全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１１（２０）：１２４～１２７
第一作者简介：刘洁（１９８６－），女，河北保定人，在读硕士，研究方向
为城市林业。Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｄｌｊ．１９＠１６３．ｃｏｍ。
责任作者：王志刚（１９５６－），男，河北高阳人，教授，博士生导师，现
主要从事城市林业和森林保护的教学与研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｚｈｇ
＠ｍａｉｌ．ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
收稿日期：２０１１－０７－１８
锦带花ＩＳＳＲ－ＰＣＲ 反应体系的建立与优化
刘 洁，王 志 刚，聂 庆 娟，阎 爱 华
（河北农业大学 林学院，河北 保定０７１０００）
摘 要：以锦带花幼叶为试材，提取锦带花基因组的ＤＮＡ，并对其纯度、浓度进行检测，建立
适合锦带花的ＩＳＳＲ－ＲＣＲ反应体系。结果表明：ＤＮＡ扩增效果良好，完全能满足进一步试验的需
要。同时对锦带花ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中各个影响因素进行优化，建立了适合锦带花ＩＳＳＲ分子
标记的最佳反应体系，即在２０μＬ的反应体系中，含稀释浓度为３倍的ＤＮＡ模板，０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ
ｄＮＴＰ，稀释１０倍体积高保真ＰＣＲ缓冲液含（Ｍｇ２＋）３．０μＬ；１．００μｍｏｌ／Ｌ引物，１．２５ＵＴａｑ酶。
扩增程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５２．０℃退火４５ｓ，７２℃延伸１．５０ｍｉｎ，４５个循环；最
后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。应用该ＩＳＳＲ体系对３份锦带花种质进行了扩增，证实了该体系的
适用性和稳定性。
关键词：锦带花；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ；建立；优化
中图分类号：Ｓ ６８５．９９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１１）２０－０１２４－０４
锦带花（Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ （Ｂｕｎｇｅ））属于忍冬科
（Ｃａｐｒｉｆｏｌｉａｃｅａｅ）锦带花属（Ｗｅｉｇｅｌａ），主要分布在黑龙
江、辽宁、河北、山东、山西和江苏等地区。中医理论认
为锦带花有清热解毒、活血止痛的功效，主要用于瘟病
初起、头疼咽干、喉痹、痈肿疔疮、丹毒、感冒发热等
症［１］。锦带花花期较长，花朵盛开之时正值春花凋谢、
夏花稀少之际，花色艳丽繁多，成为东北、华北等地重
要的早春观赏植物，在园林上应用较为广泛。锦带花
对酸还有一定的抗性，是优良的抗污染灌木。
目前为止，人们对锦带花各方面的研究还很少，只
在育种和栽培技术上有所研究，在分子方面的报道尚
为空白。基因组ＤＮＡ提取是植物分子标记技术的基
础工作，提取的基因组ＤＮＡ质量至关重要，它直接影
响到后续试验的进行。花里因含有大量的多糖、酚类
和单宁等次生代谢物质［２］，在ＤＮＡ的提取过程中不易
提纯，使得锦带花ＤＮＡ提取变得较为困难，质量较低，
难以满足进一步分子生物学研究的需要。该试验采用
试剂盒提取基因组ＤＮＡ，获得的ＤＮＡ可用于满足该
试验的要求
。
ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔａｇｅ ｏｆ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｏｆ Ｔｏｒｅｎｉａ
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Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｅａｆ ｏｆ Ｔｏｒｅｎｉａ ｂａｉｌｏｎｉ
ＷＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｈｕａ１，ＣＨＥＮ Ｘｉｏｎｇ－ｗｅｉ １，ＣＨＥＮ Ｇａｎｇ１，ＪＩＮ Ｈｏｎｇ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈａｏｑｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｏｑｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２６０６１；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ
Ｆａｉｒｙｌａｋｅ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８００４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｕｌｙ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｌｅａｆｓ ｏｆ Ｔｏｒｅｎｉａ ｂａｉｌｌｏｎｉ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ＭＳ ａｓ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ ａｄｄｉｎｇ ｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ０．０１，０．０５，０．１ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ ａｎｄ ＣＰＰＵ，ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ＴＤＺ ａｎｄ ＣＰＰＵ ｏｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ
ｂｕｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ
ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ ｗｅｒｅ ＭＳ＋ＴＤＺ ０．１ｍｇ／Ｌ ａｎｄ ＭＳ＋ＣＰＰＵ ０．０５ｍｇ／Ｌ，ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｒａｔｅ ｗａｓ １００％．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ｒｏｏｔｉｎｇ ｗａｓ １／３ＭＳ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｏｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ １００％．Ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ
９０％ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｉｎｔｏ ｓｏｉｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｏｒｅｎｉａ ｂａｉｌｌｏｎｉ；ｌｅａｆ；ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄｓ；ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
４２１
北方园艺２０１１（２０）：１２４～１２７ ·生物技术·
ＩＳＳＲ（简单重复序列间隔区，Ｉｎｔｅｒ－Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔ）是由Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ等于１９９４年创建的一种简单
序列重复区间扩增多态性的分子标记［３］。ＩＳＳＲ具有
操作简单、标记重复性好、稳定程度高、多态性丰富、
ＤＮＡ用量少、成本低等优点。ＩＳＳＲ标记已广泛地用
于遗传多样性、品种鉴定、系统发育、基因定位、分子标
记育种等方面［４］。由于该技术通常为显性标记，且具
有很好的稳定性和多态性［５］，在对绝大多数缺乏遗传
学研究背景的植物遗传多样性水平评价中，ＩＳＳＲ发挥
着极为重要的作用［６－７］，近年来在作物ＤＮＡ标记上也
得到较多应用［８］。因而是一种非常理想的用于构建
ＰＣＲ为基础的分子图谱的分子标记技术。它是根据植
物中广泛存在ＳＳＲ的特点，利用ＳＳＲ本身设计引物，
不需预先克隆和测序。
试验对影响锦带花ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增反应的各个参
数进行优化，建立适合锦带花的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，
为应用ＩＳＳＲ分子标记技术进行锦带花种质资源研究、
分子育种等创造条件。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
河北农业大学校园内有３种锦带花，分别为红王
子锦带（Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ ｃｖ．Ｒｅｄ Ｐｒｉｎｃｅ）、花叶锦带
（Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａｃｖ．Ｖａｒｉｅｇａｔａ）和锦带花，２０１０年５～
７月从校园内采集叶片，于－７０℃冰箱中保存备用。
引物序列参照加拿大哥伦比亚大学ＵＢＣ公布的ＩＳＳＲ
引物序列设计，引物序列由上海生工合成，Ｔａｑ 酶、
ｄＮＴＰ、ＤＬ ２ ０００ｍａｒｋｅｒ等其它试剂均购自北京索莱
宝有限公司。
１．２ 试验方法
１．２．１ 基因组ＤＮＡ的提取 取锦带花叶片约０．２～
０．３ｇ置于预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨，重复几
次至研成发白的粉末，然后转移至１．５ｍＬ离心管中，
按照北京索莱宝有限公司的基因组ＤＮＡ提取试剂盒
说明书进行操作。用１％琼脂糖凝胶电泳检测基因组
ＤＮＡ，通过核酸蛋白检测仪测定ＤＮＡ浓度，剩余的
－２０℃保存备用。
１．２．２ 引物筛选 所用ＩＳＳＲ的成套引物参照加拿大
Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ大学提供的引物序列，由上海生工公
司合成。用１００种ＩＳＳＲ引物进行ＰＣＲ扩增，对引物
进行初筛，即用一个模板对所有引物进行筛选，然后再
用已经筛选出来的引物进行复筛以确定最佳引物。
ＰＣＲ反应体系为：扩增程序参照张雷凡等［９］方法并稍
作修改，扩增程序为预变性９４℃５ｍｉｎ，变性９４℃
３０ｓ，退火５２℃４５ｓ，延伸７２℃９０ｓ，３８个循环；７２℃最
后延伸５ｍｉｎ；扩增后４℃保存。ＰＣＲ产物在１．０％琼
脂糖凝胶上电泳分离，Ｇｏｌｄｅｎｖｉｅｗ染色显带，紫外光下
凝胶成像系统观察并成像。
１．２．３ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立 以红王子锦带为
试材，筛选出一个最佳引物后，参照贺学勤等［１０－１１］的
ＩＳＳＲ扩增及检测方法，采用正交实验设计，对影响
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的５个影响因子各设置４水平进
行考察（表１）。根据正交设计表Ｌ１６（４５）设计试验（表
２），筛选试出优化组合，建立适宜ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的反应
体系。
表１ 试验设计因素和水平
水平 ＤＮＴＰｓ／ｍｍｏｌ·Ｌ－１ １０×Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋） 引物／μｍｏｌ·Ｌ－１ Ｔａｑ酶／Ｕ·μＬ－１ ＤＮＡ模板／ｎｇ·μＬ－１
１ ０．１５ １．５ ０．４ １．２５ １０
２ ０．２０ ２．０ ０．６ １．５０ ２０
３ ０．２５ ２．５ ０．８ １．７５ ３０
４ ０．３０ ３．０ １．０ ２．０ ４０
表２ 正交实验表Ｌ１６（４５）
水平 ｄＮＴＰｓ／ｍｍｏｌ·Ｌ－１ 引物／μｍｏｌ·Ｌ－１ １０×Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋） Ｔａｑ酶／Ｕ·μＬ－１ ＤＮＡ模板／ｎｇ·μＬ－１
１ ０．１５ ０．４０ １．５０ １．２５ １０
２ ０．１５ ０．８０ ２．００ １．５０ ２０
３ ０．１５ １．００ ２．５０ １．７５ ３０
４ ０．１５ １．２０ ３．００ ２．００ ４０
５ ０．２０ ０．４０ ２．００ １．７５ ４０
６ ０．２０ ０．８０ １．５０ ２．００ ３０
７ ０．２０ １．００ ３．００ １．２５ ２０
８ ０．２０ １．２０ ２．５０ １．５０ １０
９ ０．２５ ０．４０ ２．５０ ２．００ ２０
１０ ０．２５ ０．８０ ３．００ １．７５ １０
１１ ０．２５ １．００ １．５０ １．５０ ４０
１２ ０．２５ １．２０ ２．００ １．２５ ３０
１３ ０．３０ ０．４０ ３．００ １．５０ ３０
１４ ０．３０ ０．８０ ２．５０ １．２５ ４０
１５ ０．３０ １．００ ２．００ ２．００ １０
１６ ０．３０ １．２０ １．０ １．７５ ２０
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·生物技术· 北方园艺２０１１（２０）：１２４～１２７
２ 结果与分析
２．１ 锦带花基因组ＤＮＡ的提取与检测
采用试剂盒快速提取锦带花样品基因组的ＤＮＡ，
通过核酸蛋白检测仪测得其含量为６０ｎｇ／μＬ，ＯＤ２６０／２８０
为１．８～２．１，ＯＤ２６０／２３０为２．１～２．２，均符合该试验的
ＤＮＡ要求。取适量ＤＮＡ溶液在１％琼脂糖胶电泳，
结果见图１，通过后面ＩＳＳＲ扩增表明，该试验提取的
ＤＮＡ可用于满足ＩＳＳＲ的要求。
图１ 锦带花基因组ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳
注：泳道１、２、３分别为同一ＤＮＡ样品的３个重复。
２．２ 使用引物
用上述ＤＮＡ模板初步筛选，得到较好引物，引物序
号分别为 ＵＢＣ８１１、ＵＢＣ８１５、ＵＢＣ８２０、ＵＢＣ８２７、ＵＢＣ８３５、
ＵＢＣ８４１、ＵＢＣ８４４、ＵＢＣ８４７、ＵＢＣ８４８、ＵＢＣ８５０、ＵＢＣ８５１、
ＵＢＣ８５４、ＵＢＣ８５７、ＵＢＣ８６２，其序列及退火温度见表３。
表３ 使用引物信息
序号 引物 序列 退火温度／℃
１ ＵＢＣ８１１ ｇＡｇ ＡｇＡ ｇＡｇ ＡｇＡ ｇＡｇ ＡＣ ５４．５９
２ ＵＢＣ８１５ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ Ｔｇ ５４．５９
３ ＵＢＣ８２０ ｇＴｇ ＴｇＴ ｇＴｇ ＴｇＴ ｇＴｇ ＴＣ ５４．５９
４ ＵＢＣ８２７ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ Ｃｇ ５４．５９
５ ＵＢＣ８３５ ＡｇＡ ｇＡｇ ＡｇＡ ｇＡｇ ＡｇＡ ｇＹＣ ５６．１６
６ ＵＢＣ８４１ ｇＡｇ ＡｇＡ ｇＡｇ ＡｇＡ ｇＡｇ ＡＹＣ ５６．１６
７ ＵＢＣ８４４ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＲＣ ５６．１６
８ ＵＢＣ８４７ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＲＣ ５６．１６
９ ＵＢＣ８４８ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＲｇ ５６．１６
１０ ＵＢＣ８５０ ｇＴｇ ＴｇＴ ｇＴｇ ＴｇＴ ｇＴｇ ＴＹＣ ５６．１６
１１ ＵＢＣ８５１ ｇＴｇ ＴｇＴ ｇＴｇ ＴｇＴ ｇＴｇ ＴＹｇ ５６．１６
１２ ＵＢＣ８５４ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＣＲｇ ５６．１６
１３ ＵＢＣ８５７ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＹｇ ５６．１６
１４ ＵＢＣ８６２ ＡｇＣ ＡｇＣ ＡｇＣ ＡｇＣ ＡｇＣ ＡｇＣ ６１．８６
再用这１４条引物进行复筛，结果见图２，从右边数依次
为１～１４号，９号最为清晰且多态性高，为最佳引物。
图２ 用同一模板进行引物筛选确定最佳引物
注：泳道１～１４号分别为表３中的引物。
２．３ ＩＳＳＲ反应体系的建立
利用上步筛选出的最佳引物 ＣＡＣ ＡＣＡ ＣＡＣ
ＡＣＡ ＣＡＣ ＡＲｇ进行正交实验，按照表１、２配体系，取
１０μＬ ＰＣＲ扩增产物点样从右向左依次标为１～１６
号，在含Ｇｏｌｄｅｂｖｉｅｗ的１．０％琼脂糖凝胶上电泳，在稳
流１００ｍＡ，电压１５０Ｖ下跑电泳约４０ｍｉｎ，以ＤＬ ２０００
为分子量标记，电泳结束后经凝胶成像系统扫描见图
３，第７泳道多态性最佳，且最清晰。
图３ 正交实验设计电泳
注：泳道１～１６号分别为正交实验表２中不同水平的反应结果。
２．３．１ 模板 模板浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响，不
同浓度得到的结果差异较大。通过核酸蛋白检测仪测
得其含量为６０ｎｇ／μＬ，在２０μＬ体系中ＤＮＡ模板浓度
分别进行６、３、２、１．５倍稀释，浓度分别为１０、２０、３０、
４０ｎｇ／μＬ，观察电泳图谱，１、８、１０、１５泳道（均为１０ｎｇ／
μＬ），条带几乎不出，虽然１５泳道出现条带，但只有１
条比较亮，故模板浓度太低不行，随着模板浓度增加，
扩增的ＤＮＡ条带亮度有所增加，１１泳道（４０ｎｇ／μＬ）
条带很亮但是重叠在一起不清晰。因此，锦带花ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ扩增模板用量选为稀释３倍，即２０ｎｇ／μＬ。
２．３．２ 酶 酶在ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中是最主要的
影响因素，直接影响扩增的结果。并不是使用高浓度
的Ｔａｑ酶就能产生好的试验结果，观察图谱，４、６、９、１５
泳道均为２Ｕ的Ｔａｑ酶浓度，但这４个泳道均不理想，
浓度太低产物的合成效率下降，也不能使试验正常进
行，通常使用１Ｕ的浓度，该试验设定１．２５Ｕ，效果良
好。由图２可知，７处理中，酶用量较少且条带清晰，因
此１．２５Ｕ为锦带花合适的酶用量。
２．３．３ １０×Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋） １０×Ｐｆｕ ＰＣＲ
Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋）与Ｔａｑ酶配套使用，按照使用说明，与酶
用量一一对应，优化的ＰＣＲ缓冲体系使酶的作用发挥
最大功效，使ＰＣＲ反应即使在很低的起始模板量下也
能够得到有效扩增。使用该品进行ＰＣＲ扩增调节镁
离子浓度等对ＰＣＲ条件进行优化，以筛选出针对于特
定ＰＣＲ反应的最佳ＰＣＲ ｂｕｆｅｒ。
２．３．４ 引物 引物浓度过低，与模板结合位点少扩增
条带弱；过高的引物浓度产生非特异性扩增和引物二
聚体的形成，从而影响扩增效果。该试验采用０．４０、
０．８０、１．００、１．２０μｍｏｌ／Ｌ ４个不同引物浓度，由图２可
知，引物浓度在１．０～１．２都比较合适，考虑试验成本，
酶浓度定为为１μｍｏｌ／Ｌ。
２．３．５ ｄＮＴＰｓ ｄＮＴＰｓ是ＰＣＲ扩增反应的原料，必
须达到一定的浓度才能满足要求，但过高也会与Ｔａｑ
酶竞争 Ｍｇ２＋，对扩增不利。该试验采用０．１５、０．２０、
０．２５、０．３０ｍｍｏｌ／Ｌ ４个ｄＮＴＰｓ浓度，由图２可知，５～
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北方园艺２０１１（２０）：１２４～１２７ ·生物技术·
７、１４～１６泳道的扩增条带较清楚，５～７泳道的浓度为
０．２ｍｍｏｌ／Ｌ，１４～１６泳道的浓度为０．３ｍｍｏｌ／Ｌ，后者
并不比前者好，为了试验成本考虑，故选用ｄＮＴＰｓ的
浓度为０．２ｍｍｏｌ／Ｌ。
综上所述，７泳道是最优反应体系。即在２０μＬ
的反应体系中，含稀释浓度为３倍的 ＤＮＡ 模板，
０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，稀释１０倍体积高保真ＰＣＲ缓冲
液含（Ｍｇ２＋）３．０μＬ；１．００μｍｏｌ／Ｌ 引物，１．２５ Ｕ
Ｔａｑ酶。
３ 讨论
３．１ 关于锦带花基因组ＤＮＡ提取质量
花里含有多酚等，因此不易提纯，使用试剂盒可以
避免这一问题。
３．２ ＩＳＳＲ体系建立中的问题
影响ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的因素较多，主要因子
为模板浓度、引物、ｄＮＴＰｓ以及Ｔａｑ酶等。设计正交
实验对这些影响因素进行筛选，得到最优反应体系，并
且通过各个单因素分析验证了正交实验结果的正确
性。此外，反应扩增程序也是影响试验的重要条件，根
据忍冬科植物的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应扩增程序［１２］，并且结
合筛选出的引物的退火温度进行摸索，设定反应温度
分别为５１、５２、５３、５４、５５、５６℃，循环数设定为３５、３８、
４２、４５、４８个，结果只有循环数达到４５个循环才能扩增
出稳定条带，温度５２℃时最好，可能是锦带花的ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ扩增片段比较小，必须增加循环数才能跑出稳定
条带，筛选出的引物退火温度均在５４～６０℃，最佳引物
在５６℃左右，根据这个温度进行试验，结果５２℃时效
果最好，温度太高太低均不能扩增出条带。
总之，通过对ＩＳＳＲ体系各影响因子的优化研究，
处理７为比较好的组合，即在２０μＬ的反应体系中，含
稀释浓度为３倍的 ＤＮＡ模板，１０×Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｂｕｆｅｒ
（Ｍｇ２＋）３．０μＬ，０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１．００μｍｏｌ／Ｌ引
物，１．２５ＵＴａｑ酶。锦带花在分子方面的研究为空白，
没有什么遗传背景，故该试验采用ＩＳＳＲ分子标记，这
是一种拥有通用引物的分子标记方法。建立并优化该
反应体系为今后的锦带花的遗传多样性的研究奠定基
础，该试验属于分子方面的基础试验。
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Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ
ＬＩＵ Ｊｉｅ，ＷＡＮＧ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ，ＮＩＥ Ｑｉｎｇ－ｊｕａｎ，ＹＡＮ Ａｉ－ｈｕａ
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ，Ｈｅｂｅｉ ０７１０００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｗｅｒｅ
ｔｅｓｔｅｄ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ ｗｅｒｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＤＮＡ
ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｗｅｌ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｆｕｌｙ ａｂｌｅ ｔｏ ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｄｅｍａｎｄ ｏｆ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ，ｉｍｐａｃｔｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉ－ｍｉｚｅｄ，ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ．Ｔｈａｔ ｗａｓ ｉｎ ２０μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｗｉｔｈ ３ｔｉｍｅｓ ｏｆ ｄｉｌｕｔｉｏｎ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，０．２０ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ，１０×Ｐｆｕ ＰＣＲ Ｂｕｆｅｒ（Ｍｇ２＋）３．０μＬ，１．００μｍｏｌ／Ｌ ｐｒｉｍｅｒａｎｄ ａｎｄ １．５０ＵＴａｑ
ｅｎｚｙｍｅ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｗａｓ：５ｍｉｎｕｔｅｓ ａｔ ９４℃ｆｏｒ ｐｒｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎ ｆｏｌｏｗｅｄ ｂｙ ４５
ｃｙｃｌｅｓ，ｅａｃｈ ｗｉｔｈ ３０ｓｅｃｏｎｄｓ ａｔ ９４℃ｆｏｒ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，４５ｓｅｃｏｎｄｓ ａｔ ５２．０℃ｆｏｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ，１．５０ｍｉｎｕｔｅ ａｔ ７２℃ｆｏｒ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ｆｉｎａｌｙ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｔ ７２℃ｆｏｒ ５ｍｉｎｕｔｅｓ ａｎｄ ｈｏｌｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ａｔ ４℃．Ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｗｅｉｇｅｌａ ｆｌｏｒｉｄａ；ＩＳＳＲ－ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
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