全 文 ：第 31 卷 第 2 期
2 0 1 3 年 2 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 31 No． 2
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响应面法优化拳参总蒽醌超声提取工艺的研究
杨仙凌
(浙江省象山县红十字台胞医院，浙江 象山 315731)
摘 要:目的:确定拳参总蒽醌的优化超声提取工艺。方法:采用直接紫外分光光度法测定拳参总蒽醌含量
并以总蒽醌提取率为指标，考察乙醇浓度、提取时间、料液比三因素对拳参总蒽醌提取率的影响，在单因素试验的
基础上选取试验因素与水平，采用响应面分析法优化超声提取工艺条件。结果:拳参总蒽醌的最佳提取工艺为:
乙醇浓度 73%，提取时间 30 min，料水比 1 ∶ 35(W ∶ V)。在最佳工艺条件下，拳参总蒽醌的实际提取率可达
3． 03%。结论:该工艺提取率高、操作简便，可为拳参总蒽醌的生产提供参考。
关键词:拳参;总蒽醌;提取;直接紫外分光光度法;响应面分析
中图分类号:R284． 3 文献标志码:A 文章编号:1673 － 7717(2013)02 － 0408 － 03
Optimization of the Extraction Process of Athraquinones by Response Surface Methodology
YANG Xianling
(Red Cross Taiwang Compatriot Hospital of Xiangshan County，Xiangshan 315731，Zhejiang，China)
Abstract:Objective:To optimize the extraction process of athraquinones from Polygonum bistorta L． ． Methods:On the
basis of single factor experiments，a three － level，three － variable Box － Behnken design was used to optimize the extrac-
tion parameters(ethanol concentration，extraction time and ratio of solution to raw material)of athraquinones by ultraphon-
ic extraction． Result:The optimal extraction condition was as follows:ethanol concentration 73%，extraction time of 30 min
and the ratio of material to water of 1 ∶ 35(W ∶ V)． Under those optimal conditions，the actually experimental yield was
3． 306% ． Conclusion:The method in this study was simple，rapid and reliable，which can be useful for the mass produc-
tion of athraquinones from Polygonum bistorta L． ．
Key words:Polygonum bistorta L．;total athraquinones content;extraction;direct UV spectrophotometry;response
surface methodology
收稿日期:2012 － 09 － 24
作者简介:杨仙凌(1971 － ) ，男，浙江象山人，副主任中药师，研究
方向:中医药防治老年性疾病。
拳参为蓼科植物拳参 Polygonum bistorta L． 的根
茎 ． ，苦、涩、微寒，具有清热解毒、止泻、镇惊息风、止血
等功效，常用于治疗肠炎、痢疾、肝炎及破伤风等疾
病［1］。现代研究表明，拳参具有抗炎、抗菌、抗癌等作
用［2］，拳参含有蒽醌、黄酮以及甾醇类化合物等有效活
性成分［3］，其中蒽醌类化合物具有抗病毒、抗癌及保肝
利胆等药理作用［4 － 6］。目前，有关拳参总蒽醌提取工艺
及含量测定的研究未见报道。响应面分析法(Response
Surface Methodology，RSM)是利用 Box － Behnken 的实验
设计，采用多元二次方程来拟合因素和响应值之间的函
数关系，通过对回归方程的分析寻求最优工艺参数，解
决多变量问题的一种统计方法［7］。与正交和均匀设计
相比，Box － Behnken设计可以评价指标和因素间的非线
性关系，使用方便，条件预测性好，对实验影响因素的研
究较为全面［8］。本文拟采用直接紫外分光光度法［9］测
定总蒽醌含量，以乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因
素，在单因素实验的基础上，采用响应面试验设计法对
拳参总蒽醌的超声提取工艺进行优化。
1 仪器与试剂
UV － 2550 紫外可见分光光度计(日本岛津公司) ，UV
probe紫外工作站，KQ － 5200 型超声波清洗器(40 kHz，
200 W，昆山超声仪器有限公司) ，0412 － 1 型高速离心机
(上海手术器械厂) ，BS110S 电子分析天平(北京赛多利
斯天平有限公司) ，DHG － 9035 热风循环烘箱(上海林频
仪器设备有限公司)。拳参购自杭州双龙药店(批号:
20110625) ，并经中药鉴定教研室俞冰副教授鉴定为 Po-
lygonum bistorta L．，1，8 －二羟基蒽醌对照品(批号:0829
－ 9702)购自中国药品生物制品检定所。95%乙醇为分
析醇，水为纯化水。
2 方法与结果
2． 1 总蒽醌的含量测定
2． 1． 1 溶液的制备 对照品溶液的制备:精密称取干燥至
恒重的 1，8 －二羟基蒽醌对照品 2． 655 mg，置 25 mL 容量
瓶中，加 95%乙醇至刻度，得含 1，8 － 二羟基蒽醌 0． 106
mg /mL的对照品溶液，备用。
供试品溶液的制备:精密称取干燥至恒重的拳参药材
粗粉 0． 5 g，至具塞锥形瓶中，加入乙醇超声提取(具体料液
比、乙醇浓度与提取时间按照单因素考察要求及响应面试
验设计选择) ，3000 r /min离心 15 min，精密吸取上清液 0． 1
mL于 25 mL量瓶中，用 95%乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
2． 1． 2 检测波长的确定 根据文献报道［9］，对照品 1，8 －
二羟基蒽醌在(222 ± 3)nm 波长范围内具有最大吸收，常
见的含蒽醌化合物的植物中药中，在此波长范围内也会产
生最大吸收。本文据此建立拳参中总蒽醌的直接 UV 测定
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DOI：10.13193/j.archtcm.2013.02.186.yangxl.052
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法。
取供试品溶液与对照品溶液各约 4 mL，以 95%乙醇为
空白对照，于 200 ～ 400 nm波长范围内对各溶液进行扫描，
见图 1，由图 1 可知，1，8 －二羟基蒽醌的最大吸收波长为
224 nm，拳参样品的最大吸收波长为 219 nm，实验选择 224
nm作为检测波长。
S1 －对照品溶液 S2 －拳参供试品溶液
图 1 对照品和拳参药材的紫外吸收光谱图
2． 1． 3 方法学考察 (1)线性关系考察:精密量取对照品
溶液 0． 20、0． 40、0． 60、0． 80、1． 00、1． 20 mL分别置于 25 mL
量瓶中，95%乙醇定容至刻度，摇匀，以 95%乙醇溶液为空
白对照，于 224 nm波长处测定其吸收度，以浓度 X 为横坐
标，吸光度 Y 为纵坐标得直线回归方程:Y = 166． 21X +
0. 003，r = 0． 9995。结果表明，在 0． 85 ～ 5． 09 μg /mL 范围
内，吸光度与浓度呈良好的线性关系。
(2)精密度试验:精密吸取对照品溶液 0． 5 mL，置 25
mL量瓶中，加 95%乙醇至刻度，摇匀，于 224 nm 波长处连
续测定 6 次，吸光度的 RSD为 0． 69%。结果表明该方法精
度良好。
(3)稳定性试验:取同一供试品溶液 4 mL，分别于 0、
2、4、8、12、24 h，于 224 nm波长处测定吸光度，RSD为 1． 05
%，表明样品在 24 h内稳定。
(4)重复性试验:取同一批拳参药材 6 份，分别按
“2. 1． 1”项下方法制备供试品溶液，于 224 nm 波长处测定
吸光度，结果 RSD为 0． 77 %。表明该方法的重复性好。
(5)加样回收率试验:精密称取已知总蒽醌含量的拳
参药材粗粉 9 份，每份约 0． 1 g。分别精密加入 1，8 －二羟
基蒽醌对照品相当于药材中总蒽醌含量的 80%、100%、
120%，按“2． 1． 1”项下方法制备供试品溶液，于 224 nm 波
长处测定吸光度，计算加样回收率，结果平均回收率为
99. 29%，RSD为 1． 78%(n = 9) ，表明符合要求。
2． 1． 4 总蒽醌的含量测定 取供试品溶液 4 mL，按“2． 1．
3(1)”方法测定吸收度，由回归方程计算总蒽醌的含量。
2． 2 提取工艺的单因素考察
2． 2． 1 乙醇浓度对总蒽醌提取率的影响 固定料液比1∶
30(W ∶ V) ，提取时间 20 min，取拳参粗粉 0． 5 g 分别加入
70%、75%、80%、85%、90%浓度的乙醇进行超声提取，按
“2． 1”方法测定总蒽醌含量。结果如图 2，可知随着乙醇浓
度的增大，总蒽醌提取率升高趋势，但浓度继续增大后，提
取率反而下降。
图 2 乙醇浓度对提取率的影响
图 3 提取时间对多糖提取率的影响
图 4 料液比对提取率的影响
2． 2． 2 提取时间对总蒽醌提取率的影响 固定料液比1∶
30(W ∶ V) ，乙醇浓度 80 %，拳参药材粗粉分别超声提取
10、15、20、25、30 min，按“2． 1”方法测定总蒽醌含量。结果
如图 3 所示，提取时间的延长，总蒽醌提取率不断升高，达
到 20 min之后逐渐趋于平缓。原因可能是由于提取时间
过长使蒽醌分子在超声波的剪切作用下发生破坏和分解，
从而影响了提取率。
2． 2 ． 3 料液比对总蒽醌提取率的影响 固定提取时间
20 min，乙醇浓度 80%，拳参药材粗粉分别按 1 ∶ 20，1 ∶
25，1 ∶ 30，1 ∶ 35，1 ∶ 40(W ∶ V)的料液比进行超声提取，
结果如图 4 所示，随着料液比的增加，蒽醌的提取率上
升，但继续增加容积比例后提取率逐渐趋于平缓并有下
降趋势。原因可能是:提取溶剂越大，细胞内外的浓度
差越大，内扩散的速度也越大，有利于蒽醌的溶出，但继
续增加溶剂后溶出浓度就会平衡，此时若再增加溶剂就
会产生稀释效果。
2． 2． 4 提取工艺的响应面分析法优化 根据 Box －
Benhnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验影响
结果，选取乙醇浓度、提取时间和料液比作为影响拳参总蒽
醌提取率的 3 个因素进行试验设计［10 － 11］。在单因素试验
的基础上采用 3 因素 3 水平响应面分析方法进行试验设
计，3 个因素分别以 A、B、C 表示，每个自变量的低、中、高
水平分别以 － 1、0、1 进行编码，以拳参总蒽醌的提取率作
为响应值，因素水平设计见表 1，响应面分析方案及试验结
果见表 2。
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表 1 响应面分析因素与水平
水平 A乙醇浓度(%) B提取时间(min) C料液比(g /mL)
－ 1 70 20 1 ∶ 25
0 75 25 1 ∶ 30
1 80 30 1 ∶ 35
表 2 响应面分析试验方案及试验结果
试验号 A B C 响应值(%)
1 － 1 1 0 2． 437
2 1 0 1 1． 985
3 1 － 1 0 1． 196
4 0 1 － 1 2． 403
5 － 1 0 － 1 2． 568
6 0 0 0 2． 319
7 0 0 0 2． 351
8 0 － 1 1 2． 727
9 0 0 0 2． 405
10 1 0 － 1 1． 749
11 － 1 － 1 0 2． 085
12 0 － 1 － 1 2． 192
13 0 0 0 2． 306
14 0 1 1 3． 217
15 － 1 0 1 3． 127
16 1 1 0 2． 969
17 0 0 0 2． 265
注:共有 17 个实验，其中 12 个为析因实验，5 个为中心实验以
估计误差。
采用 Design Expert 7． 0 软件对表 2 结果进行响应面回
归分析后，得到回归拟合方程:
Y = 2． 33 － 0． 29A + 0． 35B + 0． 27C + 0． 36AB －
0. 081AC + 0． 070BC － 0． 22A2 + 0． 06B2 + 0． 25C2
并作回归方程显著性检验及方差分析，结果见表 3。
表 3 拳参总蒽醌醇提回归分析结果
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 显著性
A 1 0． 67 0． 67 7． 53 P ＜ 0． 05
B 1 1． 00 1． 00 11． 19 P ＜ 0． 05
C 1 0． 57 0． 57 6． 44 P ＜ 0． 05
AB 1 0． 50 0． 50 5． 66 P ＜ 0． 05
AC 1 0． 026 0． 026 0． 29 P ＞ 0． 05
BC 1 0． 019 0． 019 0． 22 P ＞ 0． 05
A2 1 0． 20 0． 20 2． 23 P ＞ 0． 05
B2 1 0． 015 0． 015 0． 17 P ＞ 0． 05
C2 1 0． 25 0． 25 2． 85 P ＞ 0． 05
回归 3 0． 61 0． 20 74． 46 P ＜ 0． 01
误差 4 0． 011 0． 00274
总和 16 3． 87
由表 3可知，回归方程具有显著性，说明该模型与实验
拟合较好;方程中所有一次项与部分二次项对拳参总蒽醌的
提取得率有显著性影响，可知试验因子对响应值的影响不是
简单的线性关系。其中，乙醇浓度(A)、提取时间(B)及料液
比(C)均对拳参总蒽醌提取率有显著性影响。分别作各因
素相应的两两交互等值线图和响应面图，结果见插页ⅩⅥ图 5
～10。
采用 Design Expert 7． 0 软件对回归方程进行分析，获
得理论最佳超声提取工艺为:乙醇浓度 73． 48%，浸提时间
29． 78 min，料液比 1 ∶ 34． 89(W ∶ V)。在此条件下，拳参总
蒽醌提取率的理论值为 3． 272%。综合考虑实际操作的简
便，确定最佳提取工艺为:乙醇温度 73%，提取时间 30 min，
料液比 1 ∶ 35。按最佳工艺进行验证性实验，测定实际提取
率为 3． 03%，RSD = 0． 66%，证明该工艺稳定，重现性好。
3 结论与讨论
目前，总蒽醌的测定普遍采用经典的比色方法，该法由
于操作烦琐，影响因素较多，实际操作不便。本文采用直接
UV法，具有前处理简便、操作容易、定量效果好等特点，可
作为拳参总蒽醌含量的测定方法。
传统的提取工艺优化方法往往采用正交设计实验方法
或均匀设计实验法［12 － 13］。这两种方法均可同时考虑几种
因素，寻求工艺最佳的因素水平组合，但两者均无法给出因
素和响应值之间明确的函数表达式(回归方程) ，因而无法
找到因素的最佳组合和响应值的最优值［8］。响应面分析
方法是通过中心组合实验研究几种因素间交互作用的一种
回归分析方法，能够精确确定提取工艺的最佳点，并能从图
形分析寻求最优实验考察因素值［10 － 11］，具有试验次数少、
周期短，求得的回归方程精度高等优点，对于非线性影响因
素的预测指导性更强，具备较好的推广应用价值。本文采
用响应面分析法对拳参总蒽醌的提取工艺进行了优化，实
验所确定的最佳提取工艺具有提取得率高、操作简便且成
本低等特点，可作为拳参总蒽醌类有效成分的产业化生产
提供实验参考。
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