叶中为 106.81 μg 。而 CTAB
法获得的 DNA 产量较高 ,平均 1 g 鲜叶中为 181.69 μg ,但所含杂质较多 , A260/ A280低于 1.7 ,获得的 DNA
呈浅褐色 ,说明多酚类等物质去除不完全。
　　CTAB-A 处理法结果表明(泳道 6-8),细
胞提取液中 β-巯基乙醇质量分数为 2%(序号
6)时 ,杂质去除不彻底 , A260/ A280值为 1.70(见
表 1);当 β -巯基乙醇质量分数达到 4%时 ,能
有效地避免细胞中多酚类物质的干扰 ,获得的
DNA 颜色透明 ,纯度高;A260/ A28 0值约为1.82 ,
说明杂质去除完全 , DNA 产量也较高 , 1 g 鲜
叶中 DNA产量约为 200 μg 。CTAB-B处理法
结果表明 ,保温时间为 40 min(序号 9)时 ,获得
的 DNA 纯度高 , A260/A280值为 1.81(见表 1),
产量高 , 1 g 鲜叶中 DNA 产量为 217.50 μg 。
当延长保温时间至 60 min 和 80 min(序号 10
和序号 11),获得的 DNA 产量虽有所增加 ,但
纯度略有下降。
2.3　限制性内切酶酶切分析
以改良的 CTAB 法提取冬青卫矛基因组
DNA 为模板 ,用限制性内切酶 EcoRⅠ酶切(见
图2)。酶切产物均一 ,说明酶切反应彻底。由
此说明该方法提取的 DNA 质量较好 ,可以用
于 Southern blot分析。
3　讨　论
许多学者对植物中多酚类化合物和多糖物
质对于 DNA 质量的影响进行过研究[ 8 , 9] ,
CTAB法既可裂解细胞 ,又能有效地沉淀多糖 ,
是最常采用的植物 DNA 提取方法[ 9] ,一般对
于新鲜的植物材料采用加入 β -巯基乙醇防止
多酚类物质的氧化[ 10] ,但是浓度过高 ,上清液
黏度太大 ,导致转移上清液时困难 。因此 ,在能
够防止酚类物质氧化的前提下 ,应使用最低浓
度。本研究结果表明 , β -巯基乙醇质量分数为
4%时即有较好的结果 ,获得的 DNA 颜色透
明 ,纯度高(A260/ A280值约为 1.82),产量高(1 g
鲜叶中约含 200 μg)。当加入的抗氧化剂含量
表 1　不同方法提取冬青卫矛基因组 DNA的
A260/A280值和 DNA 产量
Tab.1　A260/ A280 value and DNA y ield by different
DNA ex traction methods
序号 A260/ A280 1 g 鲜叶中 DNA 产量/μg
1 1.71 102.37
2 1.77 111.25
3 1.68 180.88
4 1.65 182.50
5 - -
6 1.70 198.13
7 1.82 201.88
8 1.84 203.13
9 1.81 217.50
10 1.76 211.88
11 1.76 211.25
　　　　　注:序号 1-11与图 1中的泳道序号一致
图 2　DNA 酶切电泳图
Fig.2　DNA dige sted by EcoR Ⅰ
(下转第 43页)
29　第 1 期　　　　　　　　　　　　　张春晓等　高质量冬青卫矛 DNA 提取方法
hDevice =CreateFile ( . Oneusb,G ENERIC READ G ENERIC WRITE ,
　　FILE SHARE READ FILE SHARE WRITE ,NULL ,OPEN EXIST2ING ,
　　FILE A TT RIBUTENORMAL ,NU LL);
DeviceIoContro l()函数用来读写设备控制 ,应用程序以不同的参数调用该函数来控制设备 ,以完成应用
程序和驱动程序之间数据交换的功能。
C loseHandle()是通过设备句柄关闭设备 ,请求完成之后一定要记得关闭设备 。
本应用程序中用到的设备控制请求代码(dw IoControlCode)如下:
1)IOCT L EZUSB GET PIPE INFO(获取端点信息);
2)IOCT L EZUSB GET DEVICE DESCRIPTOR(获取设备描述符);
3)IOCT L EZUSB ANCHOR DOWNLOAD(固件下载请求);
4)IOCT L EZUSB VENDOR REQU ES T(供应商自定义请求代码);
5)IOCT L EZUSB BU LK READ(块读取)。
4　结　语
在简单介绍了高速数据采集卡硬件组成的基础上 ,结合实际应用 ,着重介绍了数据采集系统中核心器件
CY7C68013A 固件程序的设计方法和固件程序的实现。实践证明 ,笔者所设计的高速数据采集卡采样精度
高 、传输速度快 、可靠性能好 ,同时还具有 USB设备体积小 、使用方便等特点。
参考文献:
[ 1] 　张　弘.USB接口设计[ M ] .西安:西安电子科技大学出版社 , 2002.
[ 2] 　王金英 ,王震洲 ,刘教民.决策树算法在智能断路器中的应用[ J] .河北科技大学学报 , 2006 , 27(4):302-305.
(上接第 29页)
足以抑制酚类物质氧化时 ,随着保温时间的延长 ,细胞破裂更为彻底 ,所获得的 DNA 质量有所增加[ 5] ,但时
间太长 ,随之还产生了更多的糖和蛋白 ,使更多的 DNA降解 ,可见保温时间并不是越长越好 。
参考文献:
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[ 6] 　陈昆松 ,李　方 ,徐昌杰 ,等.改良 CTAB 法用于多年生植物组织基因组 DNA 的大量提取[ J] .遗传 , 2004 , 26(4):529-531.
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《河北科技大学学报》期刊五年影响因子达 0.476
根据《2007年版中国期刊高被引指数》所给出的统计数据显示 ,《河北科技大学学报》的期刊五年影响因
子已达 0.476 ,位居河北省高校主办期刊第二。影响因子是世界上普遍公认的期刊评价的客观指标 ,该指标
越高 ,一般来说 ,则反映期刊的社会影响力也就越大。
(本刊编辑部)
43　第 1 期　　　　　　　　　　　　　　王丽娜等　数据采集卡中固件程序的开发