全 文 ：云南西双版纳野生与栽培绞股蓝根内
丛枝菌根真菌的分子多样性
周丽思摇 郭顺星*
(中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193)
摘摇 要摇 采用巢式鄄PCR、DNA克隆测序技术,对西双版纳地区野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌
根真菌(AMF)进行群落结构多样性研究.试验共获得 551 个含有丛枝菌根真菌 18S rDNA 片
段的克隆子,经限制性片段长度多态性分析,得到 100 个 RFLP类型,将其划分为 20 个序列类
型,分属于 7 个科.将 20 个序列类型的相关序列与 GeneBank 数据库进行比对,有 5 个可以鉴
定到种,分别为 Glomus viscosum、Claroideoglomus etunicatum、Racocetra tropicana、Acaulospora spi鄄
nosa、Acaulospora mellea.与 MaarjAM数据库中序列进行比对,12 个可鉴定为虚拟分类分子种,
其中 7 个未在孢子形态学鉴定方法中获得.西双版纳地区野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真
菌群落组成差异极显著.野生绞股蓝根内 Glo鄄2、Amb鄄1、Para鄄1 为优势类群,而栽培绞股蓝根
内 Glo鄄3、Glo鄄8、Glo鄄10、Div鄄1 为优势类群. Claroideoglomeraceae 和 Ambisporaceae 仅在野生样
本中出现,而 Diversisporaceae仅在栽培样品中出现.
关键词摇 丛枝菌根真菌摇 绞股蓝摇 多样性摇 RFLP分析摇 巢式鄄PCR
文章编号摇 1001-9332(2013)09-2503-08摇 中图分类号摇 R282. 2摇 文献标识码摇 A
Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in wild and cultured Gynostemma pen鄄
taphyllum roots in Xishuangbanna, Southwest China. ZHOU Li鄄si, GUO Shun鄄xing ( Institute
of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical Col鄄
lege, Beijing 100193, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2013,24(9): 2503-2510.
Abstract: By using nested鄄PCR, DNA cloning, and sequencing techniques, this paper studied the
diversity of the community structure of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) in wild and cultured
Gynostemma pentaphyllum roots. A total of 551 clones containing 18S rDNA genes of AMF were ob鄄
tained from the roots. After the analysis of the restriction fragment length polymorphism, 100 differ鄄
ent RFLP types were obtained, which were further divided into 20 AMF phylotypes belonging to
seven families. The comparison of the sequences of 20 AMF phylotypes with the GenBank database
showed that there were 5 AMF phylotypes having high similarity to the sequences of reported AMF
species Glomus viscosum, Claroideoglomus etunicatum, Racocetra tropicana, Acaulospora spinosa,
and Acaulospora mellea, respectively. These sequences were then assessed for the similarities
against the MaarjAM database, and 12 phylotypes showed high similarity to the corresponding mo鄄
lecular virtual taxa, of which, 7 phylotypes were not obtained by the morphological identification of
soil asexual spores. Statistical analysis indicated that there were significant differences in the AMF
community between wild and cultured G. pentaphyllum roots. The analysis of relative abundance
data indicated that Glo鄄2, Amb鄄1, and Para鄄1 were the dominant phylotypes in wild
G. pentaphyllum roots, while Glo鄄3, Glo鄄8, Glo鄄10, and Div鄄1 were the prevalent phylotypes in
cultured ones. Claroideoglomeraceae and Ambisporaceae were only detected in wild G. pentaphyl鄄
lum roots, and Diversisporaceae was only identified in cultured ones.
Key words: arbuscular mycorrhiza; Gynostemma pentaphyllum; diversity; RFLP; nested鄄PCR.
*通讯作者. E鄄mail: sxguo2006@ yahoo. com. cn
2013鄄01鄄22 收稿,2013鄄06鄄25 接受.
摇 摇 绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)为葫芦科绞 股蓝属多年生草质藤本植物. 其药用价值在明代
《救荒本草》中已有记载. 现代药理研究表明,绞股
蓝皂苷具有调节血糖、降低血脂、保心护肝、抑制肿
应 用 生 态 学 报摇 2013 年 9 月摇 第 24 卷摇 第 9 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Sep. 2013,24(9): 2503-2510
瘤、镇静止痛及抗溃疡等多种药理作用[1] . 随着医
药工业的发展,对中药材的需求日益增长,有必要对
野生药材进行引种栽培. 但栽培过程中往往由于生
境改变、植物种类单一、栽培密度增大等,导致产量
下降、药用成分含量降低、病虫害的发生增加,以及
土壤环境恶化所引起的连作障碍等问题,极大地影
响了绞股蓝的成药品质[2] .丛枝菌根真菌作为与植
物关系最为密切的土壤微生物之一,可与植物形成
菌根共生体,不仅促进植物对养分元素的吸收和代
谢、改善植物营养状况、影响植物次生代谢产物的积
累、提高植物对不良环境和病虫害的抵抗能力,而且
对修复退化土壤有良好作用[3] . 因此,丛枝菌根真
菌在药用植物中的研究倍受关注. 贺学礼等[4]研究
了丛枝菌根真菌对黄芪(Astragalus membranaceus)
生理特性及营养成分的影响;黄京华等[5]研究发
现,接种摩西球囊霉(Glomus mosseae)和地表球囊霉
(Glomus versiforme)有利于提高黄花蒿(Artemisia an鄄
nua)地上部分的挥发油收油率.
目前,我国对药用植物丛枝菌根真菌多样性的
研究,因丛枝菌根真菌专性活体营养的特点,往往只
能通过鉴定提取自根围土壤中的孢子和显微观察的
传统形态学方法.姜攀等[6]、马永甫等[7]、赵婧[8]等
分别对厦门、重庆和河北安国地区部分药用植物根
围丛枝菌根真菌资源分布进行了调查. 这种方法可
以获得优质的丛枝菌根真菌种质资源,但无法说明
这些丛枝菌根真菌种类就是与植物相互作用最为密
切的种类.
随着分子生物学技术的日益成熟,获得药用植
物根内定殖的丛枝菌根真菌群落组成已成为可
能[9] .为更真实地反映野生与栽培绞股蓝根系中丛
枝菌根真菌的群落组成,找寻更适合绞股蓝栽培应
用的丛枝菌根真菌种质资源,本文以野生和栽培生
境的绞股蓝为研究对象,通过对绞股蓝根内丛枝菌
根真菌 18s rDNA的 RFLP分析及构建克隆文库,探
讨野生与栽培绞股蓝根系中丛枝菌根真菌群落结
构、多样性及其种属间的差异,旨在为解决绞股蓝栽
培中的相关问题提供理论依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 样品采集及处理
采样地点位于云南省西双版纳傣族自治州
(21毅08忆—22毅36忆 N,99毅56忆—101毅50忆 E),系北回归
线以南的热带北部边缘,属热带季风气候,年均气温
21. 5 益,年均降雨量 1557 mm,降雨主要集中在 5
月下旬至 10 月下旬,全年干湿季分明[10-11] .
2012 年 1 月,在云南省勐养县国家自然保护区
(22毅15忆 N,100毅49忆 E,海拔 796 m)采集野生绞股蓝
根系样本,在云南省西双版纳南药园 (22毅00忆 N,
100毅47忆 E,海拔 589 m)采集栽培绞股蓝根系样本.
在两个采样地随机选择 3 个采样点,每个采样点随
机采集 3 株绞股蓝根样作为一份样品. 在距植株
0 ~ 30 cm处采集 10 ~ 20 cm 深的土样和细根样,编
号、装入自封袋后置入冰盒带回.将根系样品清洗干
净后,于-80 益冰箱中保存备用.土样风干保存.
1郾 2摇 丛枝菌根相关指标的测定
1郾 2郾 1 侵染强度摇 选取幼嫩根系剪成 1 cm 左右的
根段,依次经过 10% KOH 50 min (90 益水浴)、水
洗、2%盐酸 5 min、含 0. 05%曲利本蓝的乳酸甘油
水溶液(乳酸 颐 甘油 颐 水 = 1 颐 1 颐 1) 30 min(90 益
水浴)、水洗、乳酸甘油水溶液过夜脱色,从染色完
成的根段中随机挑选 30 个根段制片,在显微镜下测
定侵染率. 依据菌根侵染分级标准分成 0、<1%、
<10%、<50%、<90%、>90% 6 级;丛枝泡囊丰度分级
标准为:无、较少、较多、非常多;根据分级标准对根段
进行侵染率级别判断,然后将相应数值输入“MYCO鄄
CALC冶软件,计算出侵染强度(M%). M%是 30 个随
机挑选的根段侵染状况的加权平均值,是植物根系中
真菌侵染出现的频度和侵染强度的综合反映[12] .
1郾 2郾 2 菌丝密度摇 取已过 1 mm 筛的风干土壤样品
5 g,放入 1 L烧杯中,加入 800 mL水充分搅拌,静置
至无漩涡,将上清液导入上、下筛分别为 20 和 400
目的双层筛中过滤. 重复该操作 2 次. 使用 250 mL
水将 400 目筛中的菌丝转移进搅拌机,搅拌 10 s,停
5 s,再搅拌 20 s后,将溶液转移进 300 mL三角瓶中
摇匀,静置 1 min,在距液面 1 cm处吸取 5 mL溶液,
加在微孔滤膜上进行抽滤,将滤膜转移至载玻片上,
滴加 0. 05% 曲利本蓝染液两滴. 重复上述步骤 2
次.待染液干后,滴加甘油并盖上盖玻片. 每张微孔
滤膜分别于 200 倍显微镜下选取均匀分布的 25 个
样点进行观察[13] .菌丝密度(m·g-1)计算公式:
菌丝密度=菌丝长度 /土样质量
菌丝长度(m)= 11 / 14伊总交叉点数伊网格单元
格长度伊滤膜上样块面积 /网格面积
1郾 2郾 3 孢子密度摇 每份土样中取 10 g 风干土,用湿
筛倾析鄄蔗糖离心法分离土壤中丛枝菌根真菌孢子,
在体视显微镜下计数.孢子密度(g-1)计算公式:
孢子密度 =丛枝菌根真菌的孢子数 /土样质量
4052 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
1郾 3摇 根内丛枝菌根真菌分子多样性的鉴定
1郾 3郾 1 DNA的提取摇 先将样品根系表面消毒,步骤
如下:75%乙醇 30 s,1%次氯酸钠 3 min,无菌水冲
洗 3 次,用无菌滤纸将表面水分吸干.在每个根样中
随机选取数条根段(约 200 mg),使用 CTAB 法提取
植物基因组试剂盒(艾德莱,中国)并按照操作手册
进行提取,提出的 DNA样品于-20 益保存备用.
1郾 3郾 2 巢式鄄PCR 扩增目的条带 摇 对提取出的根内
DNA样品进行巢式鄄PCR 扩增.第 1 次 PCR:所用引
物为丛枝菌根真菌特异引物 AML1 / AML2[14] (表
1).扩增反应体系为 25 滋L,按照 EasyTaq KIT 说明
书(北京全式金生物技术有限公司)进行 PCR反应,
其中引物(10 滋mol·滋L-1)各加入 0. 4 滋L,模板为 1
滋L,扩增程序为:94 益 5 min,33伊(94 益 30 s,58 益
1 min,72 益 1 min),72 益 10 min.每个样品 3 个重
复.第 2 次 PCR:分别以 3 个重复的第 1 次 PCR 产
物按 1 颐 1000 用超纯水(ddH2O)稀释后,作为第 2
次 PCR 的模板;引物为丛枝菌根真菌特异引物
NS31 / AM1[15-16](表 1),反应体系与第 1 次 PCR 相
同,扩增程序为:94 益,5 min 31伊(94 益 30 s,60 益
45 s,72 益 1 min),72 益 10 min.两次 PCR 产物均
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测.
1郾 3郾 3 RFLP分析与构建克隆文库摇 使用 PCR 产物
回收纯化试剂盒将每个样品第 2 次 PCR 产物的 3
个重复合并后纯化.纯化产物连接至 pMD鄄18T 载体
(TaKaRa,日本)并转化 Trans5琢 感受态细胞构建克
隆文库(共 6 个文库).每一克隆文库用灭菌牙签随
机挑取 94 个白斑,至 500 滋L含氨苄西林 LB液体培
养基中 37 益 12 h.取 1 滋L菌液作为模板进行插入
DNA 片段的重新扩增,引物为通用引物 M13鄄47 /
M13鄄48,扩增条件为:94 益 5 min,29伊(94 益 30 s,
60 益 30 s,72 益 1 min),72 益 10 min.经上述步骤,
共有 564 个白斑鉴定为阳性转化子.
用 HinfI 进行酶切(Thermos,德国)后,进行限
制性片段长度多态性 ( restriction fragment length
polymorphism,RFLP)分析 . 使用2%琼脂糖凝胶电
表 1摇 巢式鄄PCR引物列表
Table 1摇 List of primers used to nested鄄PCR
引物名称
Primer
pairs
序列(5忆寅3忆)
Sequence (5忆寅3忆)
扩增片段长度
Fragment size
(bp)
AML1 ATCAACTTTCGATGGTAGGATAGA 800
AML2 GAACCCAAACACTTTGGTTTC
NS31 TTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC 550
AM1 GTTTCCCGTAAGGCGCCGAA
泳检测酶切产物,并进行 RFLP 谱型划分. RFLP 谱
型只在同一克隆文库内比较. 每一 RFLP 谱型随机
挑取一个克隆子进行 DNA 序列测定(上海生工),
若测序结果不好或不能测出的克隆,则选取相同
RFLP类型的另一克隆子进行测序,共测序 110 条.
1郾 3郾 4 序列分析与构建系统发育树 摇 所有 DNA 序
列编辑后,利用 BLAST软件与 GenBank数据库进行
在线比对,利用 DUTOR软件将 97%的 DNA序列相
似水平划分序列类群 ( operational taxonomic unit,
OTU).共划分出 23 个序列类群,每个序列类群中随
机选出一条代表性序列.使用 Blast工具在 GenBank
数据库中获得与 23 条代表性序列 (GenBank 号:
KC465757鄄KC465779)相关的参考序列.代表序列与
参考序列采用 ClusterX软件处理后,用 Mega 5. 0 软
件进 行 Neighbor鄄Joining 系 统 发 育 分 析. 使 用
MaarjAM 数据库[17] ( http: / / maarjam. botany. ut. ee)
与本研究获得的 23 个 OTU 的代表序列进行比对,
将相似度逸97%鉴定为一个分子虚拟分类种.
Shannon多样性指数(H忆)和均匀度指数(Eh)
根据下式计算:
H忆=-移P i lnP i
Eh= H / lnS
式中: P i为第 i 个序列类型的相对多度; S 为每个
重复的序列类型数.
覆盖率(coverge,C)用来评估构建的文库能否
代表环境微生物的多样性,计算公式为:
C=(1-n / N)伊100
式中:n为克隆文库中单克隆的序列类型数;N 为用
于分析的克隆数.
物种丰度(species richness)为每个样品的序列
类型数占全部序列类型的百分比.
相对多度( relative abundance)为某物种的个体
数在群落总物种个体数的比率,即某种序列类型的
总克隆数 /样地内所有序列类型所对应的总克隆数
伊100% .
1郾 4摇 数据处理
采用 Microsoft Excel 2007 软件对数据进行处理
和绘图.使用 SPSS 18. 0 统计分析软件(LSD 法)对
丛枝菌根真菌侵染率、孢子密度、菌丝密度进行数据
差异显著性检验,使用 Fisher 确切概率法对丛枝菌
根真菌序列类群对应克隆数及不同科丛枝菌根真菌
的差异显著性进行检验[18-19] .
50529 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 周丽思等: 云南西双版纳野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌的分子多样性摇 摇 摇
2摇 结果与分析
2郾 1摇 绞股蓝根围丛枝菌根真菌的侵染强度、孢子密
度和菌丝密度
由表 2 可见,两生境绞股蓝根围丛枝菌根真菌
的孢子密度和菌丝密度均差异显著,而侵染强度无
显著差异.栽培绞股蓝根围土壤中的孢子密度显著
高于野生绞股蓝;而野生绞股蓝根围土壤中的菌丝
密度显著高于栽培绞股蓝.
表 2摇 野生与栽培绞股蓝根围丛枝菌根真菌侵染强度、孢子
密度和菌丝密度
Table 2 摇 Colonization, spore density and hyphal length
density of AM fungi of wild and cultured Gynostemma pen鄄
taphyllum
样品
Sample
侵染强度
Colonization
(% )
孢子密度
Spore density
(g-1)
菌丝密度
Hyphal length
density
(m·g-1)
野生 Wild 43. 9a 2. 90b 2. 44a
栽培 Cultured 36. 1a 5. 80a 1. 31b
同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0. 05) Different small
letters in the same column meant significant difference at 0. 05 level
among treatments.
2郾 2摇 绞股蓝根内丛枝菌根真菌克隆文库的构建及
其多样性分析
通过巢式鄄PCR 成功扩增出所有样品根内丛枝
菌根真菌 18S rDNA 序列. 对两个采样地点分别建
立 18S rDNA克隆文库(表 3).每个采样点有 3 个样
本,每个样本经蓝白班筛选和菌落 PCR 选出 94 个
阳性克隆,两个采样点的总克隆数均为 282 个,测序
后舍去非丛枝菌根真菌序列. 野生样品克隆文库获
得 274 个克隆子,栽培样品获得 277 个克隆子,覆盖
度均在 99%以上,可以较好地代表两个样本中丛枝
菌根真菌的多样性.
随后,使用 Hinf I限制性内切酶进行酶切后,获
得 RFLP条带类型,野生样本有 58 个 RFLP 条带类
型,栽培样本有 52 个. 使用 DOTUR 软件按 97%相
似度划分操作分类单元(OTU),共划分 23 个 OTU,
每个 OTU 中随机选取一条序列为代表序列(Gen鄄
Bank号:KC465757鄄KC465779);野生样本划分成 16
个 OTU,栽培样本划分成 15 个 OTU.说明在本研究
中,基于 18S rDNA 序列的野生和栽培绞股蓝根内
丛枝菌根真菌分子种类较丰富,Shannon 多样性指
数分别为 2. 24 和 2. 25.
2郾 3摇 系统发育分析与丛枝菌根真菌的群落组成
对划分出的 23 个 OTU中的代表序列进行系统
发育分析,绞股蓝根内丛枝菌根真菌种类可以划分
为 20 个序列类群(phylotype)(图 1),分别属于 6 个
科.其中 12 个属于 Glomeraceae,3 个属于 Acaulospo鄄
raceae,其余的分属于 Claroideoglomeraceae、Gigaspo鄄
raceae、Diversisporaceae、Paraglomeraceae 和 Ambispo鄄
raceae.其中 5 个可以鉴定到种(Bootstrap >70% ),
分别为 Glomus viscosum、Claroideoglomus etunicatum、
Racocetra tropicana、 Acaulospora spinosa、 Acaulospora
mellea.但是这 5 个序列类群并不是绞股蓝根内的优
势类群(表 4).
与在线 MaarjAM数据库比对后,12 个序列类群
可以划分为 12 个虚拟分子分类种(相似度>97% ,
表 4).这些虚拟分子种中包括野外样品中的优势类
群 Amb鄄1(VT00005)和 Glo鄄2(VT00156),以及栽培
样品中的优势类群 Glo鄄3 ( VT00166 ) 和 Glo鄄10
(VT00069).
2郾 4摇 野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌分布的
相对多度
由图 2 可见,所获得的 20 个序列类型在野生和
栽培绞股蓝根内的分布差异极显著,而且每个种类
所占的相对多度也有很大的差别. 在野生绞股蓝根
内,Glo鄄2、Amb鄄1、Para鄄1 为优势类群;而在栽培绞股
蓝根内,Glo鄄3、Glo鄄8、Glo鄄10、Div鄄1 为优势类群. 两
个生境并没有共有优势类群.
2郾 5摇 不同科丛枝菌根真菌在野生与栽培绞股蓝根
内分布的相对多度
由图 3 可见,所获得的 23 个序列类群分属于 7
个科,不同采样点丛枝菌根真菌的分布有极显著差
异.栽培绞股蓝根内的丛枝菌根真菌种类类主要集
中在 Glomeraceae和 Diversisporaceae;而野生绞股蓝
根内的丛枝菌根真菌种类更加丰富,Claroideoglom鄄
表 3摇 野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌 18S rDNA克隆文库
Table 3摇 Analyses of AM fungi 18S rDNA library constructed in wild and cultured Gynostemma pentaphyllum
样品
Sample
克隆数
No. of clone
RFLP条带类型数
No. of
RFLP types
OTU数
No. of
OTU types
覆盖率
Coverage
(% )
Shannon指数
Shannon index
均匀度
Eveness
丰富度
Richness
野生 Wild 274 58 16 99. 2 2. 24 0. 81 0. 70
栽培 Cultured 277 52 15 99. 6 2. 25 0. 83 0. 65
6052 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
图 1摇 野生与栽培绞股蓝根中丛枝菌根真菌 18S rDNA基因代表序列的 Neighbor鄄joining系统发育树
Fig. 1摇 Neighbor鄄joining phylogenetic tree inferred from representative sequences of AM fungi 18S ribosomal DNA gene identified in
wild and cultured Gynostemma pentaphyllum roots.
70529 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 周丽思等: 云南西双版纳野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌的分子多样性摇 摇 摇
图 2摇 野生(A)与栽培(B)绞股蓝根内丛枝菌根真菌序列类
型分布的相对多度
Fig. 2摇 Relative abundance of AMF phylotypes in wild (A) and
cultured (B) Gynostemma pentaphyllum roots.
表 4摇 野生与栽培绞股蓝根内丛枝菌根真菌种类
Table 4摇 Composition of AM fungi communities in wild and
cultured Gynostemma pentaphyllum roots
类型
Type
野生 /栽培的
根内克隆数
Clones in
wild / cultured
分子虚拟分类
Molecular
virtual taxon
相关种
Related species
Glo鄄1 1 / 2 - -
Glo鄄2 44 / - VT00156 -
Glo鄄3 9 / 47 VT00166 -
Glo鄄4 - / 1 VT00130 -
Glo鄄5 21 / 15 - -
Glo鄄6 3 / 2 VT00064 Glomus viscosum
Glo鄄7 - / 8 - -
Glo鄄8 - / 37 VT00204 -
Glo鄄9 - / 6 VT00072 -
Glo鄄10 2 / 68 VT00069 -
Glo鄄11 29 / 21 - -
Glo鄄12 1 / - - -
Cla鄄1 6 / - VT00057 Claroideoglomus etunicatum
Div鄄1 - / 43 - -
Gig鄄1 18 / 11 VT00041 Racocetra tropicana
Acau鄄1 16 / 14 VT00044 Acaulospora spinosa
Acau鄄2 13 / - VT00025 Acaulospora mellea
Acau鄄3 2 / - - -
Para鄄1 45 / 2 - -
Amb鄄1 64 / - VT00005 -
总计 Total 274 / 277
eraceae、 Gigasporaceae、 Acaulospraceae、 Paraglomer鄄
aceae和 Ambisporaceae分布的相对多度都高于栽培
样品 . 其中 , Claroideoglomeraceae和 Ambisporaceae
图 3摇 野生(A)与栽培(B)绞股蓝根内各科丛枝菌根真菌分
布的相对多度
Fig. 3摇 Relative abundance of AM fungi families in wild (A)
and cultured (B) Gynostemma pentaphyllum roots.
玉: Glomeraceae; 域: Claroideoglomeraceae; 芋: Diversisporaceae; 郁:
Gigasporaceae; 吁: Acaulosporaceae; 遇: Paraglomeraceae; 喻: Ambis鄄
poraceae.
丛枝菌根真菌仅在野生样本中出现,Diversisporace鄄
ae丛枝菌根真菌则仅在栽培样品中出现. Paraglom鄄
eraceae则在野生样本中出现的比率更高.
3摇 讨摇 摇 论
3郾 1摇 绞股蓝根内丛枝菌根真菌的种类
本研究采用巢式鄄PCR、RFLP 与克隆测序技术
相结合,并且两次采用丛枝菌根真菌特异性引物进
行扩增,真实地反映了特定时间侵染绞股蓝根系的
丛枝菌根真菌群落组成,从中获得了 23 个可操作分
类单元,并划分为 20 个序列类型,分属于 7 个科,其
中 5 个鉴定到种,12 个虚拟分类分子种.目前,研究
我国药用植物丛枝菌根真菌多样性大多采用孢子形
态学的方法.本研究所获得的 5 个可鉴定到种的可
操作分类单元,有 4 个种已在我国药用植物根围土
壤中发现. 其中,在细枝岩黄耆(Hedysarum scopari鄄
um ) [20]、薄荷(Mentha canadensis) [21]等根围土壤中
分离出 Acaulospora mellea,在三七 (Panax notogin鄄
seng) [22]、三角叶黄连(Coptis deltoidea) [23]等根围土
壤中获得 Acaulospora spinosa,在翠云草( Selaginella
uncinata)、火炭母 ( Polygonum chinense)、草珊瑚
(Sarcandra glabra)、海金沙(Lygodium japonicum)等
根围土壤中发现 Claroideoglomus etunicatum,在薯蓣
(Dioscorea polystachya) [24]、南方红豆杉(Taxus walli鄄
chiana var. mairei) [25]等根围土壤中获得 Glomus vis鄄
cosum.而 Racocetra tropicana未在我国药用植物根围
分离获得.这是由于扩增引物的设计大多都是基于
孢子形态鉴定数据,并且大部分从野外生态系统中
8052 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 24 卷
获得的丛枝菌根真菌物种目前还无法进行纯培养,
不能获得更为准确的核酸序列信息,使野外生态系
统中很大一部分丛枝菌根真菌的相关序列未能得到
有效扩增功能[26-27] . 同时,鉴定到种的 5 个序列类
型:Glo鄄6 (Glomus viscosum)、 Cla鄄1 ( Claroideoglomus
etunicatum )、 Gig鄄1 ( Racocetra tropicana )、 Acau鄄1
(Acaulospora spinosa)、Acau鄄2(Acaulospora mellea)都
是形态学研究中较丰富的种类,但其在克隆文库中
所对应的克隆数并不占优势,说明它们不是优势类
群.然而,本文中一些丛枝菌根真菌优势类群往往无
法被鉴定.这说明土壤中分布的丛枝菌根真菌群落
与植物根系中分布的群落有很大的差异[28] .
为了将采用分子生物学技术获得、未能鉴定到
种的丛枝菌根真菌序列类型的分布规律进行总结,
魻pik等[17]设计了一种虚拟的分类方式,基于 SSU
rDNA基因序列将丛枝菌根真菌在全球范围内的分
布特点展现出来,使之与生态学功能相联系.本文将
获得的 20 个序列类型与该 MaarjAM 数据库进行比
对,有 12 个序列类型具有相匹配的虚拟分类分子种
(molecular virtual taxon),其中包括野外样品中的优
势类群 Amb鄄1(VT00005)和 Glo鄄2(VT00156),栽培
样品中的优势类群 Glo鄄3 ( VT00166 ) 和 Glo鄄10
(VT00069).该数据库提供了各个虚拟分类分子种
的分布信息,包括采样点的生态系统类型、植被类
型、已发表文献等[29] . 在不能确定丛枝菌根真菌物
种及无法纯培养的条件下,可以通过以上信息对同
一虚拟分类分子种的分布及研究结果进行分析,总
结其分布规律、推测其在生态系统中的功能.
3郾 2摇 不同生境绞股蓝根内丛枝菌根真菌的种类
研究表明,不同生态系统中丛枝菌根真菌多样
性存在很大的差异[30],丛枝菌根真菌群落的功能也
不相同[31] . van de Heijen等[32]归纳了丛枝菌根真菌
的 9 种形态学特性和 4 种生理特性作用. 程俐陶
等[33]采用形态学鉴定方法对野生和栽培半夏
(Pinellia ternata)根围丛枝菌根真菌群落多样性进
行调查,发现了 21 个种,分属于 3 个属;但是不同采
样点的孢子种类和优势种不同,野生样品中优势种
为 Glomus mosseae,栽培样品中优势种为 Scutellospo鄄
ra castanea.本研究结果表明,野生与栽培环境下,绞
股蓝根内的丛枝菌根真菌群落组成存在很大差异.
在 20 个序列类群中,12 个序列类群属于 Glomerace鄄
ae,栽培样品中 Glomeraceae 也占了绝对优势,但在
野生样品中 Ambisporaceae 和 Paraglomeraceae 更具
优势.由此推测,丛枝菌根真菌种类的不同是造成栽
培药用植物成药品质降低的因素之一.
在侵染率没有显著差异的情况下,栽培样品的
孢子密度几乎是野生样品的一倍,菌丝密度却是野
生样品的 1 / 2. Hart 和 Reader[34]研究发现,与 Glo鄄
maceae 和 Acaulosporaceae 的丛枝菌根真菌相比,
Gigasporaceae的丛枝菌根真菌能产生更多的根外菌
丝,使植物获得更丰富的营养.本试验中 Glomerace鄄
ae根外菌丝并不丰富,可能是在栽培条件下,植物
不需要通过与丛枝菌根真菌的共生关系来获得营
养,而那些从共生关系中获得营养并产生大量繁殖
体的丛枝菌根真菌成为优势种群. 推测在野生环境
下,植物会选择可以帮助自己吸取营养的丛枝菌根
真菌来建立共生关系.因此,野生环境中植物根内的
丛枝菌根真菌将有可能成为更加优质的 “生物
肥料冶.
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作者简介摇 周丽思,女,1987 年生,硕士.主要从事药用植物
菌根生物学研究. E鄄mail: zls921203@ sina. com
责任编辑摇 李凤琴
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