全 文 ：　第 20 卷第 2 期
2001年 3月 　 　 　　　　 　
无 锡 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuxi University of Light Industry
　 　 　 　　　　Vol.20 , No.2
Mar., 2001
　文章编号:1009-038X(2001)02-0133-04
　　收稿日期:2000-10-13;修订日期:2001-01-09.
作者简介:范光先(1968-), 男 ,贵州毕节人 , 硕士研究生.
耐高渗酵母产赤藓糖醇的影响因素
范光先 , 　张海平 , 　诸葛健
(无锡轻工大学生物工程学院 ,江苏无锡 214036)
摘　要:球拟酵母 OS-194是一株单产赤藓糖醇的耐高渗酵母 ,该菌株高产赤藓糖醇的最佳培养基
配方为:葡萄糖 10 g/dL ,酵母膏 0.5 g/dL ,尿素 0.1 g/dL.最适培养条件是在摇瓶转速 150 r/min
的条件下于 35 ℃培养 4 d.在上述培养条件下 ,该菌株赤藓糖醇的耗糖转化率高达 29.6%.磷是限
制 OS-194菌株高产赤藓糖醇的主要因素 ,当培养液中的磷质量浓度低于 31.5 mg/ L 时 ,赤藓糖醇
的产量最高;随着磷质量浓度的升高 ,该菌株赤藓糖醇的产量降低 , 而酒精的产量和生物量却有
明显升高.同时 ,OS-194菌株还能利用果糖 、蔗糖和 D-甘露糖产赤藓糖醇.
关键词:耐高渗酵母;赤藓糖醇;影响因素
中图分类号:Q546　　　　　　　文献标识码:A
Factors Affecting Erythritol Production by An Osmophilic Yeast
FAN Guang-xian , 　ZHANG Hai-ping , 　ZHUGE Jian
(School of Biotechnolog y , Wux i University of Light Industry , Wuxi 214036 , China)
Abstract:Spherical yeast OS-194 is an only ery thri tol production osmophilic yeast.10 percent of glu-
cose ,0.5 g/dL fo r yeast ex tract and 0.1 g/dL for urea were the best components of medium ,which
obtained high erythritol yield by OS-194.The optimum culture conditions were 35℃, 150 rpm , and 4
d.In the above condi tions , the maximum ery thritol yield on fermented glucose w as 29.6%.In this
research , it w as discovered that phosphorus was the main factor rest ricting the ery thritol-production.
When the phosphorus content in the medium was below 31.5 mg/ L , the maximum y ield w as ob-
tained.With the phospho rus content increasing , the eythritol-production decreased , but the produc-
tion of the ethanol and the biomass increased apparent ly.Meanwhile , fructose , sucrose and mannose
can also be ut ilized to produce ery thritol by this st rain.
Key words:osmophilic yeast;erythitol;af fected factors
　　赤藓糖醇在自然界分布广泛 ,微生物 、地衣类
植物 、瓜果 、发酵食品 、酒类以及动物的体液中都可
发现它的踪迹 ,含量为每升几十毫克到几十克不
等.作为 21世纪功能性食品甜味剂的赤藓糖醇 ,具
有降低热值显著和副作用小的特点[ 1] ,在当今多元
醇甜味剂应用领域有着诱人的开发前景.赤藓糖醇
的工业化生产采用酵母耗氧发酵法进行 ,但由于菌
种和发酵条件等因素的影响 ,其产量长期未能得到
显著的提高.
Spencer和 Sallans[ 2]在研究耐高渗酵母产多元
醇时发现:多元醇的产量受氮源和通风量的影响 ,
增加培养基酵母膏的质量分数可加快耗糖速率 ,提
高甘油产量 ,增大通风量可减少酒精的生成并提高
甘油产量 ,在减少酵母膏质量分数的情况下用尿素
作补充氮源也可得到最大产量的甘油.Peterson[ 3]
等人证实了以上观点 ,同时提出:1)酵母要充分但
有一定限度的生长;2)通风量要充足但不过大 ,以
部分限制 NADH 的氧化 ,使其参与还原生成多元
醇;3)限制无机磷浓度.日本学者若生腾雄[ 4]等在
研究赤藓糖醇的生产方法时发现温度也是很重要
的限制因素 ,在 30 ℃生长很好的树叶酵母赤藓糖
醇的产量却低于 37 ℃培养时的产量.为此 ,作者对
本中心分离的 OS-194赤藓糖醇生产菌株进行培养
条件的优化组合后 , 其赤藓糖醇的产量有显著提
高 ,从原来的 2.4 g/L 提高到 2.8 g/ L.
1　材料与方法
1.1　菌种
菌株 OS-194酵母:作者所在实验室自然分离
得到.
1.2　试剂
甘油 、D-阿拉伯醇 、赤藓糖醇 、葡萄糖 、高碘酸
钠 、亚砷酸钠 、硫酸 、变色酸等均为分析纯.
1.3　培养基
斜面培养基(g/L):葡萄糖 200 ,酵母膏 10 ,尿
素 1 ,琼脂 20.
发酵培养基 1(g/L):葡萄糖 100 ,酵母膏 5 ,尿
素 1.
发酵培养基 2(g/L):葡萄糖 200 ,酵母膏 10 ,尿
素 1.
发酵培养基3(g/L):葡萄糖 300 ,酵母膏 15 ,尿
素 1.
pH值自然 ,121 ℃灭菌 15 min.
1.4　发酵方法
在发酵培养基 2(250 mL 三角瓶中装液量为 20
mL)中接一环斜面菌种 ,并在 30 ℃,250 r/min条件
下摇瓶振荡培养 3 d.用吸管吸 2.5 mL 种子液于装
液量为 50 mL 的 500 mL 三角瓶中 ,各做 3个重复 ,
在35 ℃、250 r/min 条件下摇瓶振荡培养 ,每隔 24
h取发酵液分析 ,直到发酵第 5天葡萄糖被利用完
为止.
1.5　分析方法
酵母细胞于 2 500 r/min离心 10 min ,去除上
清液后测定其体积;残糖用 BA-40T 型生物传感分
析仪(山东科学院生物所研制)进行测定;多元醇的
组分用纸层析法来分析 , 展开剂为正丁醇:乙醇:
水=95:5:18 ,展开时间为 12 h;赤藓糖醇的含量用
高碘酸氧化法[ 5]来测定;酒精的含量用气相色谱法
进行测定.
2　结果与讨论
2.1　温度的影响
温度对 OS-194 菌株发酵的影响见表 1.37 ℃
这一温度对于菌体的生长明显太高 ,并且葡萄糖的
利用少而慢.当温度从 30 ℃上升到 35 ℃时对赤藓
糖醇产量的影响很小 ,然而 , 35 ℃时葡萄糖的利用
明显大于 30 ℃.因此 , 35 ℃是发酵最佳温度.OS-
194于 35 ℃培养 4 d 后赤藓糖醇产量明显高于 3
d ,到了第 5天其产量已趋于稳定 ,因此选择 4 d 作
为最适发酵天数.
表 1　温度对OS-194 菌株葡萄糖发酵的影响
Tab.1　Effect of temperature on the fermentation of glucose byOS-194
温 度/ ℃ 最终酵母体积分数/(mL/ dL) 葡 萄 糖 质 量 浓 度(g/ dL)
0 d 2 d 3 d 4 d 5 d
赤藓糖醇的耗糖转化率/ %
2 d 3 d 4 d 5 d
30 6.0 9.9 6.6 3.4 0.5 0.1 0.0 21.2 23.8 24.0
35 5.0 9.8 4.8 2.3 0.2 0.0 21.5 22.3 25.5 24.8
37 1.6 9.8 8.8 7.6 7.0 6.8 0.0 11.7 15.6 15.6
2.2　碳源的影响
不同碳源对发酵的影响见表 2.在不同碳源的
通风发酵试验中 ,用葡萄糖 、果糖 、甘露糖和蔗糖生
产赤藓糖醇可获得较好的产量;而阿拉伯糖 、半乳
糖和木糖的利用很慢 ,而且不形成赤藓糖醇;多元
醇如甘油 、甘露醇 、山梨醇也可被菌体利用来生长.
在所有的碳源中 ,以甘油为底物可形成最大的生物
量 ,麦芽糖 、乳糖和赤藓糖醇却不被菌体利用.显
然 ,以 D-甘露糖为碳源时赤藓糖醇的产量最高 ,但
成本也高 ,因此选择葡萄糖较为现实.
2.3　酵母膏质量浓度的影响
在培养液中除葡萄糖之外的其它主要成分是
酵母膏 ,其质量浓度范围是 0.125 ～ 1.0 g/dL ,见表
3.在低质量浓度下 ,菌体长势很差 ,糖耗也很低.当
酵母膏质量浓度为 0.125 g/dL 时 ,发酵 5 d后残糖
量仍高达 80%.可是 ,当酵母膏质量浓度增大到 0.5
134　　　　　　　　　　　　　　　无　锡　轻　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　第 20卷
～ 1.0 g/dL 时 ,发酵4 d后几乎没有残糖.酵母膏的
质量浓度对不同的产物形成有明显的影响.高质量
浓度的酵母膏将会导致大量的酒精合成 ,而低浓度
时仅合成微量.因此 ,在适当的发酵时间内以 0.5
g/dL的酵母膏为最佳氮源质量浓度 ,此时赤藓糖醇
产量最高.
2.4　尿素质量浓度的影响
尿素是培养液中除酵母膏之外的第二种氮源
营养成分 ,不同质量浓度的尿素对发酵的影响结果
见表 4.
表 2　菌株 OS-194 对不同碳源发酵的影响
Tab.2　Fermentation of various substrates(Carbon)by OS-194
碳源 质量浓度/(g/dL) 发酵时间/ d 最终 pH 酵母体积分数/(mL/ dL) 耗糖量/(g/100g) 赤藓糖醇的耗糖转化率/ %
L-阿拉伯糖 9.8 5 5.8 3.7 18.2 0.0
D-半乳糖 9.8 5 4.8 3.7 18.3 0.0
D-葡萄糖 9.6 4 3.0 6.0 98.3 24.8
甘油 9.7 4 5.8 10.0 75.8 0.0
乳糖 9.7 4 7.3 0.3 0.0 0.0
果糖 9.8 4 2.9 6.3 99.5 23.4
麦芽糖 9.8 5 8.1 0.3 0.0 0.0
D-甘露醇 9.7 5 5.6 5.5 24.1 0.0
D-甘露糖 9.7 4 3.3 6.0 96.1 31.5
D-山梨醇 9.6 5 4.8 5.5 31.7 0.0
蔗糖 9.9 4 3.0 5.5 99.2 18.6
D-木糖 9.8 5 4.5 3.7 53.6 0.0
赤藓糖醇 9.8 5 5.0 0.4 0.0 0.0
表 3　酵母膏质量浓度对OS-194 菌株产物合成的影响
Tab.3　Effect of yeast extract concentration upon yield of products by OS-194
酵母膏质量
浓度/(g/ dL) 发酵时间/d 最终 pH 值 酵母体积分数/(ml/ dL) 残糖质量浓度/(g/dL) 酒精质量浓度/(g/dL) 赤藓糖醇的耗糖转化率/ % 赤藓糖醇的总糖转化率/ %
1.0 4 3.5 10.0 0.3 18.1 18.8 18.2
0.5 4 2.5 6.6 0.5 3.2 29.6 28.1
0.25 5 3.5 4.0 4.8 0.3 29.5 15.3
0.125 5 5.0 2.5 8.0 0.1 22.7 4.5
注:葡萄糖 10 g/ dL ,尿素 0.1 g/ dL , 35 ℃
表 4　尿素质量浓度对 OS-194菌株发酵的影响
Tab.4　Effect of urea concentration upon fermentation with OS-194
尿素质量
浓度/(g/dL)
发酵时间/ d 最终 pH 值 酵母体积
分数/(m L/dL)
残糖质量
浓度/(g/dL)
酒精质量
浓度/(g/ dL)
赤藓糖醇耗糖
转化率/ %
0.0 4 2.9 5.0 3.8 4.4 24.3
0.0 5 2.9 5.3 1.0 4.4 24.7
0.05 5 3.2 5.5 0.2 5.5 25.6
0.10 4 3.2 5.0 0.3 5.8 28.2
0.20 4 3.8 5.5 0.4 5.4 27.5
注:葡萄糖 10 g/ dL ,酵母膏 0.5 g/ dL;35 ℃.
　　在培养液中 0 ～ 0.2 g/dL 的尿素对酵母生物量
的影响是很小的 ,而酒精和赤藓糖醇的产量却是随
着尿素质量浓度的增加而升高的 ,因此 ,在培养液
中添加尿素可加快发酵.如果培养液中不添加尿
素 ,发酵 5 d后发酵液中的残糖量还很高;当培养液
中添加 0.1 g/dL 的尿素时 ,发酵 4 d后葡萄糖就完
全被利用.因此 ,在 0.5 g/dL 酵母膏的培养液中选
择 0.1 g/dL 的尿素为最佳补充氮源浓度.
2.5　磷含量的影响
在发酵试验中 ,偶然发现由两个厂家提供的酵
母膏在同一条件下对 OS-194菌株发酵产赤藓糖醇
的量不同.其中一种不仅赤藓糖醇的产量偏低 ,同
时还形成大量的酒精 ,生物量也比较大.通过分析
两种酵母膏无机磷的含量证实:高产赤藓糖醇的酵
母膏含无机磷为 6.3 mg/g ,而另一种酵母膏中无机
磷的含量却高达 17.2 mg/g.用含无机磷低的酵母
膏作基础培养基 , 配制含不同磷质量浓度的培养
基 ,发酵结果如表 5所示.在添加不同质量浓度磷
的培养液中 ,随着磷质量浓度的升高 ,赤藓糖醇的
产量是减少的 ,而酒精的产量是升高的 ,菌体体积
也有少量的增加.添加了少量磷的培养液中葡萄糖
的利用率明显提高 ,而含磷高的培养液中磷对糖耗
135第 2期 范光先等:耐高渗酵母产赤藓糖醇的影响因素
的影响却不是很明显.
如果把磷对发酵的影响与酵母膏的质量浓度
联系起来分析 ,不难发现 ,酵母膏对发酵的影响并
非是其初始含氮量 ,而是由于它的含磷量不同而引
起的.
表 5　磷质量浓度对OS-194 菌株发酵的影响
Tab.5　Effect of phosphat concentration on fermentation by OS-194
KH2PO4
质量浓度/(g/ dL)
发酵时间/
d
pH 酵母体积
分数/(m L/dL)
残糖质量
浓度/(g/ dL)
酒精质量
浓度/(g/dL)
赤藓糖醇的耗糖
转化率/ %
0.0 4 2.9 6.0 0.3 3.8 25.0
0.007 4 3.1 6.0 0.1 7.0 21.7
0.014 4 3.3 6.5 0.2 9.0 18.3
0.028 4 3.4 7.0 0.1 10.2 10.1
0.056 4 3.3 7.0 0.2 12.3 9.8
注:葡萄糖 10 g/ dL ,酵母膏 0.5 g/ dL;35 ℃.
2.6　溶氧与糖浓度的内在联系
在发酵过程中振荡通风对提高还原产物赤藓
糖醇的产量是必要的.在 3种糖质量浓度和 3种通
风条件下确定发酵过程中最佳的溶氧条件 ,用装液
量为 50 mL 的 500 mL 三角瓶在不同的转速下进行
发酵 ,测定结果见表 6.在厌氧发酵中 ,酵母生长很
慢 ,赤藓糖醇的耗糖转化率只有 8.1%,而酒精可达
16%.当葡萄糖的质量浓度为 10 g/dL 时 , 最适转
速为 150 r/min;在葡萄糖质量浓度为 20 g/dL 的培
养液中 , 最适转速为 200 r/min;30 g/dL 的葡萄糖
在 200 r/min时的产量略高于 250 r/min.转速最高
可达到 250 r/min.此时 ,3 种浓度的葡萄糖培养液
中赤藓糖醇的产量均低于转速为 200 r/min时的产
量.所以 ,对于 10 g/dL 的葡萄糖培养液来说 , 最适
转速为 150 r/min.
表 6　通风量和糖质量浓度对OS-194 菌株赤藓糖醇产量的影响
Tab.6　Effect of aeration and sugar concentration upon yields of glycerol byOS-194
转速/(r/ min) 发酵时间/ d 原糖质量
浓度/(g/ dL)
最终 pH 酵母体积
分数/(g/ dL)
残糖质量
浓度/(g/dL)
赤藓糖醇的
耗糖转化率/ %
0 5 9.6 3.8 2.5 0.2 8.1
150 4 9.8 2.7 5.0 0.5 27.3
150 5 18.6 3.2 7.0 4.7 16.8
150 7 30.0 3.5 9.2 7.2 12.0
200 4 9.7 2.6 6.0 0.2 27.8
200 5 19.2 2.5 11.0 0.5 29.1
200 7 28.1 3.0 12.0 12.1 25.6
250 4 10.0 3.4 5.7 0.2 24.9
250 5 19.5 3.1 9.0 5.0 23.2
250 7 29.3 3.4 12.0 8.8 24.2
2.7　产物与发酵时间的关系
OS-194菌株发酵生产赤藓糖醇的结果见图 1.
　　在发酵过程中 ,赤藓糖醇的产量随着葡萄糖的
利用而增加;发酵前期有酒精形成 ,这是由于通风
发酵过程中酒精被利用或挥发掉了 ,其产量可忽略
不计;酵母 80%的生物量是在发酵 2 d时形成的 ,
随后生长减慢直到葡萄糖耗尽;培养液的 pH 随着
葡萄糖的利用而持续下降 , 发酵结束时有轻微回
升 ,因此 pH 值的变化可作为发酵完成的标示. 图 1　发酵时间与产物形成的关系
Fig.1　Products formed as related to time of fermentation
(下转第 141页)
136　　　　　　　　　　　　　　　无　锡　轻　工　大　学　学　报　　　　　　　　　　　第 20卷
[ 7] YOKOTA , SHIMIZU H , TERASAWA Y , et al.Pyruvic acid production by a lipoic acid auxo troph of Escherichia coli
W1485[ J] .Appl Microbial Biotechnol , 1994 , 41:638 ～ 643.
[ 8 ] YOKOTA A , HENMI M , TAKAOKA N , et al.Enhancement of glucose metabolism in a pyruvic acid-hyperproducing Es-
cherichia coli mutant defectiv e in F1-ATPase activity[ J] .J Ferment Bioeng , 1997 , 83:132 ～ 138.
[ 9 ] 李寅 ,陈坚 , 梁大芳等.营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响[ J] .生物工程学报 , 2000(3)∶225～ 228.
[ 10] 李寅 ,陈坚 ,伦世仪等.维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用[ J] .微生物学报 , 2000 , 40(5):528～ 534.
[ 11] 蔡武城.生物物质常用化学分析方法[ M] .北京∶科学出版社 , 1987.56 ～ 58.
[ 12] SCHEINER D.Determination of ammonia and kjeldahl nitrogen by indophenol method[ J] .Water Research , 1976 , 10:31 ～
36.
(责任编辑:李春丽)
(上接第 136页)
参考文献:
[ 1] GOOSSENS J , ROPER H.Erythritol:a new sweetener[ J] .Food Science and Technology Today , 1994 , 8(3):144 ～ 148.
[ 2] SPENCER J F T , SALLANS H R.P roduction of polyol by osmophilic y easts[ J] .Can J Microbiol , 1956 , 2:72 ～ 79.
[ 3] PETERSON W H , HENDERSHOT W T.Facto rs affecting production of g lycero l and D-arabitol by representative yeasts of the
Genus Zygosaccharomyces[ J] .Appl Microbiol , 1958 , 6:349 ～ 357.
[ 4] 若生腾雄.ボリオオル高生产性新规酵母[ J] .发酵工学 , 1988 , 66(4):209 ～ 215.
[ 5] 袁野 , 应向贤.高碘酸氧化法直接测定发酵液中赤藓糖醇[ J] .无锡轻工大学学报 , 2000 , 19(1):72 ～ 75.
(责任编辑:李春丽)
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