全 文 ：3 　讨论
在温里药的研究中 ,张明发等认为吴茱萸 、花
椒 、干姜 、丁香 、荜澄茄 、白胡椒均以抗胆碱样作用和
抗组胺作用抑制肠管活动〔4〕 。临床上高良姜可应
用于消化性溃疡〔5〕 、腹痛〔6〕 、胃脘痛〔7〕、胆囊炎〔8〕等
消化道疾病 ,且经研究证实其有效成分高良姜黄酮
对肠管活动有显著的抑制作用〔9〕 。
实验表明 ,高良姜超临界萃取物对于新斯的明
造成的肠推进功能亢进小鼠有明显的抑制作用 ,但
对正常小鼠的肠推进功能却有显著性的促进作用 ,
这种调节作用也体现在大鼠回肠蠕动实验中 。小鼠
肠推进实验主要体现了药物对肠平滑肌纵行推进的
作用;而用贴壁压敏传感器主要检测回肠环行肌收
缩强度的变化 ,本文在实验中选取峰值作为观测指
标 ,能够较好地反映大鼠回肠环行肌收缩和舒张对
应力传感器带来的影响;肠管悬吊法试验则可能较
综合地体现药物对环行肌和纵行肌的影响。肠推进
实验是对清醒动物进行的 ,肠管悬吊法试验和压敏
传感器测压法需要对动物进行麻醉和手术 ,各有其
优点和缺陷。但都从不同角度提示高良姜超临界萃
取物可能对动物在体肠道平滑肌有影响 。从药物能
抑制新斯的明所致的肠道平滑肌的兴奋 ,提示药物
可能有拮抗毒蕈碱型胆碱受体的作用 。
参 考 文 献
1 　江苏医学院.中药大辞典.下册.上海:上海人民出版
社 , 1997∶1907
2 　徐叔云 ,等主编.药理实验方法学(第三版).北京:人民
卫生出版社 , 2002∶1311
3 　陈奇主编.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版
社 , 1996∶338
4 　张明发 ,等.温里药抑制离体肠管活动的机理探讨.陕
西中医 , 1985 ,(5)∶25
5 　庞宁海.中药和甲氰咪胍治疗消化性溃疡的近期疗效
观察.北京医学 , 1987 ,(5)∶308
6　王静安.散寒行气治疗小儿腹痛 58 例.四川中医 ,
1997 , 15(7)∶42
7 　荀斌 ,等.胃安康汤治疗胃脘痛 100 例.中国中医药信
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8 　李晓鸣 ,等.温中健脾法治疗慢性胆囊炎 66 例.河南中
医药学刊 , 1997 , 12(4)∶40
9 　吴清和 ,等.高良姜有效部位筛选.新中医 , 2000 , 32(6)
∶31
(2004-03-29收稿)
用血清药理学方法观察毛茛提取液对家兔
主动脉平滑肌细胞内钙的影响
蔡　飒1　李校 2
(1.广东药学院药学系 ,广州 510224;2.暨南大学医药生物技术研究开发中心 ,广州 510630)
　　摘要　目的:观察毛茛提取液含药血清对培养家兔主动脉平滑肌细胞内游离钙浓度的影响 。方法:体外培养
家兔主动脉平滑肌细胞(VSMC), 用荧光指示剂 INDO-AM 负载细胞 , 灌胃给予不同浓度药物 ,观察不同稀释浓度
含药血清及不同时相药物血清对由 NE 诱导细胞内游离钙浓度([ Ca2+] i)增加的影响。结果:毛茛提取液各含药血
清组均能降低由 NE诱发的细胞内[ Ca2+] i的升高。结论:毛茛提取液含药血清能减少 VSMC 细胞内[ Ca2+] i。
关键词　毛茛提取液　血管平滑肌细胞　血清药理学　细胞内游离钙
　　毛茛(Ranunculus japonicus Thumb),别名鱼疗
草 、野芹菜 ,为毛茛科毛茛属植物 。全草含毛茛苷 ,
其苷元为原白头翁素(Protoanemonin , C5H4O2)〔1〕 。
国内外研究证明〔2〕 , 毛茛乙醇提取物能对抗支气
管 、回肠 、子宫平滑肌 、膀胱逼尿肌的收缩作用 ,但关
于其对血管的作用及作用机理方面的研究较少。本
课题选用毛茛乙醇提取液(Ex tract f rom Ranunculus
japonicus Thumb , ERj),在前期完成的离体和在体
血管平滑肌实验已肯定其舒张血管作用的基础上 ,
运用血清药理学方法观察该药物血清对体外培养主
动脉平滑肌细胞内游离钙的影响 。
1 　材料
1.1 　实验动物　家兔由贵阳医学院实验动物中心
提供。合格证号为 SCXK(黔)2002-0001。
1.2 　药品　毛茛提取液(ERj):由暨南大学医药生
物技术研究开发中心提供。取干品毛茛全草100 g ,
加 300 ml 70%乙醇 ,浸泡 1 h ,回流提取 2 h ,滤过 ,
滤渣再加70%乙醇200 ml回流提取1 h ,滤过 ,合并
·741·中药材第 27 卷第 10期 2004 年 10 月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2004.10.018
两次滤液 ,回收乙醇 ,并浓缩至 100 ml ,冷藏 ,备用 。
1.3 　试剂　DMEM 培养基(GIBCO 公司 , USA);
INDO-1-AM(美国 Sigma 公司 ,用 DMSO 溶解 IN-
DO 粉配成浓度为 103 μmol/L 的母液 Ⅰ ;用 Hepes
液将母液 Ⅰ配成浓度为 10 μmol/L 的母液 Ⅱ , -
20℃冻存备用)。
1.4 　仪器　SW-CJ-2FD净化工作台(苏州净化设
备有限公司);CK30细胞培养用显微镜(日本奥林
巴斯公司);CO2 培养箱 (美国 Fo rma 公司);
960MC/960CRT 型荧光分光光度计(上海分析仪器
总厂)。
2 　方法
2.1 　含药血清的制备　取家兔 4只 ,体重为 2.0±
0.1 kg , 3只分别每日给予 ERj 20.8 g/kg 、10.4 g/
kg 、5.2 g/kg 高 、中 、低三个剂量 ,用蒸馏水配成不
同浓度 ,以 5 ml/kg 分两次灌胃 ,另一只每日给予等
量生理盐水作为对照 。连续给药 3天。于末次给药
后 1 h 、2 h 、3 h ,心脏采用 ,无菌分离血清 ,经 56℃,
30 min灭活处理 , -20℃冰箱保存备用 。
2.2 　VSMC 的培养　取家兔 ,体重 2.0±0.5 kg ,
无菌条件下取胸主动脉 。剔除外膜及附着组织 ,无
菌棉签刮去内皮细胞 ,将中膜平滑肌剪切成 1 ～ 2
mm3组织小块。采用贴壁组织块法和酶消化法结
合的培养方法 ,向组织块中加入 0.15%胰酶作用 25
～ 30 min ,2000 r/min离心 5 min ,弃上清液 ,重复 3
次。再加入含 20%小牛血清的 DMEM 培养液 ,并
直立放置于 CO2 培养箱(持续通入 95%O2 +5%
CO2 ,37℃恒温 ,湿度保持 85%～ 95%)中 2 h ,待组
织块贴壁 ,将培养瓶倒转平放 。之后根据瓶中培养
液颜色变化进行换液 。用倒置显微镜观察 ,抗肌动
蛋白免疫细胞化学染色鉴定。
2.3 　细胞悬液的制备及含药血清毒性的测定　细
胞长满层后 ,用 0.125%胰酶消化 。加入含 5%小牛
血清的培养液吹打使细胞悬浮 ,细胞数调成 1 ×
109/L ,台盼蓝染色显示细胞存活率 85%～ 95%,备
用。灭活血清采用对倍稀释法按一定浓度比例(即
1/5 , 1/10 ,1/20 ,1/40 ,1/80 ,1/160 ,1/320)将细胞接
种在 96孔细胞培养板 ,每一浓度组 8孔 ,连续观察
5天 ,注意细胞生长变化情况 ,根据结果设定含药血
清终浓度。5天后 ,7 个浓度组细胞均生长良好 ,未
见细胞变形 、皱缩 、脱落死亡。故认为以上几个血清
浓度对细胞无毒性 ,并将实验时含药血清终浓度选
为 10%。
2.4 　VSMC内[ Ca2+] i的测定　细胞传代时 ,均匀
接种至24孔培养板中 ,每孔培养基总量为 2 ml。按
下述分组孵育细胞 72 h 后 ,弃培养液 ,加入胰酶消
化 。Hepes液涮洗并悬浮细胞 ,调整细胞数为 2.5×
109/L。从中取 1 ml细胞悬液 ,加入 INDO-AM 母
液 Ⅱ100μl ,使其终浓度为 1μmol/L ,37℃恒温水浴
20 min ,期间反复振摇 。负载染料后 ,离心(1500 r/
min ,10 min),弃上清液 ,用 Hepes液洗尽染料。最
后用 2.5 ml Hepes液悬浮细胞 ,细胞数为 1×106/
ml。365 nm 紫外光为 INDO-1激发光 ,在未与钙结
合时 INDO-1发射波长为 485 nm ,结合钙后改变为
405 nm ,未刺激前先测定 405 nm处荧光强度 1 min
以获得稳定基线 ,然后加入 NE(10-6mol/L), 1 min
后动态记录 405 nm 处荧光强度变化 10 min , 即
[ Ca2+] i反应曲线 ,再经 Mias图像分析系统软件处
理计算出曲线下积分面积 ,减去基线下面积即代表
了完整的[ Ca2+] i反应过程 。
2.4.1 　同一时相不同剂量药物血清对 VSMC 内
[ Ca2+] i增加的影响:取2 h时相血清分为4组:ERj
含药血清高 、中 、低 3个剂量组和空白血清组。分别
加入 VSMC 培养板 ,每组 8孔 ,各组血清终浓度为
10%。作用时间 72 h 。
2.4.2 　高剂量组不同时相药物血清对 VSMC 内
[ Ca2+] i增加的影响:分为 4组 ,即高剂量组末次给
药后 1 h 、2 h 、3 h 3 个时相的药物血清共 3 组及空
白血清组。每组 8孔 ,血清终浓度及作用时间同上。
2.4.3 　不同稀释浓度药物血清对 VSMC 内
[ Ca2+] i增加的影响:取高剂量组 2 h时相血清分为
4组:药物血清终浓度分别为 5%、10%、15%、20%
共 4 组;空白血清终浓度分别为 5%、10%、15%、
20%共 4组 ,分别作用于 VSMC ,每组 8孔 ,孵育 72
h 。
2.4.4 　统计处理:实验中各项数据均以 x ±s表
示 ,行方差齐性检验后 ,用 t检验比较各组间差异 。
3 　结果
3.1　同一时相不同剂量药物血清对 VSMC(内
[ Ca2+] i增加的影响　以 10%含药血清温育细胞 ,
与空白血清组比较 ,三个剂量组均能减少所测定的
钙释放曲线下面积(P <0.05 ,P <0.01)。并随剂量
的增加 ,作用相应增强 。见表 1。
3.2 　高剂量组不同时相药物血清对 VSMC 内
[ Ca2+] i增加的影响　高剂量各时相组药物血清均
能抑制由 NE 诱导的钙释放 ,其中以 2 h 时相药物
血清作用较强(P<0.05 ,P<0.01)。见表 2。
3.4 　不同稀释浓度药物血清对 VSMC 内[ Ca2+] i
增加的影响　用含 5%、10%、15%、20%高剂量 2 h
药物血清的培养液温育细胞 ,与以相同浓度正常血
·742· 中药材第 27 卷第 10 期 2004年 10 月
清温育细胞相比较 ,四个浓度可不同程度地对抗内
钙的释放(P <0.05 , P <0.01),且有浓度依赖性(r
=0.897 ,P <0.05),其中以 20%的含药血清作用最
为理想 ,见表 3。
　表 1　　　同一时相不同剂量药物血清对 VSMC
内[ Ca2+] i增加的影响(n=8 , x±s)
Group Dosage(g/ kg) SerumConcentration Area under curves(cm2)
Control 10% 9.65±0.40
ERj 5.2 10% 8.48±0.41＊
10.4 10% 6.75±0.24＊＊
20.8 10% 4.52±0.33＊＊
　　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs the cont rol
　表 2　　　高剂量组不同时相药物血清对 VSMC
内[ Ca2+] i增加的影响(n=8 , x±s)
Group
Serum
Concentration
A rea under curves(cm2)
Control 10% 9.98±0.32
1(1h) 10% 5.79±0.26＊
2(2h) 10% 4.81±0.35＊＊
3(3h) 10% 6.06±0.18＊
　　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs the cont rol
　表 3　　　不同稀释浓度药物血清对 VSMC内
[ Ca2+] i增加的影响(n=8 , x±s)
Serum
Concentration
Area under curves(cm2)
Control ERj
5% 9.84±0.39 6.56±0.19＊
10% 9.89±0.28 5.15±0.18＊
15% 9.95±0.16 4.55±0.23＊＊
20% 10.10±0.14 4.39±0.21＊＊
　　＊P<0.05 , ＊＊P<0.01 vs the cont rol
4 　讨论
机体内血管平滑肌的过度收缩会导致许多心血
管疾病的发生。对血管平滑肌而言 ,其收缩的产生
与细胞内游离钙的关系尤为密切。当细胞受到刺激
时 ,Ca2+可通过不同途径进入细胞质 ,使[ Ca2+] i迅
速升高 ,最终引起平滑肌的收缩;而当[ Ca2+] i降低
后 ,平滑肌将发生相应的舒张〔3〕。
实验中我们采用钙荧光指示剂 INDO-AM 负载
体外培养的 VSMC 来直接动态地观察细胞内
[ Ca2+] i的变化情况 。由于研究药物为中药 , 成分
复杂 ,其本身的理化性质及杂质成分会对细胞的生
存环境造成一定的影响〔4〕。且中药多是通过口服
发挥作用 。因而我们应用了中药血清药理学研究方
法〔6〕 ,它可在某种程度上克服中药本身理化性质等
因素对实验结果的干扰 ,不仅反映药物中可吸收部
分的直接作用 ,也可反映药物在机体作用下形成的
代谢物和药物诱生的机体内源性物质的间接结果 ,
真实地反映药物在体内的实际作用〔6〕 。本次实验
含药血清在制备过程中 ,对动物的选择 ,为尽量保证
物种与人类生物学特性相近似〔7〕 ,同时兼顾与体外
培养细胞一致 ,我们选用家兔来制备含药血清。给
药方式上 ,我们对“通法”〔4〕进行适当调整 ,确定末
次给药后 1 h 、2 h 、3 h为采血时间。给药剂量上 ,采
用公式:给药剂量=在体试验的给药剂量×反应系
统中被稀释的倍数 ,并进行适当调整选择了高 、中 、
低三个剂量组 。对于血清的处理和使用 ,为减少血
清的非药理性干扰和降低微生物感染机率〔8、9〕 ,对
其进行了灭活处理;且均使用新灭活及保存时间较
短的含药血清以防止其在保存过程中有效成分发生
变化〔6〕 。同时严格设立空白血清对照组 ,以排除空
白血清本身活性对实验结果的影响 。实验结果显
示 ,ERj三个动脉剂量组 ,均能降低由 NE 诱发的
VSMC内[ Ca2+] i的升高 。大剂量组药物血清以
5%、10%、15%、20%浓度温育细胞后 ,其作用有随
浓度增加而增强的趋势 ,而空白血清对细胞内的
[ Ca2+] i无明显影响。高剂量组 1 h 、2 h 、3h 三个时
相采集的血清均能明显抑制细胞内[ Ca2+] i ,其中细
胞对 2 h药物血清作用较强。由此看出 ,药物血清
中确实是受试药物在起作用 ,而不是血清中其他物
质产生的效应 ,并且此药物成分口服有效 。
至于 ERj是通过哪一条途径或多种途径增加
平滑肌细胞内 Ca2+来发挥效应 , 待进一步研究确
定 。同时 ,药物所发挥的作用是经过体内复杂的代
谢过程产生的 ,其具体的有效成分也需深入的实验
研究来明确 。
参 考 文 献
1　熊辅信 , 编著.中药现代研究荟萃.昆明:云南科技出版
社 , 2002 , 5∶158
2 　蔡幼清摘译.毛茛对大鼠子宫和豚鼠气管的解痉作用
[英] .国外医学中医中药分册 , 1999 , 21(5)∶31
3 　刘景生主编.细胞信息与调控.北京:北京医科大学中
国协和医科大学联合出版社 , 1998∶168
4 　李仪奎.中药血清药理学实验方法的若干问题.中药
新药与临床药理 , 1999 , 10(2)∶136
5 　Sureda FX , et al.Measurement in rat cerebellar neurons by
flow cytometry.Mitochondrial membane potential , 1997 ,
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6 　包金凤 ,等.中药血清药理学的方法学研究概述.药学
进展 , 2000 , 24(2)∶89
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7 　刘平 , 等.关于血清药理学的若干思考.中国中西医结
合杂志 , 1999 , 10(5)∶263
8 　刘成海 , 等.抗肝纤维化有效中药复方血清药理学方法
探讨.中药实验方剂学杂志 , 1996 , 2(2)∶16
9 　彭智聪 ,等.中药血清药理学实验方法研究进展.中国
实验方剂学杂志 , 2001 , 7(2)∶57
(2004-03-16收稿)
The Effect of the Extract from Ranunculus japonicus on [ Ca2+] i inside Rabbit
VSMC by Serologic Pharmacological Test
Cai Sa1 , Li Xiaokun2
(1.Department of Pharmacy , Guangdong College of Pharmacy , Guang zhou 510224;2.Biopharmaceutical Research &Development
Center of Jinan University , Guang zhou 510632)
Abstract　Objective:To observe the influence of serum containing the ex tract from Ranunculus japonicus (ERj)on the amount
of [ Ca2+] i inside vascular smoo th muscle cells(VSMC).Methods:Serum containing ERj was prepared by serum pharmacolog ical
method.Cultured VSMCs induced by NE were treated with the serum , and the influence of it on the amount [ Ca2+] i inside cells in-
dicated with INDO-AM was determined.Results:The serum containing ERj could markedly decrease the increase of the amount of
f ree [ Ca2+] i induced by NE in cultured VSMC.Conclusion:The serum containing ERj could decrease the intracellular [ Ca2+] i.
Key words　Ex tract from Ranunculus japonicus Thumb;Vascular smooth muscle cell;Serum pharmacology;I ntracellular free
[ Ca2+] i
地龙提取物对大鼠深Ⅱ度烫伤创面愈合的影响
章　梅　李　旭　叶　蜂　刘　佚　邱根全
(西安交通大学第一附属医院 ,西安 710049)
　　摘要　目的:探讨地龙提取物在深Ⅱ度烧伤创面愈合中作用。方法:采用大鼠深Ⅱ度烫伤模型 , 创面应用地龙
提取物软膏 、类肝素软膏 , 观察其对大鼠深Ⅱ度烫伤早期创面病理变化和创面愈合的影响 , 并测定了烧伤创面含水
量 、血浆和烧伤创面抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ), 纤维蛋白降解产物(FDP)含量 , 烧伤创面羟脯氨酸含量 、Ⅰ/ Ⅲ型胶原比
例 ,真皮细胞增殖周期及创面愈合时间。结果:创面外用地龙提取物可以降低烧伤创面水肿程度 ,增加血浆 AT-Ⅲ
活性 ,增加烧伤创面 FDP 含量 ,增加真皮细胞中 DNA合成 , 减轻烧伤创面早期加深 ,缩短大鼠深 Ⅱ度烧伤创面愈合
时间。结论:地龙提取物具有促进大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合的作用。
关键词　烧伤　抗凝血酶活性　FDP　羟脯氨酸
　　深 Ⅱ度烧伤创面存在着早期损害继续发展 ,导
致烧伤深度加深的现象〔1〕。众多研究结果提示烧
伤后凝血-纤溶系统变化等因素与组织的继发性损
害有关〔2 、3〕 。中药地龙性咸寒 ,具有清热 、定惊 、平
喘 、通络 、活血之功效 。《本草纲目》记载:地龙能治
疗溃烂口舌糜疮 ,临床上常用来治疗烧烫伤 、下肢溃
烂等多种疾病〔4〕。地龙能减少渗出 ,缩短炎症期 ,
具有促进创面愈合的功效〔5〕 。同时地龙提取物具
有纤溶酶原激活作用〔6〕 ,本研究拟对地龙促进大鼠
深Ⅱ度烫伤创面愈合作用进一步研究。
1 　材料与方法
1.1 　地龙提取液的制备及试剂　原药材购于北京
朝阳蚯蚓养殖场 ,为正蚯蚓科爱胜属赤子爱胜蚯蚓
(Lumbricidae Eisemia Foetida),取鲜药材 ,吐泥 ,洗
净泥沙 ,制成匀浆 ,放置24 h ,离心过滤除菌 ,得黄色
提取液 ,浓度为 5%(按投料量计算),PH 为 4.0 ,加
基质软膏制成地龙提取物软膏 。类肝素软膏(德国
路易坡大药厂),批号:20021112 。
1.2 　动物分组及模型制作　清洁级 SD大鼠 ,体重
200～ 250 g(第四军医大学实验动物中心)。2.5%
戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(35 mg/kg),脱毛 ,次
日同方法麻醉 ,背部置于 80℃水温中烫 6 s ,面积约
10%TBSA ,制成深Ⅱ度烫伤模型 ,经病理证实 ,伤后
立即腹腔内注射乳酸林格氏液 5 ml。烫伤后大鼠
随机分成:①地龙组(70只),创面外用地龙软膏 ,厚
度 0.5 ～ 1.0 mm ,每日换药一次 ,缝合固定;②类肝
素组(70只),创面外用类肝素软膏 ,厚度 0.5 ～ 1.0
mm ,每口换药一次 ,缝合固定;③烧伤模型组(70
只),创面外用基质软膏 ,条件同上。另设正常对照
组 8只 ,不烫伤。于烧伤后 6 、24 、48 、72 h 及 5 、7 、
·744· 中药材第 27 卷第 10 期 2004年 10 月