全 文 ：·50· Chinese Journal of Information on TCM Oct.2014 Vol.21 No.10
脱氢紫堇碱对高糖培养心肌成纤维细胞增殖
和胶原分泌的影响
韩路拓 1,2,杨佳妹 1,2,任钧国 2,李鸿海 2,李军梅 2,刘建勋 2
1.北京中医药大学,北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院,中药药理北京市重点实验室,北京 100091
摘要：目的 观察中药延胡索主要有效成分脱氢紫堇碱(DHC)对高浓度葡萄糖培养的心肌成纤维细胞(CFs)
增殖和胶原分泌的影响,为延胡索的临床应用提供实验依据。方法 采用体外高糖培养的 CFs 模型进行实验。
以胶原酶与胰蛋白酶联合消化分离出生 24 h 内乳鼠 CFs,取 2～4 代细胞高浓度葡萄糖(25 mmol/L)培养,分别
加入 100、50、25 mg/L DHC 干预,24、48 h 后镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周
期,ELISA 测定Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量。结果 CFs 种植 3 h 后开始贴壁生长,高浓度葡萄糖培养液培养 24、48 h
后细胞增殖明显增加(P＜0.05,P＜0.01),48 h 后 S＋G2＋M 期细胞的百分率明显增加(P＜0.01),细胞分泌Ⅰ
型、Ⅲ型胶原量明显升高(P＜0.01)；DHC 干预后可显著抑制 CFs 增殖(P＜0.01),降低 S＋G2＋M 期细胞百分
率(P＜0.01),减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌(P＜0.05,P＜0.01)。结论 DHC 能抑制高糖培养的 CFs 的增殖,减少
胶原分泌,DHC具有潜在的抗心肌纤维化作用。
关键词：脱氢紫堇碱；体外高糖培养；心肌成纤维细胞；细胞增殖；胶原
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.10.015
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2014)10-0050-04
Effects of Dehydrocorydaline on Proliferation and Collagen Secretion of Cardiac Fibroblasts
Cultured by High Glucose HAN Lu-tuo1,2, YANG Jia-mei1,2, REN Jun-guo2, LI Hong-hai2, LI Jun-mei2,
LIU Jian-xun2 (1.Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China；2.Xiyuan Hospital Medical of China
Academy of Chinese Sciences, Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia in Beijing, Beijing 100091, China)
Abstract：Objective To observe the effects of dehydrocorydaline (DHC) on proliferation and
collagen secretion of cardiac fibroblasts (CFs) cultured by high glucose；To provide experimental
evidence for clinical application of Rhizoma Corydalis. Methods CFs cultured in vitro with high
glucose were made into models. Collagenase and trypsin were used for the combine digestion of
CFs from ratsbornin 24 h. 2-4 generation CFs were cultured by high glucose (25 mmol/L), and
then 100, 50, 25 mg/L dethydrocorydaline was added for intervention. Cellular morphology of CFs
was observed after 24, 48 h. CFs proliferation was detected by MTT method. Cell cycle was
assessed via flow cytometry. The levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ were determined by ELISA.
Results CFs began to grow adherence 3 hours after planting, and CFs cultured by high glucose
significantly proliferated 24, 48 h later (P＜0.05, P＜0.01). The percentage of S＋G2＋M phase CFs
increased significantly after 48 h (P＜0.01). The secretion of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ also
increased significantly (P＜0.01). After the intervention of DHC, CFs proliferation was significantly
inhibited (P＜0.01)；the percentage of S＋G2＋M phase CFs decreased (P＜0.01)；the secretion of
collagen Ⅰ and collagen Ⅲ was reduced (P＜0.05, P＜0.01). Conclusion DHC can reduce CFs
proliferation, decrease collagen secretion of CFs cultured by high glucose, and has potential effects
of anti-myocardial fibrosis.
Key words：dehydrocorydaline；cultured in vitro with high glucose；cardiac fibroblasts；cell
proliferation；collagen

基金项目：国家自然科学基金(H2809)
通讯作者：任钧国,E-mail：reek2003@163.com
2014 年 10 月第 21 卷第 10 期 中国中医药信息杂志 ·51·
糖尿病心肌病是一种独立的、特异的糖尿病并发
症,临床特征早期以心脏舒张功能不全,晚期以收缩
功能不全为主,易并发心力衰竭及心律失常,心肌纤
维化是其主要病理特征。心肌成纤维细胞(CFs)的活
化、增殖、合成、分泌胶原是糖尿病心肌纤维化产生
的主要原因。脱氢紫堇碱(DHC)是延胡索的主要有效
成分,药理研究表明,DHC 具有扩张冠状动脉、保护心
肌缺血再灌注损伤、改善微循环、降低耗氧量、抑制
血小板聚集等作用[1-2],但有关 DHC 抗心肌纤维化的研
究尚未见报道。本实验采用体外高糖培养的CFs模型,
初步观察 DHC 对 CFs 增殖与胶原分泌的影响,为延胡
索的临床应用提供实验依据。
1 实验材料
1.1 动物
出生24 h内SD大鼠乳鼠10只,SPF级,雌雄不限,
购于北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证
号：11400700012085。
1.2 药物
DHC 对照品(北京鑫方程生物公司,批号 120930,
20 mg),卡托普利对照品(中国食品药品检定研究院,
批号 100318-201103,100 mg)。
1.3 主要试剂与仪器
胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、四甲基偶氮唑盐(MTT)
均为Sigma公司进口分装产品,DNA PREP试剂盒(库尔
特公司),Ⅰ型、Ⅲ型胶原 ELISA 试剂盒(USCN 公司),
小鼠抗波形蛋白单克隆抗体和小鼠抗结蛋白单克隆
抗体(Biogenes 公司),DMEM 高糖、低糖培养基和胎牛
血清(FCS)均为 GIBCO 公司产品。流式细胞分析仪(美
国 BD 公司),酶联免疫分析仪(美国 BioTek 公司)。
2 实验方法
2.1 心肌成纤维细胞培养与鉴定
参照文献[3]方法加以改进。取出生 24 h 内的 SD
大鼠乳鼠,在无菌条件下,开胸摘取心脏,置于 4 ℃、
0.01%磷酸盐缓冲液中,除去红细胞,75%酒精浸泡
30 s 后剪成 1 mm3大小的碎块,弃去 0.01%磷酸盐缓冲
液,加入等体积的 0.125%胰蛋白酶和 0.1%Ⅱ型胶原
酶,37 ℃水浴振荡反复消化 10 min,至组织块消失,
收集每次消化悬液,10%FCS 的 DMEM 低糖培养液终止
消化,收集每次消化悬液,2000 r/min 离心 10 min,弃
上清液,再加入 10%的 DMEM 低糖培养液,制成细胞悬
液,接种至培养瓶,置于 37 ℃、5%CO2培养箱内培养。
根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同,采用差
速贴壁分离法贴壁 60 min,弃上清液,剩下的为 CFs,
加入含 10%FCS 的 DMEM 低糖培养液继续培养。经免疫
组化波形蛋白染色阳性和结蛋白染色阴性为所需的
CFs,纯度达98%,台盼蓝染色细胞活力＞90%。待80%～
90%细胞融合后用 0.25%胰酶消化传代(1∶2),实验采
用 2～4 代细胞。
2.2 分组与给药
正常组：DMEM 低糖培养基(内含 5.5 mmol/L D-
葡萄糖)；模型组：DMEM 高糖培养液(内含 25 mmol/L
D -葡萄糖)；高渗组：DMEM 培养基(含 5.5 mmol/L D -
葡萄糖＋19.5 mmol/L 甘露醇)；DHC高、中、低剂量组：
100、50、25 mg/L DHC；对照组：22 mg/L卡托普利。
2.3 细胞增殖检测
将处于对数生长期的 CFs 制成细胞悬液,以 5×
104个/mL 接种于 96 孔板,每孔 100 μL,置于 37 ℃、
5%CO2培养箱中培养 24 h 后换无血清 DMEM 继续培养
24 h,分别给予不同的处理因素,每组 6 个复孔,继续
培养 24、48 h,再在每孔中加入 10 μL(1 g/L)MTT 溶
液,37 ℃,继续培养 4 h,终止培养,弃上清液,加入
100 μL DMSO/孔,酶标仪 490 nm 波长测吸光度(A 值)。
2.4 心肌成纤维细胞细胞周期检测
取 CFs 制成细胞悬液,以 1×105个/mL 接种于 96
孔板,每孔 2 mL,置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h
后,换无血清 DMEM 继续培养 24 h,给予不同的处理因
素,每组 3 个复孔,培养 48 h。用 0.25%胰蛋白酶消化
成单细胞悬液,调整细胞密度1×106个/mL,严格按细胞
周期试剂盒说明书操作,在流式细胞仪上进行检测,
用 MCYCLE 软件进行细胞周期分析。
2.5 Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量检测
取 CFs 制成细胞悬液,以 1×105个/mL 接种于 96
孔板,每孔 2 mL,置于 37 ℃、5%CO2培养箱中培养 24 h
后,换无血清 DMEM 继续培养 24 h,分别给予不同的处
理因素,每组 4 个复孔,培养 48 h 后分别吸取细胞上
清液,严格按照 ELISA 试剂盒说明书检测Ⅰ型、Ⅲ型
胶原的含量。
3 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。所有数据以
—x±s 表示,组间比较采用 t 检验和方差分析。P＜0.05
表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 脱氢紫堇碱对乳鼠心肌成纤维细胞形态的影响
乳鼠 CFs 生长迅速,2～3 d 即呈融合状态。细胞
多呈梭形,胞体较大,胞质透明,细胞核呈椭圆形,通
常含 2～3 个核,无自发性搏动,见图 1。蛋白免疫荧光
显示,CFs 的波形蛋白呈阳性反应,结蛋白呈阴性反
应,见图 2。
·4

殖
关
0
组
后
比
殖
0
正
高
模
DH
DH
DH
对

4
影

效
学
组
(
0
52·
细胞形态
波形
.2 脱氢紫
与正常组
差异无统
。干预 24
.05)。与模
均可抑制细
,模型组能
较,对照组
(P ＜0.01
.05)。结果
表
组别
常组
渗组
型组
C 组(高)
C 组(中)
C 组(低)
照组
注：与正常组
**P＜0.0
.3 脱氢紫
响
根据增殖
果最佳。4
意义,故以
比较,模型
P＜0.01),
.01)。与模


(×100)
图 1 乳
蛋白
图 2 乳鼠 CF
堇碱对乳鼠
比较,干预
计学意义,
h 后,模型
型组比较,
胞增殖(P
明显诱导
和 DHC 高
),DHC 低
见表 1。
1 各组乳鼠不
n 浓度(mg/L)
6
6
6
6 100
6 50
6 25
6 22
比较,#P＜0.05
1(下同)
堇碱对乳
实验的结
8 h 时 DHC
下实验 DH
组可以明显
增加 S＋
型组比较,
Chine

鼠 CFs 形态及

s 蛋白显色反应
心肌成纤
24、48
说明细胞
组可明显
对照组和 D
＜0.05,P
CFs 增殖(P
、中剂量组
剂量组无明
同时点 CFs 增
24 h
0.146±0.0
0.147±0.1
0.159±0.0
0.097±0.0
0.108±0.0
0.137±0.0
0.109±0.0
,##P＜0.01；
鼠心肌成纤
果可知,48
高、中剂量
C 分为高、
降低G0＋
G2＋M 期细
DHC 高剂量
se Journa

细胞状态(×2
状态
结蛋白
(×400)
维细胞增殖
h 后,高渗组
的增殖与渗
诱导 CFs 增
HC 高、中
＜0.01)。
＜0.01)。
均可抑制
显抑制作
殖比较(—x±s)
07 0.122
30 0.128
09# 0.155
06** 0.094
16** 0.126
13** 0.150
07* 0.106
与模型组比较,
维细胞增殖
h 时细胞
组药效差
中剂量组
G1期 CFs
胞的百分
组明显增加
l of Info

00)

的影响
CFs 增
透压无
殖(P＜
、低剂量
干预 48 h
与模型组
细胞的增
用(P ＞
48 h
±0.011
±0.008
±0.021##
±0.006**
±0.005**
±0.024
±0.004**
*P＜0.05,
周期的
增殖模型
异有统计
。与正常
的百分率
率(P＜
G0＋G1
rmation
期细胞增
细胞增殖
G1 期细
细胞增殖
表 2、图
组别
正常组
模型组
DHC 组(高)
DHC 组(中)

4.4 脱
胶原含量
与正
型、Ⅲ型
剂量组可
0.01)。
组别
正常组
模型组
DHC 组(高)
DHC 组(中)
5 讨论
CFs
的过度沉
织的主要
的作用,
0 32 64
300
250
200
150
100
50
0
300
250
200
150
100
50
0
0 32 64
on TCM
殖周期百分
周期百分率
胞增殖周期
周期百分
3。
表 2 各组
n 浓度(m
3
3
3 10
3 5

正常组

DHC(高)
图 3 各组
氢紫堇碱对
的影响
常组比较,
胶原(P＜
抑制Ⅰ型
结果见表 3
表 3 各组乳鼠
n 浓度(mg
4
4
4 100
4 50
的增殖、细
积是心肌纤
组成细胞,
各型胶原由
96 128 160 1
96 128 160 19
Oc
率(P＜0
(P＜0.0
百分率无
率无明显变
乳鼠 CFs 增殖周
g/L) G0
97.131
88.987
0 99.071
0 88.482


乳鼠 CFs 增殖
乳鼠心肌
模型组可以
0.01)。与模
、Ⅲ型胶原
。
CFsⅠ型、Ⅲ型
/L) Ⅰ型胶原
628.11±
2081.69±
1074.53±
1126.39±
胞外基质(
维化形成
占心脏组织
纤维连接
92 224 256
300
250
200
150
100
50
0
0
2 224 256 0
300
250
200
150
100
50
0
t.2014 Vo
.01),降低
1)。DHC 中
明显变化,
化(P＞0.
期比较(—x±s,%
＋G1
±0.530
±0.929##
±0.185**
±5.312

模型

DHC 组
周期流式细胞图
成纤维细胞
明显诱导
型组比较
的分泌(P
胶原含量比较
(pg/mL) Ⅲ
126.89 5
525.70## 10
203.47* 4
185.73* 5
主要是Ⅰ型
的关键。C
的 2/3,具
素固定于心
32 64 96 1
32 64 96 1
l.21 No.1
S＋G2＋M
剂量组 G0
S＋G2＋M
05)。结果
)
S＋G2＋M
2.869±0.530
11.013±0.929
0.929±0.185
11.518±5.312
组
(中)

Ⅰ型、Ⅲ
CFs 分泌
,DHC 高、
＜0.05,P
(—x±s)
型胶原(ng/mL
.81±1.07
.45±1.67##
.61±1.27**
.53±1.21**
、Ⅲ型胶原
Fs 是心脏
有分泌胶
肌细胞和
28 160 192 224
28 160 192 224
0
期
＋
期
见

##
**



型
Ⅰ
中
＜
)
)
组
原
成
256
256
2014 年 10 月第 21 卷第 10 期 中国中医药信息杂志 ·53·
纤维细胞上,Ⅰ型胶原构成较粗的心肌纤维,使心肌
具有良好的顺应性。Ⅲ型胶原和Ⅰ型胶原垂直分布,
易于伸展并形成一个牢固的网状结构。对维持心脏正
常的形态、功能具有重要价值。纤维化过程中Ⅰ型、
Ⅲ型胶原的比例不断增加,排列出现紊乱,这是导致
心肌纤维化的组织学基础。糖尿病时,CFs 增殖,CFs
数目增多,心肌细胞合成和分泌大量的胶原,生成大
于降解,使心肌纤维增粗,导致心室壁厚度增加心室
顺应性下降,最终导致心室收缩及舒张功能不全。
本实验结果显示,采用体外高糖培养乳鼠 CFs,能
够促进 CFs 增殖,CFs 分泌Ⅰ型、Ⅲ型胶原的能力明显
增加。这与已有报道一致[4]。
本实验研究发现,DHC 干预高糖培养的 CFs 后,细
胞增殖明显抑制,S 期细胞增殖周期百分率明显降低,
提示该成分能明显抑制CFs的增殖,降低CFs的数量,
减轻糖尿病心肌纤维化的进程。进一步研究发现,该
成分还可以减少Ⅰ型、Ⅲ型胶原的分泌,表明 DHC 不
仅可以抑制 CFs 的增殖,还能降低其合成与分泌胶原
的能力,进而抑制糖尿病心肌纤维化。
综上所述,DHC 能抑制高糖培养的 CFs 的增殖,降
低胶原的合成与分泌,是一种具有潜在治疗糖尿病心
肌纤维化的有效成分,其作用机制值得进一步研究。
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(收稿日期：2014-03-04)
(修回日期：2014-03-18；编辑：华强)