全 文 ：收稿日期:2008-03-28;　修订日期:2008-07-19
基金项目:国际科技合作计划项目(No.2007DFA40680)
作者简介:王庆敏(1982-),女(汉族),山东济宁人 ,现为中南大学化学化
工学院在读硕士研究生 ,学士学位 ,主要从事中药分析工作.
＊通讯作者简介:李晓宁(1974-), 男(汉族),河南长葛人 , 现为中南大学
化学化工学院副教授 ,博士学位 ,主要从事中药现代化和化学计量学研究
工作.
当归补血汤有效部位指纹图谱归属分析
王庆敏 , 李晓宁＊ ,王　兵 ,梁逸曾 ,黄　晔
(中南大学中药现代化研究中心 ,湖南 长沙　410083)
摘要:目的 分析当归补血汤的石油醚 、氯仿 、醋酸乙酯 、正丁醇部位的特征峰在复方全方及在单味药中的归属。方法
采用高效液相色谱法 ,色谱柱为 Shim-PackVP-ODS柱 , 250mm×4.6mmI.D.,流动相为甲醇 -水(梯度洗脱), 检测波
长为 280 nm,流速为 1 ml/min。结果 复方石油醚部位的 9个特征峰 5个来自当归 , 4个来自黄芪;氯仿部位的 9个特征
峰 6个来自黄芪 , 3个来自当归;醋酸乙酯部位的 11个特征峰 , 7个同时来自当归和黄芪 , 1个来自当归 , 3个来自黄芪;正
丁醇部位的 7个特征峰 , 6个同时来自于当归和黄芪 , 1个来自黄芪。结论 复方各部位的指纹图谱为阐明各部位的药效
物质基础提供科学依据 ,为下一步的临床应用以及新药的开发提供参考。
关键词:当归补血汤;　单味药;　有效部位;　指纹图谱;　高效液相色谱
中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2008)11-2658-03
TheFingerprintAnalysisofEffectivePartsofDangguibuxuetang
WANGQing-min,LIXiao-ning＊ , WANGBing,LIANGYi-zeng,HUANGYe
(ResearchCenterofModernizationofChineseHerbalMedicines, CentralSouthUniversity, Changsha410083,
China)
Abstract:ObjectiveTostudythecharicteristicpeaksofthechiefchemicalcomponentsofthepetroleumether, chloroform, ethlacetate, n-ButanolpartsofDangguibuxuetang(DBT).MethodsHPLCwasadoptedwithShim-PackVP-ODSaschromatographic
column, theMethanol-Waterwastakenasthemobilephase(gradientelution), thedetectivewavelengthwas280 nm, andthe
flowratewas1 ml/min.ResultsTherewereninepeaksinthepetroleumetherpartofDBT, fiveofwhichcamefromRadixAngeli-
casinensisandfourcamefromRadixAstragali.TherewereninepeaksinthechloroformpartofDBT, sixofwhichcamefromRa-
dixAstragaliandthreecamefromRadixAngelicasinensis.ItwasfoundthatofelevenpeaksintheethlacetatepartofDBT, one
wasoriginatedfromRadixAngelicasinensis, threewerefromRadixAstragali, andsevenwerefrombothRadixAngelicasinensis
andRadixAstragali.Itwasfoundthatofsevenpeaksinthen-butanolpartofDBT, oneoriginatedfromRadixAstragaliandsix
frombothRadixAngelicasinensisandRadixAstragali.ConclusionEverypartfingerprintofDBTishelpfultostatepharmacody-
namicmaterialfoundation.
Keywords:Dangguibuxuetang;　Singlemedicine;　Efectiveparts;　Fingerprint;　HPLC
　　中药有效部位可以在保留原方治疗优点的基础上提高中药
的作用强度 、临床药效以及质量控制水平 , 改变传统中药大 、黑 、
粗外观形象 , 是中药研究的又一新的发展点 [ 1] , 是研发中药二类
新药依据 [ 2, 3] , 也是从中药开发新药的第 3条途径 [ 4] 。王明军
等 [ 5]论述了中药有效部位研究的现状 、方法和手段 , 并阐明用中
药指纹图谱对中药提取物进行质量控制。
当归补血汤为中医经典名方之一 , 始载于李东垣的《内外伤
辨惑论》 ,按黄芪∶当归 =5∶1组成 ,具有补气生血等功效。对
该复方的 HPLC及 GC-MS实验研究表明当归补血汤成分极其复
杂 [ 6, 7];根据模型不同 , 不同部位可用于不同疾病的治疗 [ 8, 9] , 对
该复方某部位指纹图谱的研究也有报道 [ 10～ 12] 。为获得当归补血
汤各部位更全面的信息 , 本文建立了当归补血汤的石油醚 、氯仿 、
醋酸乙酯 、正丁醇部位的指纹图谱 , 并找到了这些部位的特征峰
在复方全方及在单味药中的归属 ,为各部位的药效物质基础的阐
明提供科学依据。
1　仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪(美国 Agilent公司);
G1315A型二极管阵列检测器。当归购自甘肃岷县 , 黄芪购自长
沙九之堂药店 ,经湖南省中医药研究院中药研究所鉴定。阿魏酸
与芒柄花素对照品(中国药品生物制品检定所提供), 甲醇为色
谱纯 , 水为二次去离子水 , 其余试剂为分析纯。
2　方法与结果
2.1　色谱条件 Shim-PackVP-ODS柱 , 4.6 mm×250 mmI.D.,
流动相组成:A相(H2O)和 B相(CH3OH), B相的体积分数在 0～ 10min为 1 % ～ 25 %, 10 ～ 20 min为 25% ～ 50%, 20 ～ 30min
为 50% ～ 70%, 30 ～ 50 min为 70% ～ 90%;流速 1.0 ml/min;柱
温为室温 25 ℃;检测波长 280nm。
2.2　供试品溶液的制备
2.2.1　当归补血汤复方全方的制备 称取黄芪和当归粉末(过
40目筛)各 8g, 1.6 g, 加 8倍量和 6倍量 70%的乙醇 ,分别回流
提取 2 h和 1 h, 将所得醇提物蒸干 , 残渣加甲醇溶解定容到
25 ml。
2.2.2　当归补血汤复方及单味药各有效部位的提取
复方有效部位的提取:分别称取黄芪和当归粉末(过 40目
筛)各 20, 4 g,加 8倍量和 6倍量 70%的乙醇 , 分别回流提取 2 h
和 1 h,将所得醇提物蒸干 , 残渣均匀分散于 48 ml水中 , 使其含
量为 0.5 g药材 /ml, 水溶液依次用同体积石油醚 、氯仿 、醋酸乙
酯 , 正丁醇各萃取 3次 ,各部位提取液蒸干 ,残渣加甲醇溶解定容
到 10ml, 即为复方的石油醚 、氯仿 、醋酸乙酯 、正丁醇部位。
单味药的有效部位的提取:分别称取黄芪 、当归粉末(过
40目筛)各 20 , 4 g, 同法操作 , 制备单味药黄芪 , 当归的相应
部位。
2.3　精密度实验 取 “ 2.2.1”项下样品 20 μl,按拟定方法连续进
样 6次 , 用 “中药指纹图谱相似度计算软件”计算 , 所得相似度为
0.997 5, 0.996 2, 0.997 6, 0.995 1, 0.988 0, 0.997 5, 相似度极
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高 , 说明供试品进样精密度良好。
2.4　重复性实验 按 “ 2.2.1”项下方法 , 平行实验 5次 , 分别取
20 μl, 按拟定方法进样 , 用 “中药指纹图谱相似度计算软件”计
算 , 所得相似度为 0.954 2, 0.993 2, 0.995 8, 0.994 3, 0.991 1,相
似度极高 , 说明方法的重复性良好。
2.5　稳定性实验 取同一复方供试液 20 μl分别在 0, 6, 12, 24,
48 h进样 5次的 , 用 “中药指纹图谱相似度计算软件”计算 ,所得
相似度为 0.982 0, 0.992 9, 0.983 8, 0.996 7, 0.994 2, 相似度极
高 , 说明 48 h内供试品溶液稳定性较好。结果表明样品指纹图
谱各色谱峰相对迁移时间和峰面积基本一致 , 相似度较高 , 符合
指纹图谱研究的技术要求。
2.6　供试品溶液的检测 取上述样品各 20 μl, 分别进样 , 阿魏
酸 、芒柄花素 、复方全方及复方单味药各部位的 HPLC指纹图谱
见图 1 ～ 6。主要特征峰峰面积百分含量见表 1。
表 1　样品主要特征峰峰面积相对百分含量 %
峰号 复方全方
复方石油醚
部位
复方氯仿
部位
复方醋酸
乙酯部位
复方正丁醇
部位 物质
1 0.81 1.18
2 12.12 7.29 31.38
3 5.58 2.85 11.57 3.78
4 2.61 6.96
5 2.41 1.26 5.42
6 3.87 6.96
7 7.76 16.96 30.30 阿魏酸
8 1.22
9 4.45 2.91 9.60 9.96 毛蕊异黄酮苷
10 0.41
11 3.13 4.52 3.82
12 2.06 1.99 9.47
13 0.60 1.81
14 16.32 5.51 41.19 6.53 毛蕊异黄酮
15 2.74 2.31 6.13
16 1.53 2.28 3.03 (3R)-7, 2-Dihydroxy-3,
4-dimethoxyisoflavan
17 0.24 0.89
18 7.33 7.98 14.58 1.83 芒柄花素
19 0.69 2.37 Z-藁苯内酯
20 10.58 54.61 E-藁苯内酯
21 0.70 4.39 2.90
22 0.93
a-阿魏酸　b-芒柄花素
图 1　标准品 HPLC图
图 2　复方全方 HPLC图
a-复方　b-黄芪　c-当归　　　
图 3　复方 、黄芪 、当归石油醚部位的 HPLC图
a-当归　b-复方　c-黄芪　　
图 4　当归 、复方 、黄芪氯仿部位的 HPLC图
a-黄芪　b-复方　c-当归　　　　
图 5　黄芪 、复方 、当归醋酸乙酯部位的 HPLC图
a-黄芪　b-复方　c-当归　　　
图 6　黄芪 、复方 、当归正丁醇部位的 HPLC图
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3　讨论
从图 2可以看出复方成分复杂 , 对响应值较大的 21个峰编
号分析 , 经阿魏酸与芒柄花素标准品(浓度均为 500 μg/ml)对
照 , 确认峰 7为当归中阿魏酸 , 峰 18为黄芪中芒柄花素。此外 ,
通过解析得到的光谱与文献 [ 13 , 14]对照(王平《黄芪当归复方的指
纹图谱及对兔肝纤维化的药理药效研究》 中南大学中药现代化
研究中心),对另外 5个峰初步定性为:峰 9:毛蕊异黄酮苷;峰
14:毛蕊异黄酮;峰 16:(3R)-7, 2-Dihydroxy-3, 4-dimethox-
yisoflavan;峰 19:Z-藁苯内酯;峰 20:E-藁苯内酯 。
3.1　对复方及单味药的石油醚部位的谱图分析 从图 3中可以
看出复方的石油醚部位的 9个特征峰 , 4个来自黄芪 , 5个来自当
归 , 即峰 14, 15, 16, 18来自黄芪 , 峰 22, 17, 19, 20, 21来自当归 ,以
20号峰(当归中 E-藁苯内酯)峰值最大为主要特征 , 从表 1看
出其峰面积百分含量为 54.61%,表明该部位提取出的是极性很
小的脂溶性物质。该部位中峰 22在复方全方中没找到 , 可能是
由于浓度原因:提取复方全方时 , 取 9.6 g药材提取液蒸干后 , 为
保证残渣的完全溶解 , 用甲醇溶解定容到 25 ml;而在提取有效部
位时 , 取 24克药材提取蒸干 ,石油醚萃取残渣水溶液后 ,石油醚
液蒸干 , 残渣用甲醇溶解定容到 10 ml,依此计算石油醚部位浓度
是全方的 6.25倍 , 浓度的增大使复方全方中没检测到的峰 22在
石油醚部位中出现。
3.2　对复方及单味药的氯仿部位的谱图分析 从图 4可以看
出 ,复方氯仿部位的 9个特征峰 , 6个来自黄芪 , 3个来自当归 ,
即峰 3, 9, 14, 15, 16, 18来自黄芪 , 峰 7, 11, 12来自当归。从表
1中看出该部位是 14号峰(黄芪中毛蕊异黄酮)和 18号峰(黄
芪中芒柄花素)峰值最大的部位 , 峰面积百分含量分别为 41.
19%和 14.58%, 表明该部位提取出的主要是黄芪中的黄酮类 ,
异黄酮类物质 ,以黄芪中毛蕊异黄酮和芒柄花素峰值较高为主
要特征。
3.3　复方及单味药中醋酸乙酯部位的谱图分析 从图 5可以看
出 , 复方该部位的 11个峰 , 7个同时来自当归和黄芪 , 1个来自当
归 , 3个来自黄芪 , 即峰 2, 3, 5, 11, 12, 13, 21同时来自当归和黄
芪 , 峰 7来自当归 ,峰 9, 14, 18来自黄芪 , 以 7号峰(当归中阿魏
酸)峰值最大为主要特征 ,其峰面积百分含量为 30.3%。复方醋
酸乙酯部位中峰 18(芒柄花素)在黄芪中的该部位中没有找到 ,
可能是黄芪中的成分比复方少很多 ,单味药黄芪中芒柄花素在用
氯仿提取时已完全提取出 , 而复方中成分较多 , 或者复方中其他
组分的影响不利于芒柄花素的提取 , 用氯仿没有完全提取出 , 因
而在复方醋酸乙酯部位中还有少量。同时当归中峰 20即 E-藁
苯内酯在复方醋酸乙酯部位中没有 , 却有少量在当归此部位 , 可
能是黄芪中的某组分能促进 E-藁苯内酯的提取 , 使其在复方的
氯仿部位中已完全提取出 , 因而在复方醋酸乙酯部位中没有
出现。
3.4　复方及单味药中正丁醇部位的谱图分析 为了清楚地显示
该部位的峰 , 取色谱峰流出的时间段 ,如图 5所示 , 该部位提取的
物质除峰 9, 14外 , 其余物质集中在保留时间段 0 ～ 15 min流出 ,
表明该部位提取的主要是极性较强的物质 ,以 2号峰峰值最大为
主要特征 , 其峰面积百分含量为 31.38%。该部位主要有 7个峰 ,
6个同时来自当归和黄芪 , 1个峰来自黄芪 ,即峰 1, 2, 3, 4, 5, 6同
时来自于当归和黄芪 ,峰 9来自黄芪 , 在黄芪的正丁醇部位峰 14
即毛蕊异黄酮 , 在复方中该部位中没有 , 原因可能类似于 “ 3.3”
中 E-藁苯内酯的溶出情况。
从表 1可以看出 ,当归中阿魏酸在复方全方 ,复方氯仿 ,复方
醋酸乙酯部位中均存在 , 其含量分别为 7.76%, 16.96%, 30.3%,
石油醚及正丁醇部位中却没有 , 判断阿魏酸肯定不溶于石油醚 ,
用氯仿萃取时 , 可能由于阿魏酸在氯仿中的溶解度较小 , 或者复
方其他物质的影响 , 不利于阿魏酸的完全溶出 ,即使用同体积的
氯仿萃取了 3次还是没能把它完全提取出 ,醋酸乙酯萃取时 , 该
物质完全萃取出了。表明阿魏酸主要集中在醋酸乙酯部位 ,该部
位则是与阿魏酸药效最相关的部位。除了阿魏酸还有其他物质
出现在不同的有效部位 , 其含量却有较大差别 ,这种现象可能是
由于用有机试剂萃取全方时难以完全把该物质萃取出 ,或者有机
试剂之间有影响 , 同一物质能溶于所选的不同试剂 , 但溶解情况
有较大差异 , 不同部位提取出的主要物质不同 ,将有不同的临床
疗效。
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