全 文 ：中药萹蓄的质量标准研究＊
吴呈祥 ,陈　君 ,张　蕾 ,李　萍＊＊
中国药科大学 现代中药教育部重点实验室 ,南京 210038
　　摘　要　目的:建立中药萹蓄的质量标准。方法:采用 RP-HPLC方法 ,以 0.1%甲酸(A)-乙腈(B)为流动
相 , 梯度洗脱 ,流速 1.0 mL·min-1 ,检测波长 352 nm,测定萹蓄中主要黄酮类成分杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷的含
量 , 并以槲皮苷为对照品进行 “一测多评”评价。结果:杨梅苷 、萹蓄苷 、槲皮苷的线性范围分别为 5.64 ～ 282 μg·
mL-1、 4.60 ～ 230 μg·mL-1和 4.48 ～ 224 μg·mL-1 , 线性关系良好;平均回收率分别为 98.2% (RSD=1.1%)、
102.1% (RSD=0.6%)和 98.9% (RSD=2.9%)。 “一测多评 ”的计算结果较实测值接近 , 达 96.2% ～
101.2%。结论:本标准能准确定量 3种黄酮类成分 ,可用于萹蓄药材的质量控制。
关键词　萹蓄;RP-HPLC;质量标准
中图分类号　R284.1　　文献标志码　A　　文章编号　1673-7806(2009)05-365-05
　＊基金项目　国家中医药管理局公益性行业科研专项(200707009)
　作者简介　吴呈祥 ,男 ,硕士　E-mail:wuchengxiang0123@1631com
　＊＊通讯作者　李萍 ,女 ,教授 ,博士生导师　E-mail:liping2004@126.com
StudiesonthequalitystandardsofHerbaPolygoniAvicularis＊
WUCheng-xiang, CHENJun, ZHANGLei, LIPing＊＊
KeyLaboratoryofModernChineseMedicines(ChinaPharmaceuticalUniversity), MinistryofEducation, Nanjing210038
Abstract　Objective:ToestablishthequalitystandardsofHerbaPolygoniAvicularis.Methods:The
separationwasperformedonaC18 column, usingagradientelutionwiththemobilephaseof0.1%a-
queousmethanoicacid(A)andaetonitrile(B).Theflowratewas1.0 mL·min-1 , andthedetection
wavelengthwassetat352 nm.Thecontentsofthemajorbioactiveflavonoidsincludingmyricitrin,
avicularinandquercitrininHerbaPolygoniAvicularisweredetermined.Inaddition, quercitrinwas
usedasthereferencestandardtocalculatethecontentsofmyricitrinandavicularinbycorelationfac-
tors.Results:Thelinearrangesofmyricitrin, avicularinandquercitrinwere5.64 ～ 282 μg·mL-1 ,
4.6 ～ 230μg·mL-1 and4.48 ～ 224 μg·mL-1 , respectively, andthelinearrelationshipsweregood.
Theaveragerecoveriesofthethreeconstituentswere98.2%, 102.1%and98.9%, respectively, and
RSDswererangedfrom0.6% to2.9%.Thecalculatedcontentsbycorrelationfactorswerecloseto
themeasuredvalue, andtheaccuracywere96.2 ～ 101.2%.Conclusions:TheHPLCmethodcanbe
usedforthequalitycontrolofHerbaPolygoniAvicularis.
Keywords　HerbaPolygoniAvicularis;RP-HPLC;Qualitycontrol
　　萹蓄为蓼科植物萹蓄 PolygonumaviculareL.
的干燥地上部分 ,收载于 2005年版 《中国药典 》
(一部),具有补肾 、清肝明目 、利尿的功能 [ 1] ,主治
淋痛 、湿疹 、泌尿系感染 、结石 、血尿等症 [ 2] 。现代
研究表明 ,萹蓄具有利尿 、降压 、抗菌 、止血等作用 ,
黄酮类是其主要的有效活性成分[ 2] 。全国大部分
地区均产萹蓄 ,为常用中药 ,但对其质量标准的研
究较少[ 3-5] ,尚未见有 HPLC法测定其主要黄酮类
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　　　　　药学与临床研究　　　　 2009年 10月　
PharmaceuticalandClinicalResearch　 2009, 17 (5)
DOI :10.13664/j.cnki.pcr.2009.05.003
成分杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷含量的报道;2005年
版 《中国药典 》也仅有性状 、显微鉴别和薄层鉴别
等内容 [ 1] 。为此 ,本文建立了分析萹蓄中上述 3个
成分的 HPLC法 ,对 10批药材进行了含量测定 ,并
以槲皮苷为对照品 ,通过相对校正因子对萹蓄进行
了 “一测多评 ”评价 。结果显示 , 该方法简便 、可
靠 ,可用于萹蓄药材的质量控制 。
1　仪器与试药
Agilent1100 液相色谱仪 (Agilent, USA);
KH500DB型超声波提取器(昆山禾创超声仪器有
限公司);十万分之一电子天平(北京赛多利斯仪
器系统有限公司)。 Mili-Q超纯水;乙腈为色谱纯
(ROE, US);其它试剂均为分析纯。
对照品:杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷由实验室自
制 ,经 1H-NMR, 13C-NMR, MS等方法确证其结
构 [ 6] , HPLC归一化法确定其纯度均大于 98%;萹
蓄药材购自全国不同省市 ,经本课题组李萍鉴定为
蓼科植物萹蓄 PolygonumaviculareL.的干燥的地
上部分 ,凭证标本存放于中国药科大学生药学教研
室。
2　方法和结果
2.1　液相色谱条件及系统适应性
色谱柱:AgilentExtend-C18(250 mm×4.6 mm,
5μm);流动相为 0.1%甲酸(A)-乙腈(B);流速
1.0mL·min-1;柱温 28℃;进样量 10μL;检测波长
为 352 nm。梯度洗脱程序如表 1。
表 1　梯度洗脱程序
Table1　Elutionprogram
时间(min) 流动相A(%) 流动相B(%)
0～ 15 85 15
15～ 20 85※83 15※17
20～ 30 83 17
30～ 45 83※78 17※22
　　考察了不同型号色谱柱对样品的分离情况 ,结
果在选定的色谱条件下 ,各色谱峰的分离度均大于
1.5,理论塔板数均大于 2000(图 1)。
图 1　对照品及样品(安徽定远)采用不同类型色谱柱分析的色谱图.A.对照品(KromasilC18);B.样品(KromasilC18);C.样品(AglientExtend-C18);D.样品(AgilentSB-C18);
1.杨梅苷;2.萹蓄苷;3.槲皮苷.Fig.1　HPLCchromatogramsofreferencesubstancesandthesample(AnhuiDingyuan)bydiferentcolumns.
(A)Referencesubstances(KromasilC18);(B)Sample(KromasilC18);(C)Sample(AglientExtend-C18);(D)Sample(AgilentSB-C18).
1.Myricitrin;2.Avicularin;3.Quercitrin.
2.2　专属性考察
按上述色谱条件进行 HPLC-MS分析 ,比较样
品中杨梅苷 、萹蓄苷 、槲皮苷的质谱图和标准品的
质谱图 ,结果两者一致(图 2),故可认为药材中这
3个成分已经和其他成分完全分离 ,无杂质干扰 。
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第 5期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　吴呈祥等 , 中药萹蓄的质量标准研究
图 2　A、B:对照品和标准品的 HPLC图;A1、B1:杨梅苷的质谱和二级质谱图;A2、B2:萹蓄苷的质谱和二级质谱图;A3、B3:槲皮苷的质谱和二级质谱图.1.杨梅苷;2.萹蓄苷;3.槲皮苷
Fig.2　A, B:HPLCofreferencesubstancesandsample;A1 , B1:MSandMS2 ofmyricitrin;A2 , B2:MSandMS2 ofavicularin;A3 , B3:MSandMS2 ofquercitrin.1.Myricitrin;2.Avicularin;3.Quercitrin.
2.3　提取条件的优化　
以安徽定远药材为考察对象。
2.3.1　提取溶剂的选择　取本品粉末 1g,精密称
定 ,置具塞锥形瓶中 ,分别精密加入下列提取溶剂:
(1)甲醇 、(2)80%甲醇 、(3)乙醇 、(4)80%乙醇 、
(5)60%乙醇各 50 mL, 混匀 , 超声处理 (功率
250W,频率 50Hz)30 min。
比较 5种溶剂的提取效果 。测定结果表明 ,
60%乙醇的提取效果最好 ,结果见表 2。
表 2　提取溶剂的比较
Table2　Comparisonoftheextractionsolvents(n=3)
提取溶剂 杨梅苷(%) 萹蓄苷(%) 槲皮苷(%)
甲醇 0.0338±0.0005 0.0146±0.0006 0.0216±0.0007
80%甲醇 0.0613±0.0007 0.0234±0.0009 0.0325±0.0020
乙醇 0.0339±0.0006 0.0137±0.0007 0.0206±0.0006
80%乙醇 0.0587±0.0007 0.0218±0.0007 0.0312±0.0006
60%乙醇 0.0633±0.0009 0.0246±0.0009 0.0334±0.0006
2.3.2　提取方式的选择　取本品粉末 (过六号
筛)1 g,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,以 60%乙醇
50mL为提取溶剂 ,以下列提取方式:(1)索氏提取
8h、(2)加热回流(85℃)3 h、(3)冷浸 8 h、(4)超
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药学与临床研究　PharmaceuticalandClinicalResearch　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17卷
声提取 30 min、(5)冷浸 8 h后超声提取 30 min进
行考察 。结果表明 ,冷浸 8h后超声提取 30min的
提取效果和加热回流 3 h提取的效果差不多。从
节能的角度选择前者为好。结果见表 3。最后确
定样品提取条件为:冷浸 8 h后超声提取 30min。
表 3　提取方式的比较(n=3)
Table3　Comparisonoftheextractionmethods(n=3)
提取方式 杨梅苷(%) 萹蓄苷(%) 槲皮苷(%)
索氏提取 8h 0.0543±0.0004 0.0201±0.0006 0.0284±0.0008
加热回流 3h 0.0774±0.0005 0.0280±0.0009 0.0397±0.0007
冷浸 8h 0.0559±0.0005 0.0203±0.0008 0.0295±0.0008
超声提取 30min 0.0633±0.0009 0.0246±0.0009 0.0334±0.0006
冷浸 8 h后超声
提取 30min 0.0763±0.0010 0.028±0.0007 0.039±0.0011
2.4　标准曲线制备
精密称取杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷适量 ,用
60%乙醇制成浓度分别为 282、230、224 μg·mL-1
的对照品储备液 。将上述储备液依次精密稀释梯
度为 1、1 /2、1/5、1/10、1 /25、1/50浓度 ,每一浓度
进样 10 μL,重复进样 3次 ,测定各峰峰面积。以
峰面积(Y)为纵坐标 ,溶液浓度(X)为横坐标进行
回归计算。杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷回归方程和相
关系数分别为:Y1 =18865X1 -15.574, r=
0.999 9;Y2 =27063X2 -29.972, r=0.9999;Y3 =
23931X3 -20.29, r=1。结果表明在相应的线性
范围内呈良好的线性关系 。
2.5　精密度实验
精密吸取 “标准曲线”项下各储备液稀释为 1 /
5的对照品溶液 (杨梅苷 56.4 μg·mL-1 , 萹蓄苷
46 μg·mL-1 ,槲皮苷 44.8μg·mL-1)10μL,重复进
样 6次 , 记录峰面积 ,测得杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮
苷的日内精密度 (RSD)分别为 1.3%、 0.3%、
0.5%。精密吸取混合对照品溶液 10 μL,每天进
样 3次 ,连续进样 3天 ,记录峰面积 ,测得日间精密
度(RSD)分别为 1.6%、1.6%、0.7%。
2.6　检测限与定量限
先进一针空白溶剂 ,测出噪音 ,进已知浓度的
对照品溶液 ,根据其对应的峰高值 ,将对照品溶液
稀释至约 3倍信噪比的浓度(S/N=3),即为检测
限(LOD),杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷检测限分别为
4.48ng、2.3 ng、5.64 ng;约 10倍信噪比的浓度
(S/N=10)即为定量限(LOQ),杨梅苷 、萹蓄苷和
槲皮苷定量限分别为 13.5ng、9.2ng、11.3 ng。并
且在定量限处重复进样 5次 ,计算峰面积的相对标
准偏差。杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷 RSD分别为
1.1%、1.0%、1.0%。
2.7　稳定性实验
取药材样品液 ,分别于提取后 0、2、6、12、24h
测定各峰峰面积 ,计算结果的 RSD分别为 0.4%、
0.8%、0.6%,表明药材样品液 24 h内稳定。
2.8　重复性实验
精密称取 6份萹蓄粉末约 1 g,按照 “样品测
定”项下操作 ,记录各化合物的峰面积 , 计算其
RSD分别为 1.9%、1.4%、2.6%。结果表明该方
法重复性好 。
2.9　加样回收率实验
精密称取 6份已知含量的药材各 0.5 g,按其
含量在药材中添加相应量的对照品 ,按 “样品测定”
项下方法测定 ,计算加样回收率。结果杨梅苷 、萹蓄
苷和槲皮苷的平均回收率分别为 98.2%、102.1%、
98.9%, RSD分别为 1.1%、0.6%、2.9%。
2.10　样品测定
精密称取样品粉末(过 60目筛 , 60℃烘 3 h)
约1.0g, 置具塞锥形瓶中 ,精密加入 60%乙醇
50mL,混匀 ,冷浸 8h后超声提取 30min,过滤 ,滤
液浓缩至 5mL,过 0.45 μm微孔滤膜 ,进样 10μL,
按外标法计算各成分的含量 ,结果见表 4。
表 4　样品含量测定结果
Table4　Contentsoftheflavonoidsinthesamples
样品来源 杨梅苷(%) 萹蓄苷(%) 槲皮苷(%)
安徽定远 0.0758 0.0276 0.0386
江苏 0.0326 0.0076 0.0087
陕西渭南 0.0720 0.0245 0.0137
陕西汉中 0.0557 0.0092 0.0193
吉林 0.0168 0.0032 0.0064
湖北 0.0732 0.0163 0.0239
河南 0.0086 0.0026 0.0046
内蒙 0.0293 0.0094 0.0144
甘肃 0.0260 0.0058 0.0085
南京 0.0593 0.0110 0.0221
2.11　一测多评
根据在一定线性范围内 ,成分的量 (质量或浓
度)与检测器响应成正比 ,即 C=fA[ 7-9] 。如以药
材中某一典型组分 (有对照品组分)为内标 ,建立
该组分与其它组分(无对照品组分)之间的相对校
正因子 ,即可通过相对校正因子计算其它组分的含
量。这种在不用其它成分对照品的情况下 ,按相对
校正系数计算样品中其它指标含量的方法即为一
测多评法。该方法尤其适合中药在对照品缺乏时
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第 5期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　吴呈祥等 , 中药萹蓄的质量标准研究
的多指标质量控制。
为克服该质量标准对照品不易得和检测成本高
的问题 ,对萹蓄进行了一测多评的探讨。以较易得
的槲皮苷为标准品 ,通过相对校正因子计算杨梅苷
和萹蓄苷的含量 。相对校正因子的计算公式如下:
f1 =AiC1 /A1Ci;f2 =AiC2 /A2Ci[ 10]
式中 f1为杨梅苷相对槲皮苷的校正因子 , f2
为萹蓄苷相对槲皮苷的校正因子;A1为杨梅苷的
峰面积 , A2为萹蓄苷的峰面积;C1为杨梅苷的浓
度 , C2为萹蓄苷的浓度;Ai为槲皮苷的峰面积 , Ci为
槲皮苷的浓度。
通过不同浓度的标准品 (0.2、 0.1、 0.05、
0.025、0.01、0.005 mg·ml-1)及相应峰面积可计算
出 f1 、f2的平均值 , f1为 1.2665, f2为 0.9014, RSD
分别为 0.2%和 2.5%。根据公式 C′=fC′[ 10]计算
含量(C′为一测多评法计算出的浓度 , C′′为待测化
合物峰面积采用槲皮苷标准曲线计算所得浓度)。
比较一测多评法计算所得含量与待测化合物实测
含量(即采用待测化合物标准曲线计算的含量),
考察一测多评法的准确度 。结果见表 5。
表 5　一测多评法计算值和与实测结果比较(%)
Table5　Thecomparisonofrelativequantitativedeterminationwithactualdetermination(%)
样品来源 杨梅苷实测值 计算值 准确度
萹蓄苷
实测值 计算值 准确度
安徽定远 0.0758 0.0758 100.0 0.0276 0.0279 101.1
江苏 0.0326 0.0327 100.3 0.0076 0.0075 98.7
陕西渭南 0.0720 0.0720 100.0 0.0245 0.0248 101.2
陕西汉中 0.0557 0.0557 100.0 0.0092 0.0092 100.0
吉林 0.0168 0.0169 100.6 0.0032 0.0031 96.9
湖北 0.0732 0.0732 100.0 0.0163 0.0164 100.6
河南 0.0086 0.0087 101.2 0.0026 0.0025 96.2
内蒙 0.0293 0.0293 100.0 0.0094 0.0094 100.0
甘肃 0.0260 0.0261 100.4 0.0058 0.0058 100.0
北京 0.0593 0.0593 100.0 0.0110 0.0110 100.0
　　结果显示 ,一测多评法的计算值与实测结果的
偏差小 ,准确度为 96.2% ～ 101.2%,说明仅测定
药材中槲皮苷的含量 ,同时计算出拟测成分杨梅苷
和萹蓄苷的含量的方法准确可行。
3　讨论
3.1　黄酮类成分杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷在
256nm和 352 nm处均有最大吸收 ,分别考察样品
在两波长下的色谱图 , 最后选取干扰较少的
352nm作为检测波长 ,此时所得基线平稳 , 3种成
分达到完全分离 。
3.2　由于样品的产地 、生长年限 、采收期及存放时
间的不同 ,药材中活性成分的含量存在很大差异。
因此 ,对萹蓄进行质量控制 ,对保证其药效及用药
安全均具有重要意义 。
3.3　本法操作简便 ,测定结果准确可靠 ,可用于萹
蓄药材中杨梅苷 、萹蓄苷和槲皮苷的含量测定 ,进
而对萹蓄进行科学的质量评价。一测多评质控模
式的测量结果准确度高 ,该质控模式可解决实际应
用中对照品缺乏和多指标质控成本高的困难 ,特别
适合中药多成分的质量控制。
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