全 文 ：图 4　温度对酶活力的影响
Fig.4　Effect of temperature on enzyme activity
2.2.2　pH 对酶活力的影响
测定相同的酶在不同 pH 值(3.0 、3.8、4.8、5.8、6.8、7.8)
缓冲液体系中表现出来的酶活力值 ,结果表明该酶在 pH 值 4.
8 缓冲液体系中表现出来的酶活力值最高 , 当缓冲液 pH 值高
于 5.8 时酶活力下降 40%以上。结果见图 5。
图 5　pH 对酶活力的影响
Fig.5　Effect of pH on enzyme activity
2.2.3　金属离子对酶活力的影响
在酶活力测定过程中 ,向木聚糖溶液中加入 5mmol L的多
种金属离子 ,测定了这些金属离子对木聚糖酶酶解木聚糖过
程的作用效果 , 其中 Mg2+ 、Zn2+对酶有激活作用 , 而 Mn2+ 、
Cu2+ 、Hg2+则完全抑制酶的活性。结果见表 2。
2.2.4　酶的热稳定性
将酶液分别在 30～ 60℃每间隔 5℃条件下保温 60min , 冰
浴迅速冷却后测定残余的酶活力 , 结果表明低于 45℃稳定性
较好 , 50℃时残余酶活力 85%, 60℃时酶失活较快 , 残余活力
仅剩 40%,结果见图 6。
表 2　金属离子对酶活力的影响
Table 2　Effect of metal ions on enzyme activity
试剂(5mmol L)相对酶活力(%)试剂(5mmol L)相对酶活力(%)
对照 100 ZnCl2 106.7
MgSO4 114.3 CoCl2 45.0
MnSO4 0 CaCl2 60.9
K2HPO 4 98.4 SnCl2 17.4
Na2HPO4 23.1 FeSO 4 59.8
CuSO 4 0 HgCl2 0
图 6　酶的热稳定性
Fig.6　Enzyme stability in different temperature
3　结论
从自然界通过木聚糖酶解透明圈的方法 , 筛选得到一株
产木聚糖酶的黑曲霉菌株 , 通过发酵条件优化试验的研究 , 得
到了它对于产生木聚糖酶的最适固体发酵培养基的配料比
例 ,以及最适氮源 、最适发酵培养温度 、最佳产酶时间 , 获得了
5500 u g 固体干曲的高产酶水平。通过对酶作用的最适温度 、
最适 pH 条件 ,以及金属离子对酶活力的影响和酶的热稳定性
的研究 , 得到了酶的最适作用条件是 45℃、pH 值 4.8 , 表明该
酶是一种偏酸性酶。该酶在 45℃以下的温度保存对酶活力的
保持是有利的 ,Mg2+、Zn2+对该酶有激活作用 , 而 Mn2+、Cu2+、
Hg2+则完全抑制酶的活性。
参考文献:
[ 1] 石军 ,陈安国.木聚糖酶的应用研究进展[ J] .中国饲料 , 2002(4):10
-11.
[ 2] 侯炳炎.木聚糖酶及其应用[ J] .动物科学与动物医学 , 2002 , 19(4):
52-53.
产赤藓糖醇菌种的诱变育种
刘凤珠 ,张鑫(郑州轻工业学院食品与生物工程系 , 河南 郑州 450002)
摘要:以耐高渗酵母为出发菌株 , 采用紫外线诱变处理 , 得到了一株变异株 C1。其摇瓶发酵产赤藓糖醇 24.9g L左右。通过
摇瓶发酵试验 ,研究了菌株 C1 的遗传稳定性。研究结果表明 , 经多次传代实验 , 菌株 C1 的发酵产糖醇能力没有改变 , 表明其是
稳定的变异株。赤藓糖醇的产量由诱变前的 12.594g L提高到 24.943g L ,提高了 98.1%。
关键词:耐高渗酵母;赤藓糖醇;诱变育种
中图分类号:Q933　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2005)04-0022-02
Breeding of Erythritol Producing Strains by Mutagenesis of Ultraviolet Irradiation
LIU Feng-zhu ,ZHANG Xin
(Zhengzhou Institute of Light Industry , Zhengzhou 450002 , P.R.China)
Abstract:An osmophilic yeast as the original strain was treated with U.V..One mutant produced about 24.9g L erythritol in the shaking flask
was selected.The hereditary stability of the mutant C1was investigated in the shaking flask by pass-generatcan tests.The tests was showed that
the genetic property of this mutant was stable .The yield of erythritol was increased from 12.594g L to 24.934g L , increased by 98.1%.
Key words:osmophilic yeast;erythritol;mutation breeding
收稿日期:2005-02-15;修回日期:2005-06-01
攻关项目:河南省科技攻关项目(“高产赤藓糖醇产生菌的选育” ,编
号:0224350006)
作者简介:刘凤珠(1963-),女 ,郑州人 ,学士 ,副教授 ,研究方向:发酵
工艺。
　　赤藓糖醇是一种四碳糖醇 , 又名 1 , 2 , 3 , 4-丁四醇 , 在自
然界中分布十分广泛。赤藓糖醇是一种低热值的甜味剂 , 甜
度为蔗糖的 60%70%,具有其他多元醇所有的保健特性 , 如防
龋齿 、适宜糖尿病患者使用等[1] , 由于这些特点 , 赤藓糖醇可
用作佐餐及低热清凉的各式糖果 、糕点 、饮料等的甜味剂。
赤藓糖醇是许多微生物的代谢产物 , 他的工业化生产是
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生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
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以淀粉为原料 ,由耐高渗酵母经发酵而成的。日本在克服以
往赤藓糖醇发酵研究中的菌种耐糖性差 、发泡性强 、发酵产率
低以及副产品多等问题的情况下 , 率先实现了赤藓糖醇的工
业化生产[ 2] 。目前 , 国内这方面的研究刚刚起步 , 江苏省工业
微生物研究所选育出一株产生菌 , 在葡萄糖培养基中可产赤
藓糖醇[ 3] 。目前 , 选择适宜的育种方法 ,选育赤藓糖醇优良菌
株是生产的关键。
本文就从自然界分离筛选到的产赤藓糖醇的耐高渗酵母
为出发菌 ,经紫外线诱变处理 , 以期提高赤藓糖醇的发酵产
量。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种:本实验室从自然界分离的耐高渗酵母。
1.1.2　试剂:葡萄糖:天津市科密欧科技有限公司 , 酵母膏:北
京奥博生物技术有限公司 ,均为生化试剂。高碘酸钠:广东西
陇化工厂 ,变色酸:上海试剂三厂 ,均为分析纯。
1.1.3　仪器:721 型分光光度计(上海分析仪器厂)。
1.1.4　培养基:
①固体培养基:葡萄糖 20%, 酵母膏 0.5%, 琼脂 2%,
pH6.0。
②发酵培养基:葡萄糖 20%,酵母膏 0.5%, pH6.0。
1.2　方法
1.2.1　细胞悬液制备
自新鲜斜面挑取酵母菌一环接种于盛有 20mL发酵培养
基的 250mL三角瓶中 , 32℃摇床震荡培养 12 ～ 16h , 转速 150r
min。取发酵液 10mL , 3500 r min 离心 10min , 沉淀用无菌生理
盐水洗涤 2次 , 将菌体悬浮于 10mL无菌生理盐水中成细胞悬
液。取 0.5mL用无菌生理盐水适当稀释后用平板菌落计数法
测菌悬液浓度[ 4] 。
1.2.2　紫外线诱变
将菌悬液稀释成 106 ～ 107 个 mL 浓度 , 于 15W紫外灯下
照射 , 适当稀释数倍后 , 涂布于固体培养基平板上 , 避光于
32℃恒温培养 72h。
1.2.3　突变菌的筛选
挑取菌落大 、厚的菌株 , 在固体培养基平板上划线分离纯
化后编号 , 接种于斜面培养基 , 32℃培养 48h 后 , 在 25mL
250mL发酵培养基中接种一环 , 30℃、150r min 培养 3d ,按接种
量5%移种于 50mL 500mL发酵培养基中 , 32℃、150r min 培养
3d。测定赤藓糖醇含量。每个菌株 3 瓶 ,取平均值。
1.2.4　赤藓糖醇含量测定
取适当稀释发酵液样品 0.5mL , 加高碘酸试剂 0.5mL , 混
匀 ,静止 8min , 加氯化亚锡试剂 0.5mL , 混匀 , 加变色酸试剂
5mL摇匀 ,沸水浴 30min ,冷却 , 于570nm波长测定光吸收值 ,每
个样品平行 3个 , 取平均值 ,然后按已得到光吸收值与标准样
品浓度的回归方程计算[ 2] 。
2　结果与分析
2.1　出发菌株赤藓糖醇产量的测定
将实验室分离到的菌株经活化发酵后 , 测得其赤藓糖醇
产量为 12.594g L。
2.2　紫外线处理时间
采用不同紫外线照射时间处理菌株 , 经测定菌体的致死
率(见图 1), 最终诱变时间确定为 150s(致死率 85%左右)。
图 1　紫外线诱变和致死率的关系
Fig.1　Effect of UV on lethal rate
2.3　菌株诱变结果
经紫外线诱变育种 , 分离筛选了多株生长旺盛 , 菌落大 、
厚的菌株 , 分别接种进行发酵培养 , 进行赤藓糖醇含量测定 ,
其中有三株产量提高 , 结果如表 1。
表 1　菌株诱变结果
Table 1　The result s of mutation breeding
菌株号 OD值 赤藓糖醇产量(g L)
C11 0.710 22.808
C12 0.734 23.510
C13 0.781 24.943
2.4　菌株稳定性实验
把 C13 菌株经 5 次传代后进行发酵实验 ,结果见表 2。
表 2　突变菌株 C13稳定性实验结果
Table 2　The stability of C13
菌株号 OD值 赤藓糖醇产量(g L)
C13 0.780 24.912
　　从表 2 结果可以看出 , C13 菌株的赤藓糖醇产量基本稳
定 , 说明其在产赤藓糖醇方面具有较好的稳定性。
3　讨论
赤藓糖醇是一种极具开发前景的多元糖醇 , 微生物产生
赤藓糖醇的关键在于菌种。自然界的产生菌很难达到工业化
的要求 , 通过育种手段可以使菌株的代谢性大幅度增加。 采
用紫外线诱变育种是实践中较常采用的方法 , 具有实验条件
简单 , 易操作等特点 ,但是效率低 。本试验对选育的野生菌进
行处理 , 产量由 12.595g L提高到 24.943g L, 效果明显 , 但是 ,
距离高产的要求还有差距。对 C13菌株继续采用化学诱变等
综合手段 , 可能会使产量有更大的提高。同时对菌株的发酵
条件如 pH 值 、培养时间等都有待今后进一步作优化研究 , 以
筛选出能用于工业化生产的优良菌种。
参考文献:
[ 1] 郑健仙.功能性食品甜味剂[M] .北京:中国轻工业出版社 , 1997.189
-191.
[ 2]吴燕 ,吕慧敏 ,施大林 ,等.新型甜味剂———赤藓糖醇产生菌的筛选
[ J] .生物技术 ,2000 , 4:17-20.
[ 3]小田恒郎 ,佐佐木尧.パィオテクノロツ-の产物[ エリスリト-
ㄦ] [ J] .New Food Industry ,1993 , 35(4):38-45.
[ 4] 沈萍.微生物学[ M] .北京:高等教育出版社 ,2000.231-232.
VC二步发酵产酸菌氧化葡萄糖酸杆菌的选育
路新利1 ,郭会灿2 ,李宝库3(1.河北科技师范学院 ,河北 秦皇岛 066004;2.石家庄职业技术学院 ,河北 石家庄 050081;3.河北大学药学院 , 河北 保定 071002)
摘要:实验通过紫外线两轮诱变的方法诱变选育氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans), 以实现提高 2-酮基-L-古龙酸
(2-KLG)产量的目的 , 获得 1株高产 2-KLG的菌株 G5。结果证明该突变菌株在 pH 6.5-6.7 的发酵培养基中与蜡质芽孢杆菌(Bcillus cereus)混合发酵 , G5的平均糖酸转化率提高了 13.49%,酸量达到 83.6mg mL ,发酵周期缩短了 2-3h。经连续 10 代转接
发酵实验 ,证明其产酸稳定性较好。结论:氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)的突变体G5 提高了糖酸转化率 , 缩短了发酵
周期。
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