全 文 ：!!年第 # 卷第 # 期
紫花茄!$%&’()* +(,+-)* ./是一种传统中药#
含有丰富的甾体皂苷$0%& 根和全草有散瘀止痛#清肝
明目的功效’可治咽喉炎(淋巴结炎(跌打(风湿痛(
咳嗽& 根据紫花茄中分离出的四种甾体皂苷结构化
中国肿瘤临床
合成紫花茄皂苷诱导人肝癌 !#$%&’(细胞凋亡 !
!!!!!!!马 朋! 顾国锋 陈 希 赵 翔 杜宇国 张 页
!!北京大学医学部细胞生物学系 !北京市 01#
摘要 目的! 探讨合成紫花茄皂苷对 23.456! 细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用! 方法! 采用酸性磷酸酶
787#法$吖啶橙荧光染色法和流式细胞术检测合成紫花茄皂苷对人肝癌 23.456! 细胞增殖的影响以及诱导细胞
凋亡的作用! 利用蛋白印迹法检测药物作用后凋亡相关蛋白 8798 的表达水平! 结果! 合成紫花茄皂苷对人肝癌
23.456! 细胞有明显的增殖抑制作用%其 5!: 的 ;<=为 6/!!>$*&!荧光显微镜下细胞呈现典型的凋亡形态! 流式细
胞术分析发现%细胞经皂苷作用 ?:$0!: 和 !6: 后%凋亡率显著增加! 蛋白印迹检测结果显示%合成紫花茄皂苷作用
后肿瘤细胞内的 8798 蛋白被剪切%2-&4! 蛋白的表达量下调! 结论!合成紫花茄皂苷对人肝癌细胞的增殖抑制呈浓
度相关性%具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用%且这一作用可能与 2-&4! 表达下调有关!
关键词 紫花茄 薯蓣皂苷 细胞凋亡
中图分类号!9%&!’% 文献标识码!7 文章编号!04105@((!#(#)(*+,)(!
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! 本文课题受国家自然科学基金资助!编号)###?@
在读研究生 # 中国科学院生态环境研究中心
!论 著!
*+,* *
中国肿瘤临床 !! 年第 # 卷第 # 期
学合成的紫花茄皂苷及其结构类似物进行了活性筛
选!对其中活性较好稳定性较高的皂苷即!$%$木
吡喃糖基$#&!#$$%$’$鼠李吡喃糖基$#&!!$&$
!$%$半乳吡喃糖基薯蓣苷进行了细胞增殖抑制和
诱导凋亡活性的研究’ 本文报告合成紫花茄皂苷对
()’$*+!细胞的凋亡诱导结果’
! 材料与方法
&,& 皂苷及试剂
合成紫花茄皂苷由中国科学院生态环境中心生
物技术室合成提供!-./0$&1+ 培养基购自 23456
公司!7889:38 #细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝
赛公司!羊抗鼠及羊抗兔单克隆抗体 0;2$<-.为中
山公司产品!.7-. 单克隆抗体为 =>8?> @ABC公司产
品兔抗人 >5?38单克隆抗体为 D96E>AF9A公司产品’
&,! 细胞培养
人肝癌细胞 ()’$*+! 由本实验室保存! 以含
&G新生牛血清&H$EI 青霉素&$;$EI 链霉素
的 -./0$&1+ 培养基!置 #*JKG@L!饱和湿度条
件下培养!常规消化传代’
%&’ 酸性磷酸酶法(>53M NO6PNO>?>P9 >PP>Q!7.7$%&
检测细胞存活率
取对数生长期细胞消化后!制成细胞悬液按 &R
&# S孔的密度接种于 T1 孔板!培养 !+O 后实验组加
入!先用二甲基亚砜(%/=L$溶解!再经 -./0$&1+
培养液稀释至终浓度为 &U&$;$() 的皂苷) 对照组
加入 -./0$&1+ 培养液)溶剂对照组加入经同样稀
释的溶剂!含 ,&GU,&G %/=L)阳性对照组加入
终浓度为 ,KU+$;$()的顺铂’ 实验中每个浓度设 V
个平行孔! 作用 *!O 后用 7.7 法经 )’#&& 酶联免
疫检测仪在 +K8E 波长处测定吸光度 7 值!空白孔
调零!实验重复三次!取平均值’ 按下列公式计算细
胞生长抑制率*生长抑制率(G$W(&$实验组平均 7
值 S对照组平均 7值$R&G’
%&* 细胞形态学观察
人肝癌 *+! 细胞按 &R&+$EI 接种于 !+ 孔板!
孔中预先放入圆形盖玻片’ 加入皂苷作用 &!O+!+O
后!取出盖玻片!经固定后吖啶橙染色 %’&!荧光显微
镜 (D3F68 LN?3NO6?$ 下观察并用美国 0E>;9.A6.IBP
图像分析系统记录图像’
%&! 流式细胞仪检测
以浓度为 K$;$()&$;$() 的皂苷处理 *+! 细
胞! 在 1O&!O!+O 后收集药物处理组和对照组细
胞! 采用北京宝赛生物技术有限公司的 7889:38#
细胞凋亡检测试剂盒! 按试剂盒提供的方法进行
7889:38#$.0 染色!经 X7@P5>8 流式细胞仪((95?68
%35F38P68$’=-!H=7$检测细胞凋亡率’
&,1 Y9P?9A8 (I6?检测凋亡相关蛋白的表达
皂苷处理细胞 !+O和 +VO后收集药物处理组和
对照组细胞!# A S E38 离心 &KE38!预冷 .(= 洗涤
& 次后!加人 ! 倍体积细胞裂解液%KEE6I$+ ZA3P,
<@0(N< V,$!&KEE6I$’ D>@I!,&G=%=!&G D.+!
&$;$() ./=X!&$;$() ’9BN9N?38!&$;$() 7NA6[
?3838&! 冰上裂解 #U1E38!+J!&! A S E38 离心
&E38!取上清进行蛋白质定量%*&’ 蛋白质等量样品
与 !R=%= 凝胶加样缓冲液 %&EE6I$+ ZA3P,<@I
(N<1,V$!!EE6I$+ %ZZ!+,G =%=!,!G溴酚蓝 !
!G甘油& 混合均匀! 煮沸变性 KE38!&G =%=$
.72) V\ 电泳 +O! 然后 !!E7 恒流 !O 电转移至
硝酸纤维素膜上丽春红 = 染色 &E38 以观察各电泳
带蛋白质量是否一致’ KG脱脂奶粉 Z(=Z(Z]998
! S Z(=$缓冲液室温封闭 !O!分别用抗 (5I$! 单抗
(&* K$抗 .7-. 单抗(&* K$抗 >5?38 单抗 (&*
!$室温孵育 &O’Z(=Z洗涤 !E38!然后与结合有
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠及山羊抗兔 0;2
(&* &$室温孵育 &O!Z(= 洗涤 !E38!应用 =B[
N9A=3;8>I Y9P? .356 @O9E3IBE389P598? =B4P?A>?9
(.39A59 产品$法检测!硝酸纤维素膜加检测液显色
&E38!^胶片曝光显影%!&’
! 结果
&% 合成紫花茄皂苷对 ()’$*+! 细胞增殖的抑
制作用
实验表明! 合成紫花茄皂苷对 ()’$*+! 细胞
的增殖有明显抑制作用! 皂苷作用细胞 *!O的效果
与剂量有关!见表 &’ 以 &!+1V&$;$()皂苷作
用 ()’$*+! 细胞 *!O! 对细胞生长的抑制率分别
是 #!,#G #1,G +1,!G T!,&G T*,TG TV,#G !0@K
值为 +,!$;$()’
表 ! 合成紫花茄皂苷对 #$%&’() 细胞的增殖抑制活性
!!
!,! 细胞形态学观察
皂苷作用 ()’$*+! 细胞 &!O 和 !+O 后! 细胞
体积缩小!细胞核染色质浓缩致密!经吖啶橙染色!
荧光显微镜下可见细胞核或细胞质内有致密浓染的
紫花茄皂苷的量($;$EI$ 7+K8E值 抑制率(G$
空白对照 ,&*-._,&,’- ,
%&, ,&’*‘,&,*’/ ’&’
/ 与空白对照比较*#0,&,,% *均为 . 个独立试验的均值
&, ,&’,1‘,&,*!/ ’1&,
*&, ,&!-‘,&,*’/ *1&
1&, ,&,’.‘,&,%/ #&%
.&, ,&,%,‘,&,,’/ #-&#
%,&, ,&,,.‘,&,,/ #.&’
*., ,
!!年第 # 卷第 # 期
表 ! 合成紫花茄皂苷对 #$%&’(! 细胞凋亡率的影响
!!
!$% 凋亡相关蛋白的影响
空白对照组检测到的 &&!’( 的 )*+, !-(./
012*34)*+,540634!)60)蛋白#经阿霉素和紫花茄合
成皂苷作用 !%7 和 %87 后 # 被剪切为 &&!’( 和
89’($ 与空白对照组比较#两者均使凋亡相关蛋白
:;+/!的表达水平降低#结果见图 $$
图 % 吖啶橙染色观察合成紫花茄皂苷对 &’(/)*+, 细胞的影响
黄绿色荧光呈团缩状或碎裂串珠状 !图 %:%<%(#
对照组细胞为均匀荧光!图 %-$
!$# 流式细胞术结果分析
空白对照组细胞中凋亡细胞含量较低# 而不同
浓度合成紫花茄皂苷作用不同时间后# 凋亡细胞和
坏死细胞百分率逐渐增高# 与相应时间的空白对照
组相比均有统计学意义!表 !#=$&#存在明显
的时间依赖性和浓度依赖性#见图 ,$
+ - #).+/>+.,+
! - #+.#!>+.+#0
0 与相应的空白对照比较& #1+.++%
!&均为 $ 个独立试验的均值
,.!/>+.$% +.$*>+.%,
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浓度
!!?25+
时间
!3
细胞比率!@!
存活细胞 凋亡细胞 坏死细胞
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合成紫花茄皂苷诱导人肝癌 :AB/C%!细胞凋亡 */$’ ’
中国肿瘤临床 !! 年第 # 卷第 # 期
图 流式细胞仪检测合成紫花茄皂苷对 $%&’()! 细胞的影响
图 $ *+,-+./ $01- 法检测合成紫花茄皂苷对 2342
和 $50’! 蛋白的影响
! 讨论
从植物中寻找抗肿瘤药物已成为国内外重要的
研究课题!近期调查显示植物类药在抗肿瘤药物市
场销售额中占首位 #%$! 本实验室利用 323 法以抑
制肿瘤细胞增殖为活性指标 对合成紫花茄皂苷进
行活性筛选确定出一些有较好生物活性和稳定性
具有深入研究价值的结构!
本文合成紫花茄皂苷即是其中之一! 323 法显
示合成紫花茄皂苷对 $%&’()! 细胞有明显的增殖
抑制活性且呈良好的量效关系!凋亡细胞形态学检
测结果显示 合成紫花茄皂苷作用后肿瘤细胞体积
变小细胞核固缩随着药物浓度的增加细胞核缩
小成斑块状或碎裂! 在流式细胞术实验中 采用
3//+67/!和 28 双染分析凋亡率可以将活细胞%凋
亡早期细胞%凋亡中期细胞和坏死细胞区分开#&$! 检
测结果显示随着药物浓度和作用时间的延长实验
组的细胞凋亡率逐渐增加 且细胞也从凋亡早期走
向凋亡中期和晚期!
目前认为 2342 蛋白的剪切是细胞凋亡的标
志! 2342 在维持 9:3 的完整性方面起着重要作
用 在 9:3 损伤部位扮演分子感受器的角色把
9:3 损伤的信息传递给参与 9:3 修复过程或改变
细胞周期的蛋白! 当 2342 被降解后便失去了对
9:3 完整性的监护作用结果使受 2342 负调控影
响的 ; ?@!=依赖性核酸内切酶活性增高裂解核
小体间的 9:3引起细胞凋亡#’A()$! $50’! 家族蛋白
在细胞凋亡调控中也扮演重要的角色! $50’! 是
$50’!家族中抑制凋亡亚家族典型代表#B(B*$!我们用
阿霉素作为凋亡诱导的阳性对照 表明在阿霉素作
用下 2342蛋白被剪切$50’!表达水平下调!
本文检测了 2342蛋白的变化情况 发现肿瘤
细胞经合成紫花茄皂苷作用 )CD 后 细胞内的
BB!E9的 2342蛋白被剪切成 CFE9的片段进一步
证实合成紫花茄皂苷具有诱导肿瘤细胞凋亡的活
性! 本文还检测了合成紫花茄皂苷对细胞内 $50’!
蛋白表达的影响 结果表明合成紫花茄皂苷下调了
$50’! 的表达水平 从而提示合成紫花茄皂苷诱导
细胞凋亡的作用可能是通过下调 $50’! 的表达来实
现的!
体外研究结果表明合成紫花茄皂苷具有强诱导
细胞凋亡的作用相比提取物成本低廉有望成为有
效的抗癌新药!
参考文献
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版! 北京科学出版社#$%%&!&&&’&%(
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药#-../#$.012//’/3
( 陈 罡#王晓冬 !细胞凋亡检测技术的进展*+,!国外医学分子生物
学分册#-../#-10-4$-1’$-&
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SB>># -..3# -$1Q-4$1%’$))
!-..3O$-O$(收稿
!-..1O.$O$1修回
!王展宏校对
合成紫花茄皂苷诱导人肝癌 $%&’()!细胞凋亡
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
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第四届海峡两岸肿瘤学术会议征文通知
由中国抗癌协会与台湾临床肿瘤医学会共同主办的第四届海峡两岸肿瘤学术会议将于 !#
年 $%月 !!!&日在云南省昆明市召开! 海峡两岸肿瘤学术会议旨在加强两岸从事肿瘤研究与临
床医务工作者的学术交流促进大陆与台湾肿瘤预防和诊治水平的整体发展!
海峡两岸肿瘤学术会议自 $’’’年在哈尔滨召开第一届会议以来 已先后在两岸成功地举办
了三届!会议已经成为两岸肿瘤学者进行临床和科研学术交流的重要平台两岸学者达成了每年一
次分别在大陆和台湾召开学术会议的共识! 现将征文注意事项通知如下#
一$ 征文内容#有关肿瘤的基础与临床应用研究的新成果和新进展! $$肿瘤靶向治疗%!$蛋白
质组学在肿瘤诊断治疗中的应用%&$肿瘤治疗中的新理论$新技术$新方法!
二$征文要求#$$论文必须未在国内外公开发表%!$论文摘要用中文书写字数()%% 字%应包
括目的$方法$结果$结论四方面内容* &$请务必注明拟参加交流的论文分类代码&口头$张贴$大会
交流’* +$ 论文提交方式#&,’ 建议用 -./0123 附件形式发送电子邮件至 4567869:;<=<=>
?86=>65@>&!’ 论文摘要和软盘邮寄至北京海淀区新洲商务大厦 )层 中国抗癌协会 张文英收
&$%%%&A’%软盘上请注明论文题目$作者姓名*&&’会议恕不接受传真件文稿!
三$ 联系地址及论文截稿时间# 北京海淀区新洲商务大厦 ) 层 中国抗癌协会 张文英收
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联系电话#%$%/))$#!$!$转 )%# 5B=8CD 4567869:;<=<=>?86=>65@
!%%#年 E月 &$日&以邮戳或电子邮件日期为准’
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