全 文 ：续表
No. 化合物 相对含量(%)
44 β-红没药烯 0.32
45 γ-杜松萜烯 0.4
46 δ-杜松萜烯 1.08
47 石竹烯氧化物 0.66
48 十六烷 0.27
49 细辛醚 0.72
50
(+)-3, 8 -dimethyl-5 -(1 -methylethyleth-
yludene)-1 , 2, 3 , 4, 5, 6 , 7, 8-octahydroazulene-6
one
0.25
51 十八醛 0.38
52 六氢金合欢丙酮 0.2
总计 56.11
3　讨论
在天南星挥发性成分研究中 , 共分离提取 75 个成分 , 检
测出 52 个。占挥发油总量的 56.11%。大于 1%的成分有 22
个 , 其中相对百分含量较高的为间位甲酚(m-Cresol)5.31%,
芫妥醇(Linalool L)3.69%, 2 , 2 -次甲基呋喃(Furan , 2 , 2 -
Methylenebis)2.8%, 2-糠基-5-甲基呋喃(2-Furfuryl-5-
Methylfuran)2.52%, 苯乙烯(Styrene)2.48%, 2-烯丙基呋喃
(Furan , 2 -(2 -propeny l))2.15%, 2 -呋喃甲醇乙酸酯(2 -
Furanmethanol , acetate)2.12%。目前对天南星的研究主要集中
于其非挥发性化学成分 、药理作用 、临床作用及炮制方法等方
面 , 对天南星挥发性成分的研究未见报道 ,本文通过对天南星
挥发性成分的分析鉴定及相对含量测定 , 为综合利用天南星
植物资源等提供科学依据。
图 1　天南星GC-MS 图谱
Fig.1　The GC-MS map of Arisaema erubescens(Wall.)Schott
参考文献:
[ 1] 国家中医药管理局《中华本草编委会》 .中华本草[M] .1版.上海:
上海科学技术出版社 , 1999, 6:448-451.
[ 2] 全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编(上册)[M] .1版.北京:
人民卫生出版社 , 1975:184-185.
[ 3] 江苏新医学院.中药大词典(上册)[M] .上海:上海科学技术出版
社 , 1986:507-508.
[ 4] 中国药典(一部)[ S] .2005:39.
[ 5] 汪蕾 ,张继振.天南星属植物研究进展[ J] .延边大学学报:自然科学
版 , 2004, 30(1):66-72.
[ 6] 丛浦珠 ,苏克曼.分析化学手册(第九分册)[ M] .北京:化学工业出
版社 , 2000.
开发与应用
DEVELOPMENT AND APPLICATION
赤藓糖醇高产菌株的筛选 、鉴定及发酵特性的初步研究
叶娴1 ,董海洲1 ,侯汉学1 ,邱立忠2 ,王希功2
(1.山东农业大学食品科学与工程学院 ,山东 泰安 271018;2.诸城兴贸玉米开发有限公司 , 山东 诸城 262200)
摘要:目的:筛选出发酵性能优良的赤藓糖醇高产菌株。方法:利用含 50%葡萄糖的高渗培养基筛选出耐高渗酵母 ,采用薄
层层析和高效液相色谱分析发酵液中多元醇的组成和含量 , 并通过形态和生理生化试验对菌株进行初步鉴定。结果:由泰山养
蜂场上采集的蜂蜜 、花粉 、蜂巢里筛选出 13株单产赤藓糖醇的野生菌 ,其中 7 株赤藓糖醇产量高于 20g L。 菌株 K-23 经初步鉴
定为球拟酵母属 , 在含 20%葡萄糖 、1%酵母膏 、0.1%尿素的发酵培养基中培养 144h 后赤藓糖醇的浓度达46.8g L , 转化率达
23.4%。结论:所获得的菌株 K-23具有一定的赤藓糖醇生产能力 , 且具有产物单一的优良发酵性能 ,为该菌株的菌种改良奠定
了基础。
关键词:赤藓糖醇;耐高渗酵母;筛选;鉴定
中图分类号:Q93-331　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)05-0054-04
Screening , Identification of Erythritol-producing Osmophilic Yeast and Studies
on Fermentation Characteristics
YE Xian
1 ,DONG Hai-zhou1 ,HOU Han-xue1 ,QIU Li-zhong2 ,WANG Xi-gong2
(1.College of Food Science and Engineering , Shandong Agricultural University ,Tai an 271018 , China;
2.Zhucheng Xingmao Corn Developing Co., Ltd., Zhucheng 262200 ,China)
Abstract:Objective:To obtained high erythritol-producing strains with excellent fermenting property is the key of the research.Methods:Eryth-
第 17卷第 5 期:54
2007 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.5:54
Oct.2007
ritol-producing strains were isolated from the medium containing 50% glucose , the erythritol in the fermentation broths was confirmed and mea-
sured by TLC and HPLC , and the strain was identified and denominated by the morphological and physiological studies.Results:13 erythritol-pro-
ducing strains were isolated from pollen , honey and honeycomb collected in apiary in MountainTai.Amongst these , 7 strains were high erythritol-
producers with the productivity higher than 20g L.A strain was identifiedas Torulopsis sp.K-23 , and showed the highest erythritol conversion yield
and productivity.It produced 46.8g L erythritol after 144h and 23.4% of erythritol conversion yield based on glucose in a medium containing
20% glucose , 1% yeast extract and 0.1%urea.Conclusion:Strain K-23 with the highest erythritol production without formation of by-prod-
ucts such as ribitol and mannitol is the foundation of microbial mutation.
Key words:erythritol;osmophilic yeast;screening;identification
收稿日期:2007-06-18;修回日期:2007-07-12
攻关项目:山东省优势农产品深加工关键技术及装备研究开发项目资
助(“大宗农产品(粮油)深加工关键技术研究” ,SDSP2005-0410-09)
作者简介:叶娴(1982-),女 ,在读硕士 ,研究方向:粮油微生物;＊通
讯作者:董海洲(1957-),男 ,教授 , 博士生导师 ,研究方向:农产品深
加工 , E-mail:hzhdong@sdau.edu.cn。
　　赤藓糖醇化学名称为 1 , 2 , 3 , 4-丁四醇 ,是在自然界中发
现的相对分子质量最小的糖醇 , 不仅拥有糖醇类产品所有卓
越功能 ,如防龋齿和适于糖尿病患者食用 , 还独具有极低热量
(≤1.66kJ g)和高耐受量(无副作用)的特性。赤藓糖醇具有
良好的食品加工适应性和生理保健功能 , 目前正作为一种新
型功能性保健食品原料被广泛用于食品 、医药 、化妆品及化工
等领域[ 1] 。
生产赤藓糖醇的菌种有真菌和细菌等 , 其中有许多菌种
除了产赤藓糖醇外 ,还产其他多元醇如木糖醇 、乙醇 、甘油等。
目前用于商业的主要是 Aureobasidium sp.的变异株(日本)、
Candida magnoliae(韩国)。鉴于赤藓糖醇重要的应用价值和巨
大的需求潜力以及当前制备的高成本 , 寻求发酵性能优良的
产生菌仍然是所有研究开发工作的基础。本文通过对不同来
源样品的微生物筛选 ,初步确定适合选育赤藓糖醇菌株的样
品源和筛选出新的发酵性能优良的菌株 K-23 , 经初步鉴定为
球拟酵母属 ,为后续产赤藓糖醇菌株的菌种改良以及提高赤
藓糖醇产量提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料:新鲜花粉 , 糖蜜 , 蜂巢等样品采自泰山上的
养蜂场;陈酿未经杀菌处理的蜂蜜;糖蜜 ,采自泰安糖厂;果园
土样。
1.1.2　试剂:赤藓糖醇 , 木糖醇为美国 Sigma 公司产品 , 变色
酸 、高碘酸钠 、联苯胺等其他试剂均为分析纯。
1.1.3　仪器:生化培养箱 、回转式摇瓶柜 、超净工作台 、光学显
微镜等。
1.1.4　培养基
①富集培养基:50%葡萄糖 , 1%酵母膏。
②平板和斜面培养基:20%葡萄糖 , 1%酵母膏 , 2%琼脂。
③发酵培养基:20%葡萄糖 , 1%酵母膏 , 0.1%尿素。
1.2　方法
1.2.1　耐高渗酵母的分离纯化[2]
将样源放入富集培养基中 ,在 50ml 250ml的三角瓶 , 30℃,
180r min摇床培养 6d;然后在平板上划线分离 , 挑取单菌落接
种在斜面上 ,冰箱保藏。将分离的菌株接种在发酵培养基中 ,
在 50ml 250ml的三角瓶 , 30℃, 180r min 摇床培养 4d;发酵结束
后将发酵液补充到 50ml , 4 000r min 离心 30min ,取上清液薄层
层析从而确定发酵液中是否含有赤藓糖醇;将产赤藓糖醇的
耐高渗酵母平板划线纯化 3次 , 进行菌种鉴定。
1.2.2　发酵液中赤藓糖醇的定性[3]
薄层层析法 ,展层剂为正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5 ,显色剂为
高碘酸钠-联苯胺溶液。
1.2.3　发酵液中多元醇和葡萄糖浓度的测定:参见文献[ 4 ,5] 。
赤藓糖醇的测定:高碘酸氧化法 ,HPLC 法。
葡萄糖的测定:3 , 5-二硝基水杨酸法 ,HPLC 法。
HPLC法 , 色谱条件为:Waters510 泵 , 410 示差折光检测器 ,
U6K 手动进样器 , 810 色谱工作站;4.6×250mm Waters NH2 柱 ,
35℃柱温 , 流动相为乙腈∶水=80∶20(v v),流速为1.5ml min。
1.2.4　耐高渗酵母的鉴定:参见文献[6] 。
1.2.5　菌体浓度的测定:参见文献[4] 。
1.2.6　pH 值的测定:精密 pH 计测定。
2　结果与分析
2.1　赤藓糖醇高产菌株的初步筛选
从样品中筛选出 329 株耐高渗酵母 , 对其进行摇瓶发酵试
验 , 利用薄层层析对发酵液进行分析 ,结果如表 1 所示。
表 1　耐高渗酵母产多元醇的情况
Table1　Number of strains producing polyols
多元醇产物 菌株数花粉 蜂蜜 蜂巢 糖蜜 土样
甘油 11 34 25 21 2
戊糖醇 7 8 10 3 0
赤藓糖醇 6 2 4 1 0
甘油+戊糖醇+赤藓糖醇 3 1 3 5 1
甘油+戊糖醇 17 28 35 28 3
戊糖醇+赤藓糖醇 2 0 2 1 1
甘油+赤藓糖醇 2 1 3 3 0
总计 48 74 82 62 7
　　由表 1 可以看出 , 有 273 株耐高渗酵母产多元醇 , 其中有
13株单产赤藓糖醇;耐高渗酵母中以产甘油的酵母居多 ,其中
单产甘油的酵母占全部酵母总数的 28.3%;单产戊糖醇的酵
母占全部酵母总数 8.5%;单产赤藓糖醇的酵母占全部酵母总
数的 4.0%。酵母产多元醇的性质和样源存在着一定的联系 ,
自然界中产赤鲜糖醇的耐高渗酵母几乎同时都混产甘油 、戊
糖醇等多元醇 , 新鲜花粉中单产赤藓糖醇菌株较多 , 这可能是
因为花蕊的微酸环境以及蜜蜂对微生物的传播作用所致;蜂
巢中的耐高渗酵母的数量较多 , 菌种差异较大 , 可作为筛选耐
高渗酵母的重要来源;蜂蜜中单产甘油的菌株最多;而土壤中
的酵母耐糖性较差 , 不宜用来筛选耐高渗酵母。
2.2　赤藓糖醇高产菌株的复筛
采用高效液相色谱测定 13 株单产赤藓糖醇菌株发酵液
中多元醇的浓度 , 其中有 7株是赤藓糖醇产量大于 20g L的耐
高渗酵母 , 结果如表 2所示。
表 2　高产赤藓糖醇菌株的发酵结果
Table 2　Survey of erythritol-producing isolates
菌株 样源 多元醇浓度(g L)(产率 g L·h)赤藓糖醇 甘油
发酵时间
(h)
残糖浓度
(g L)
K-23 花粉 46.8(0.33) 1.6 144 4.8
K-7 花粉 44.7(0.31) 2.7 144 10.2
Y-15 蜂巢 30.9(0.38) 2.2 84 68.7
X-59 糖蜜 27.7(0.23) 2.6 120 13.4
K-24 花粉 26.5(0.18) 3.1 144 21.7
K-30 花粉 24.7(0.17) 3.4 144 49.1
K-61 花粉 24.4(0.25) 1.7 96 65.3
　　由表 2 可以看出 ,菌株 K-23 的赤藓糖醇产量最高 , 副产
物甘油的产量最低 , 且几乎可以完全消耗葡萄糖 , 因此菌株 K
-23可作为工业用菌株进一步深入研究;而菌株 Y-15 在 84h
552007年 10 月　　　　　　　　　　　　赤藓糖醇高产菌株的筛选 、鉴定及发酵特性的初步研究　　　　　　　　　　　　　
时发酵液中赤藓糖醇浓度达30.9g L, 高产率可大大降低生产
成本 ,但是其在 84h 后不再利用葡萄糖产赤藓糖醇 , 下一步可
通过诱变育种技术改变其代谢途径提高菌株 Y-15 赤藓糖醇
的产量。
2.3　高产菌株 K-23 的初步发酵试验
菌株K-23 在 20%葡萄糖 , 1%酵母膏 , 0.1%尿素的发酵
培养基中 , 在 50ml 250ml的三角瓶 , 30℃、180r min 摇床培养 ,
间隔 12h 测定发酵液浓度 ,结果如图 1 所示。
图 1　发酵过程中葡萄糖浓度 、菌体浓度 、赤鲜糖醇浓度的变化
Figure 1　Fermentation patterns of K-23 with a rotary shaker
图 2　发酵过程中 pH 值的变化
Figure 2　Changes of pH in the fermentation
由图 1 、2 可以看出 , K-23 在发酵第 3d 赤藓糖醇开始形
成 ,第 4d 时葡萄糖消耗迅速增大 ,赤藓糖醇浓度增大 ,菌体浓
度在第 2d迅速增大 , 后浓度变化趋于平稳 , 发酵过程中培养
液的 pH 值因 TCA 循环产酸持续下降 , 发酵结束时有轻微回
升 ,因此 , pH 值的变化可作为发酵完成的标志。
2.4　菌株 K-23 的初步鉴定
2.4.1　形态学特性
菌株的细胞为球形 、椭圆形 , 多边芽殖 , 单个菌体;在麦芽
汁液体培养基中 ,发酵液清 , 在固体培养基上菌落表面光滑湿
润 ,呈白色 、乳白色;在 Gorodkowa琼脂上培养物镜检无子囊孢
子;在玉米粉琼脂培养基上生长不形成假菌丝 。
2.4.2　生理学特性
高产菌株K-23 生化试验见表 3～ 5。
表 3　菌株K-23的糖发酵测试
Table 3　The sugar fermentation experiment of strain K-23
发酵糖类 葡萄糖 乳糖 半乳糖 麦芽糖 蜜二糖 蔗糖 棉子糖
特征 + - - + - + 1 3
　　注:+表示发酵;-表示不发酵;1 3表示发酵程度为 1 3。
Symbols:+ f ermentation , -no fermentation.
表 4　菌株K-23的同化碳源测试
Table 4　Carbon assimilation experiment of strain K-23
同化碳源 特征 同化碳源 特征 同化碳源 特征 同化碳源 特征 同化碳源 特征
葡萄糖 + 麦芽糖 + D-木糖 - 肌醇 - 赤藓糖醇 -
乳糖 - 蔗糖 + 核糖 + 山梨醇 - 甘油 -
半乳糖 - 阿拉伯糖 - 甘露糖 + 甘露醇 -
　　注:+表示阳性 , -表示阴性。
Symbols:+positive , -negative.
表 5　菌株 K-23的其他生理鉴定结果
Table 5　Physiological characteristics of strain K-23
菌株 氮源同化硝酸钾
葡萄糖生长
(60%) 37℃生长试验 类淀粉化合物
K-23 - + + -
　　注:+表示阳性 , -表示阴性。
Symbols:+positive , -negative.
根据上述发酵糖 、同化碳源 、同化氮源 、60 %葡萄糖酵母
膏中生长试验 、37 ℃生长试验及类淀粉化合物试验的结果 , 结
合形态学特性 , 参阅真菌鉴定手册 , 初步鉴定菌株 K-23 属于
球拟酵母属。
3　讨论
菌种是发酵工业的关键因素 , 目前影响赤藓糖醇发酵生
产的主要问题在菌种。 1950 年W.W.Binkley 和 M.I.Wolform
首次提出酵母产赤藓糖醇 , 1956 年 J.F.T.Spence和 H.R.Sal-
lans首次分离了能产赤藓糖醇的耐高渗酵母。现已发现产赤
藓糖醇的菌种有真菌 、酵母 、细菌等 , 其中有许多菌种除了产
赤藓糖醇外 ,还产其他多元醇如木糖醇 、乙醇 、甘油等。可主
产和单产赤藓糖醇的微生物多数是从蜂房 、蜂蜜 、花粉中分离
到的一些耐高渗酵母 , 如 Aureobasidium(短梗霉菌属), Monilliel-
la 、Torula(圆酵母属), Trichosporon 、Trichosporonoides、Candida(假
丝酵母属), Pichia(毕赤酵母属), Torulopsis(球拟酵母属), Trig-
onopsis(三角酵母属)和 Trichosporum(毛孢子菌属),而 Leuconos-
toc oenos必须在厌氧条件下才产生赤藓糖醇等。目前用于商
业生产的主要是 Aureobasidium sp.的变异株(日本)、Candida
magnoliae(韩 国);美 国专利有 Torulopsis variabilis 、 Trichos-
poronoides megachiliensis 、 Trichosporonoides oedocephalis 和 Pichia
sp.。普遍认为生产赤藓糖醇的最好菌株能够利用单糖和双
糖 , 且不产生其他多元醇;韩国的 Yang 选育的 Candida magno-
liae 变异株 M2 , 将葡萄糖浓度提高到 20%时 , 获得生产力
0.54g·l-1 h-1 , 产率 43% , 且分析变异株 M2 具有产物单一性
原因可能是:M2 的赤藓酮糖还原酶有很高的底物特异性;而
相对于 Aureobasidium sp.变异株的赤藓糖醇的代谢途径上 , 赤
藓酮糖还原酶利用 D-赤藓酮糖作为底物时表现出最大的活
性 ,但是 D-甘油醛和二羟丙酮也可以作为该酶的底物 , 造成
其他醇的产生 , 因而使赤藓糖醇的转化率下降。本文菌株K-
23在含 20%葡萄糖 、1%酵母膏的发酵培养基中培养 144h 后
赤藓糖醇的浓度达 46.8g L , 转化率达 23.4%, 且终发酵液不
产生甘油 , 这与国内报道的其他野生型酵母的原始产量相比 ,
菌株 K-23 的赤藓糖醇产量处于相对较高的水平 ,作为出发
菌株具有很好的潜力。而菌株 Y-15 在培养 84h 产量达到最
高 ,产率达到 0.38g L·h , 是本研究中筛选出产率最高的菌种 ,
与国内外研究的菌种相比发酵时间大大缩短 , 这样可降低生
产成本 , 分析原因可能是因为菌种的生长周期短 , 在短时间内
菌体浓度升高 , 从而产生赤藓糖醇 , 为了提高其产量 ,下一步
研究可通过研究其代谢机理 , 使其提高葡萄糖的利用率 , 从而
提高其产量。
本研究从泰山周边地区共筛选出 273 株产赤藓糖醇耐高
渗酵母 , 其中有 13株赤藓糖醇的产生菌 ,其中有 7 株是赤藓糖
醇产量大于 20g L的耐高渗酵母 , 单产赤藓糖醇菌株的筛出率
达到 4.0%,均比以前国内外报道的赤藓糖醇产生菌筛出率提
高 ,说明菌种的存在与自然环境是密切相关的。新鲜花粉中
单产赤藓糖醇菌株较多;蜂巢中的耐高渗酵母的数量较多 , 菌
种差异较大 , 可作为筛选耐高渗酵母的重要来源;蜂蜜中单产
甘油的菌株最多;而土壤中的酵母耐糖性较差 , 不宜用来筛选
耐高渗酵母。
目前 , 对菌株K-23 产赤藓糖醇机理的研究正在进行中 ,
对该菌株 K-23 进行发酵条件优化及菌种改良 , 进一步提高
赤藓糖醇的积累量有待研究。
56　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷第 5期
参考文献:
[ 1] 郑建仙.功能性糖醇[M] .北京:化学工业出版社 , 2005, 4:28-68.
[ 2] Shie-Jea Lin , Chiou-Yen Wen , Jian-Ching Liau , et al.Screening and
Production of erythritol by newly isolated osmophilic yeast -like fungi.[ J] .
Process Biochemistry, 2001 , 36:1249-1258.
[ 3] 曹治权.层析显色试剂手册[M] .北京:中国商业出版社 , 1986 , 6:84
-91.
[ 4] D-KOh , C-H Cho , J-K Lee , et al.Increased erythritol production in fed
-batch cultures of Torula sp.by controlling glucose concentration[ J] .Journal
of Industrial Microbiology and Biotechnology ,2001 , 26:248-252.
[ 5] Y-W Ryu, C Y Park , J B Park , et al.Optimization of erythritol production
by Candida magnoliae in fed-batch culture[ J] .Journal of Industrial Micro-
biology and Biotechnology , 2000, 25:100-103.
[ 6] 魏景超.真菌鉴定手册[M] .上海:科学技术出版社, 1979:534-537.
胞苷生产菌的选育
盛春雷1 ,丁庆豹1＊ ,丁翠敏1 ,欧伶1 ,邱蔚然2(1.华东理工大学生物反应器工程重点实验室 ,上海 200237;2.南通秋之友生物科技有限公司 , 江苏 南通 262200)
摘要:目的:筛选得到胞苷发酵单位较高的菌株 ,并对发酵过程作初步研究。方法:以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌 DOS7 为
出发菌株 ,对其进行紫外诱变 、5-氟胞苷(5FCR+)和 2-杂氮尿嘧啶抗性(2AU+)抗性筛选。结果:通过紫外诱变和抗性筛选得
到突变株 DOS7-2-1000-15 ,抗 5-氟胞苷和2-杂氮尿嘧啶的临界浓度分别为 800mg L和 1 000mg L。同时检测了抗 5-氟胞
苷突变株中 CTP合成酶的活性 , 比原始菌株提高了 12.4%,突变株 DOS7-2-1000-15 发酵过程结果为:36℃发酵 72h 能积累胞
苷最高为 3.5g L。结论:筛选得到的突变株 DOS7-2-1000-15 的遗传稳定性较好 , 可稳定发酵。
关键词:胞苷;枯草芽孢杆菌;菌种选育;发酵
中图分类号:TQ926.4　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)05-0057-03
Screen of Bacillus subtilis Mutants Producing Cytidine
SHENG Chun-lei1 ,DING Qing-bao1＊ ,DING Cui-min1 ,OU Ling1 ,QIU Wei-ran2
(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering East China University of Science and Technology , Shanghai 200237;
2.Nantong Qiuzhiyou Bioscience and Biotechnology Co.Ltd.,Nantong 262200 ,China)
Abstract:Objective:In order to obtain a mutant which can increase the yield of cytidine and study the process of cytidine fermentation.Meth-
ods:Screened from DOS7(deficient in cytidine deaminase)by ultraviolet , 5FCR and 2AU resistance mutagenesis.Results:Obtained a mutant
Bacillus subtilis DOS-2-1000-15 , had the ability of 5FCR and 2AU resistance.The resistance critical concentration of 5FCR and 2AU was
800mg L and 1000mg L respectively.The activity of the CTP synthetase from the 5FCR resistance mutant was increased 12.4% more than the
starting mutant.The strain could secreted 3.5g L cytidine at 36℃ after 72h fermentation.Conclusion:Genetic stability and fermentation stablity
of the mutant Bacillus subtilis DOS-2-1000-15 were good.
Key words:cytidine;Bacillus subtilis;strain screen;fermentation
收稿日期:2007-04-09;修回日期:2007-06-02
作者简介:盛春雷(1979-),男 ,硕士生 ,从事微生物及发酵法生产核
苷类药物研究 , E-mail:ssccll1981@163.com;＊通讯作者(Correspond-
ing author):丁庆豹 , Tel:021-64250676 , E-mail:bioxianleid@163.com。
　　胞苷是人体和动植物体内 RNA的结构组成部分 , 在生物
体内生理生化过程中起着重要的调控作用 , 具有多方面生理
活性;同时 ,胞苷又是很多抗病毒 、抗肿瘤和抗艾滋病药物的
良好中间体以及基因工程研究的重要原材料[1] 。目前国内外
制备胞苷的方法主要是化学合成法 , 即以胞嘧啶和核糖或者
以尿苷为主要原料进行制备 ,但存在反应步骤多 , 反应条件苛
刻 、操作繁琐 、环境污染较大和原料成本高的问题。而用微生
物发酵法生产胞苷 ,具有成本低 、产率高 、周期短 、控制容易等
优势[ 2] 。 20 世纪 90 年代 ,日本武田化学工业公司的 Muneharu
Doi、Satoru Asahi [3-5]等对胞苷高产菌的菌种选育进行了研究 ,
使胞苷发酵单位得到提高 , 但在国内目前还没有相关研究的
文献报道。因此选育胞苷发酵的高产菌株 , 对加强国内核苷
发酵工业在国际市场上的竞争能力也有着重要的意义。
胞苷在枯草芽孢杆菌中的从头合成途径如图 1 所示 , 在
整个反应过程中 , UMP合成酶系(1-6)和 CTP合成酶(8)受到
尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的反馈阻遏和抑制 ,而胞苷脱
氨酶(11)使胞苷进一步反应生成尿苷。本实验出发菌株为胞
苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌[ 3] , 保证了代谢过程中胞苷能够
得到积累 ,为了使代谢过程通畅并大量积累胞苷 , 我们选育胞
苷和尿苷的结构类似物抗性突变株 , 来进一步解除 UMP 合成
酶系和 CTP合成酶的反馈阻遏和抑制[ 4 , 5] 。
本实验以胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌 DOS7 为出发菌
株 ,筛选得到了 5-氟胞苷和 2-杂氮尿嘧啶抗性等遗传标记
的突变株 DOS7-2-1000-15。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
图 1　枯草芽孢杆菌中嘧啶合成途径
Figure 1　Biosynthetic pathway of pyrimidine in .subtilis
(1)氨甲酰磷酸合成酶 carbamyl phosphate synthetase P;(2)天冬氨酸转氨
甲酰基酶 aspartate transcarbamylase;(3)二氢乳清酸酶 dihydroorotase;(4)
二氢乳清酸脱氢酶 dihydroorotate dehydrogenase;(5)乳清酸磷酸核糖焦
磷酸化酶 orotate phosphoribosyltransferase.;(6)乳清酸单磷酸脱羧酶 oro-
tate 5 -monophosphate decarboxylase;(7)UMP 激酶 UMP kinase;(8)CTP
合成酶 CTP synthetase;(9)核苷酸酶 5 -nucleotidase;(10)胞苷脱氨酶
cytidine deaminase;(11)尿嘧啶磷酸化酶 uridine phosphorylase;(12)尿嘧
啶磷酸核糖焦磷酸化酶 uracil phoribosyltransferase。
胞苷脱氨酶缺失枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DOS7 , 华
东理工大学酶工程室保存菌株;
1.1.2　试剂
5-氟胞苷和 2-杂氮尿嘧啶购自于 SIGMA 公司;Casamino
第 17卷第 5 期:57
2007 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.5:57
Oct.2007