全 文 ：出芽短梗霉 F4 的溶磷能力及机理*
王摇 丹摇 詹摇 婧摇 孙庆业**
(安徽大学资源与环境工程学院, 合肥 230601)
摘摇 要摇 从安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼根际分离筛选出的出芽短梗霉 F4,以磷酸钙、磷
酸铝、磷酸铁和磷矿粉 4 种不同磷源进行液体培养,测定培养液的 pH、水溶性磷、菌体磷及有
机酸含量.结果表明: 菌株 F4 对不同磷源的溶磷能力为:磷酸铝>磷酸铁、磷酸钙>磷矿粉,溶
磷量均高于 200 mg·L-1;培养液 pH 在 48 h 内迅速下降,以磷酸铝、磷酸铁为磷源的培养液
pH下降幅度明显大于磷酸钙与磷矿粉.出芽短梗霉 F4 产生的有机酸主要为草酸、柠檬酸和
酒石酸,其中,以草酸为主.菌株的溶磷能力与有机酸无显著相关性,而与 pH 呈显著相关.接
种出芽短梗霉 F4 时加入葡萄糖,尾矿中速效磷含量显著增加,说明出芽短梗霉 F4 在尾矿生
态修复中具有潜在的应用价值.
关键词摇 溶磷真菌摇 溶磷能力摇 有机酸摇 铜尾矿
文章编号摇 1001-9332(2014)07-2079-06摇 中图分类号摇 X172, X5171. 5摇 文献标识码摇 A
Phosphate solubilization of Aureobasidium pullulan F4 and its mechanism. WANG Dan,
ZHAN Jing, SUN Qing鄄ye (School of Resources and Environmental Engineering, Anhui University,
Hefei 230601, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. , 2014, 25(7): 2079-2084.
Abstract: The Aureobasidium pullulans F4 was isolated from the rhizosphere of Hippochaete ramosis鄄
simum in Tongguanshan mine wasteland in Tongling City, Anhui Province. Liquid culture was con鄄
ducted with four kinds of phosphorus sources, calcium phosphate, aluminum phosphate, ferric
phosphate and rock phosphate to determine the pH, dissolved phosphorus, phosphorus in the bacte鄄
ria and organic acid in the solution. The results showed that the phosphate solubilization by A. pul鄄
lulans F4 varied with phosphorus sources, which decreased in order of aluminum phosphate > ferric
phosphate,calcium phosphate > rock phosphate. The amounts of dissolved phosphorus in the differ鄄
ent treatments were all higher than 200 mg·L-1 . The pH of the medium dropped immediately in 48
h, and the aluminum phosphate and ferric phosphate treatments showed a greater decrease in pH
than the calcium phosphate and rock phosphate treatments. The organic acid synthesized by A. pul鄄
lulans F4 included oxalic acid, citric acid and tartaric acid, and oxalic acid, among which oxalic
acid was the dominated component. The phosphate dissolving capacity of A. pullulans F4 showed no
significant correlation with organic acid, but significantly correlated with the pH. The available
phosphorus was significantly improved with the combined application of A. pullulans F4 and glu鄄
cose, suggesting A. pullulans F4 was a potent candidate for remediation of copper mine wastelands.
Key words: phosphate鄄solubilizing fungi; phosphate鄄solubilizing capability; organic acid; copper
mine tailings.
*国家自然科学基金项目(41171418)资助.
**通讯作者. E鄄mail: sunqingye@ ahu. edu. cn
2013鄄10鄄26 收稿,2014鄄04鄄17 接受.
摇 摇 磷是植物生命活动不可缺少的重要营养元素,
微生物是土壤磷素循环转化的动力之一[1],利用微
生物来解决土壤磷素不足正日益引起国内外学者的
关注[1-2] .能够将矿物态磷转化为植物可吸收利用
形态的微生物称为溶磷微生物[3],已报道的溶磷微
生物包括细菌、真菌以及放线菌,真菌主要包括青霉
(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、镰
刀菌(Fusarium)和小菌核菌( Sclerotium),其中,对
青霉和曲霉的报道居多[4-5] .研究表明,不同菌株的
溶磷能力差异很大,即使是同一菌株对不同磷酸盐
的溶解能力也有很大差异[6-9] .
溶磷微生物的溶磷机理各不相同,多数研究认
为,溶磷微生物产生的低分子有机酸具有酸解及螯
应 用 生 态 学 报摇 2014 年 7 月摇 第 25 卷摇 第 7 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Jul. 2014, 25(7): 2079-2084
合的双重作用[4,8-9];一些溶磷菌代谢过程分泌质子
使得 pH值降低,从而将难溶磷溶解[10-11];也有报道
称,多糖在溶磷过程中起到了不可忽视的作用[12],
多糖能够改变单纯有机酸对磷酸钙的活化动态平
衡,并推动平衡向难溶磷的溶解方向移动,表现出磷
酸钙活化过程中多糖与有机酸之间的协同效应,同
一菌株也可能存在多种溶磷机理[8,12] .
对于溶磷菌的研究多集中在对农作物根际溶磷
菌的研究[1,13-16],适用范围有限,而对极端环境中溶
磷菌的筛选及应用报道较少[17] .尾矿是矿石经粉碎
浮选精矿后余下的微粒状固体粉末[18],植物修复技
术是目前被广泛接受的尾矿废弃地修复方法[19],但
尾矿中植物生长所需的速效磷含量极低,难以满足
植物生长需要[20],而溶磷菌可增加速效磷含量,对
废弃地植被恢复产生积极作用.
本实验室从安徽省铜陵市铜官山尾矿库木贼
(Hippochaete ramosissimum)根际中分离筛选出一株
具有溶磷能力的真菌 F4,经鉴定该菌株为出芽短梗
霉(Aureobasidium pullulans) [21] . 出芽短梗霉是一种
具有酵母型和菌丝形态的多形真菌,在遗传上具有
不稳定性,可形成许多变种. 目前,关于出芽短梗霉
的研究多限于其所产生的多糖及黑色素方面[22-24] .
本文对出芽短梗霉 F4 的溶磷能力、溶磷过程中 pH
变化以及分泌的有机酸进行初步研究,探讨其对不
同难溶磷的溶解效果及在铜尾矿废弃地生态修复中
的应用前景.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试菌株与培养基
供试出芽短梗霉菌株 F4 为本实验室从铜尾矿
废弃地优势植物木贼根际土中筛选并保存,具有酵
母态及丝状两种形态.
种子培养基采用 PDA培养基,无机磷培养基采
用 PKO 培养基[25],其中,磷酸盐为: Ca3 ( PO4 ) 2、
AlPO4、FePO4、磷矿粉.每升培养基中加入相同含量
的磷(500 mg).
1郾 2摇 出芽短梗霉 F4 摇瓶培养及其溶磷能力测定
种子液的制备:将保存的菌种在固体种子培养
基上进行活化,培养 72 h 后制成孢子悬液(菌数约
为 107 cfu·mL-1).
分别取 1 mL种子悬液接入到盛有 200 mL培养
基的 500 mL三角瓶中,同时设定不接种为对照,于
摇床中培养(180 r·min-1,30 益),每处理 3 个重
复.每隔 24 h在无菌条件下从各培养基中吸取 8 mL
用于水溶性磷、菌体磷、pH 和有机酸的测定. 溶液
pH用 pH 计测定. 取 5 mL 菌液于 4 益下 12000
r·min-1离心 5 min.上清液用钼蓝比色法测定磷含
量[8],溶磷量为接种与不接种培养基含磷量的差
值;沉淀的菌体用蒸馏水洗涤离心 3 次,用硫酸鄄双
氧水进行消煮后,采用钼蓝比色法测定菌体磷含
量[8] .剩余 3 mL 菌液过 0. 22 滋m 滤膜后用高效液
相色谱(Waters 2695)进行有机酸测定,测定条件:
色谱柱为 Sepax Technotogies 公司生产的 Carbomix
H鄄NP5 (7. 8 伊300 mm,5 滋m),柱温 50 益,流动相
2郾 5 mmol·L-1H2SO4,流速为 0. 6 mL·min-1,进样
量 10 滋L,冲洗方式为等梯度冲洗,紫外检测波长为
210 nm.
1郾 3摇 出芽短梗霉 F4 对铜尾矿中矿物态磷的溶解
试验
取 250 mL三角瓶 30 个,每个三角瓶中装入 50
g铜尾矿,用去离子水调节铜尾矿含水量至 20% ,具
体试验设计见表 1,每处理 3 个重复.放置培养箱中
于 30 益恒温培养,第 15 天进行取样,采用 pH 计测
定尾矿 pH值[M(尾矿) 颐 V(水) = 1 颐 2. 5],速效
磷含量采用碳酸氢钠浸提,钼蓝比色法测定[8] .
1郾 4摇 统计分析
试验数据采用 SPSS 16. 0 软件进行差异显著性
检验(Duncan法)及相关性分析(Pearson 法),Excel
2003 作图.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 培养液中水溶性磷与菌体磷的变化
由图 1 可以看出,在以磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁、
表 1摇 试验设计
Table 1摇 Design of the experiment
编码
Code
加入菌株形态
Strain morphological
for incubation
葡萄糖
Glucose
(g·kg-1)
灭菌
Sterilization
MJ 酵母态 0 是
MS 丝状体 0 是
MJG 酵母态 0. 5 是
MSG 丝状体 0. 5 是
WJ 酵母态 0 否
WS 丝状体 0 否
WJG 酵母态 0. 5 否
WSG 丝状体 0. 5 否
CK - 0 否
WG - 0. 5 否
葡萄糖以溶液的形式向尾矿中加入 Glucose was added to the tailings
in the form of solution; 121 益灭菌 120 min, 灭菌 3 次 120 min sterili鄄
zation for three times at 121 益 .
0802 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
图 1摇 不同磷源培养液中水溶性磷及菌体磷含量变化
Fig. 1摇 Dynamics of water鄄soluble phosphorus and phosphorus in F4 in different phosphate mediums.
A: 磷酸钙 Calcium phosphate; B: 磷酸铝 Aluminum phosphate; C: 磷酸铁 Ferric phosphate; D: 磷矿粉 Rock phosphate. 下同 The same below. 玉:
菌体磷 Phosphorus in F4; 域: 水溶性磷 Water鄄soluble phosphorus.
磷矿粉为磷源的培养液中,水溶性磷含量分别在 48、
72、96和 48 h 达到最大值,分别为 96. 41、286郾 89、
129. 59 和 12. 34 mg·L-1 . 以磷酸钙为磷源时接种
出芽短梗霉 F4 的培养液中,菌体磷随时间的增加而
增加,于 168 h达到最大值(216. 03 mg·L-1),其余
各组菌体磷均在 120 h出现最大值,分别为 190郾 93、
223. 57 和 322. 97 mg·L-1 . 以磷酸铝为磷源时,菌
株解离出来的磷在溶液中所占的比例高于菌体磷,
其余各组解离出来的磷则更多地用于菌株的生长.
2郾 2摇 培养液的 pH和有机酸的变化
由图 2 可以看出,接种出芽短梗霉 F4 后,以磷
酸钙、磷酸铝、磷酸铁和磷矿粉为磷源的培养液 pH
在48 h内迅速降至较低水平,分别达到5. 10、2. 90、
图 2摇 不同磷源培养液中 pH的变化
Fig. 2摇 Dynamics of pH in different phosphate mediums.
2. 80 和 5. 74.其中,以磷酸铝和磷酸铁为磷源的培
养液 pH下降幅度较大,分别下降 4. 6 和 4. 7 个单
位;而以磷酸钙和磷矿粉为磷源的培养液 pH 下降
幅度分别为 2. 40 和 1. 76. 随着培养时间的延长,4
种培养液的 pH值均在低水平波动.
摇 摇 有机酸分析表明,以磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁和
磷矿粉为磷源条件下,出芽短梗霉 F4 产生的有机酸
主要为草酸、柠檬酸和酒石酸,有机酸含量因磷源种
类而异,总体上以草酸含量最高(图 3).以磷酸钙为
磷源时 3 种有机酸变化趋势较为一致,在 0 ~ 72 h
内变化幅度小,96 h 时草酸、柠檬酸和酒石酸分别
达到 2. 98、2. 48 和 3. 85 mmol·L-1,96 h 后又迅速
下降至 0. 70、0. 20 和 0 mmol·L-1,随后变化趋于
平稳.以磷酸铝为磷源时,144 h 内草酸含量为
0 ~ 0郾 58 mmol · L-1,随后显著上升,达到 3郾 03
mmol·L-1,而柠檬酸含量在 72 h 内随时间的增加
而增高,由 0. 02 mmol·L-1增加至 0. 10 mmol·L-1,
而后减少至 0,于 144 h 时含量显著提高,达到 0郾 37
mmol·L-1,而酒石酸仅在 72 h 内出现.以磷酸铁为
磷源时,草酸含量波动变化,而酒石酸仅在 24 h 内出
现,含量为 0. 03 mmol·L-1 .以磷矿粉为磷源时,3 种
有机酸在 120 h前波动变化,在 120 h后均未检出.
2郾 3摇 水溶性磷与有机酸、pH的关系
不同磷源条件下,接种出芽短梗霉 F4 的培养液
18027 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 王摇 丹等: 出芽短梗霉 F4 的溶磷能力及机理摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 3摇 不同磷源培养液中有机酸含量变化
Fig. 3摇 Dynamics of organic acid content in different phosphate mediums.
玉: 草酸 Oxalic acid; 域: 柠檬酸 Citric acid; 芋: 酒石酸 Tartaric acid.
图 4摇 不同处理下铜尾矿 pH和速效磷的变化
Fig. 4摇 Changes of pH and available phosphorus in the copper
mine tailings under different treatments.
不同字母表示处理间差异显著(P<0. 05) Different letters meant sig鄄
nificant difference among treatments at 0. 05 level.
中水溶性磷含量与 pH 呈显著负相关( r = -0郾 753,
P<0. 05),以磷酸钙、磷酸铝、磷酸铁以及磷矿粉为
磷源时相关系数分别为-0. 865、-0. 963、-0. 974、
-0. 662(P<0. 05). 除以磷酸钙为磷源时水溶性磷
含量与草酸含量呈显著正相关( r = 0. 405,P<0. 05)
外,其他磷源作用下有机酸含量与水溶性磷含量无
显著相关性,pH的下降可能是导致各种难溶磷酸盐
中磷释放的主要原因.
2郾 4摇 溶磷菌对铜尾矿中矿物态磷的溶解
为了进一步研究不同形态出芽短梗霉 F4 对尾
矿中矿物态磷的溶解,将不同处理出芽短梗霉 F4 接
种于铜尾矿进行培养.由图 4 可以看出,只添加出芽
短梗霉 F4(酵母态或丝状)处理的尾矿 pH 和速效
磷含量与对照无显著差异. 同时施加葡萄糖和出芽
短梗霉 F4(酵母态或丝状)能显著增加速效磷含量
(P<0. 05),未灭菌处理整体上较灭菌处理速效磷含
量高. 铜尾矿的 pH 与速效磷呈显著负相关 ( r =
-0. 485,P<0. 01),出芽短梗霉 F4 引起的尾矿 pH
下降有利于铜尾矿中矿物态磷的溶解.
3摇 讨摇 摇 论
溶磷微生物溶解难溶性磷酸盐的能力主要由菌
株的自身特性决定[5],不同种类溶磷微生物的溶磷
能力差别很大[3-7] .孙珊等[7]筛选的 57 株溶磷菌以
磷酸钙为磷源的培养液中 72 h的溶磷量在 53. 29 ~
224. 51 mg·L-1 .黄伟等[17]分离的 7 株溶磷菌对磷
酸钙的溶解能力为 11. 27 ~ 136. 27 mg·L-1 .本研究
中,出芽短梗霉 F4 对磷酸钙、磷酸铝和磷酸铁的溶
磷量均大于 200 mg·L-1,表现出很好的溶解性能.
Illmer和 Schinner[11]认为,溶磷菌所溶解出来的磷
2802 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷
成为菌体磷的比例不到 1% ;但赵小蓉和林启美[5]、
Elizabeth等[26]认为,溶磷菌溶磷能力必须考虑溶磷
微生物自身生长所固持的磷. 本研究表明,以磷酸
钙、磷酸铁和磷矿粉为难溶性磷源时,菌体磷含量均
大于溶液中磷含量,故菌体磷不应被忽略.
与磷酸铁、磷酸铝相比,磷酸钙更易被解离,故
多数研究表明,溶磷菌对磷酸钙的溶解能力大于磷
酸铝和磷酸铁[8,27] . 赵小蓉等[8]以不同难溶性磷酸
盐作为培养基,发现大多数菌株较易溶解磷酸钙,其
次是磷酸铝,而对磷酸铁的溶解都比较弱. 戴沈艳
等[27]从江西红壤稻田耕作层土壤中分离出的菌株
Y5,对磷酸钙的溶磷度为 159. 1 mg·L-1,但对磷酸
铝和磷酸铁的溶解度仅为 2. 1 和 1. 2 mg·L-1 .而出
芽短梗霉 F4 对 4 种不同磷源的溶磷效果为磷酸铝
>磷酸铁、磷酸钙>磷矿粉. Kucey[28]发现,许多菌株
对磷酸钙的溶磷度比磷矿粉大;而本研究中,以磷矿
粉为磷源的培养基中水溶性磷含量仅为 9郾 89
mg·L-1,远小于其他 3 种难溶磷培养液中溶解态磷
含量,但其菌体磷含量显著大于其他磷源. Kucey[28]
可能未考虑到菌体所固有的磷.本研究中,以磷矿粉
为磷源时菌株产生了大量的多糖及黑色素,部分溶
解磷可能被吸附在菌体表面,使得菌体磷含量较高.
有研究认为,溶磷菌溶解无机磷是由于溶磷微
生物在生长过程中产生各种有机酸,有机酸在降低
培养液 pH的同时,与钙、铁、镁等离子螯合,从而释
放难溶性磷酸盐中的磷[7-8] . Illmer 和 Schinner[11]认
为,产生有机酸只是溶磷的一个方面,而伴随着呼吸
或同化 NH4 +时 H+的释放是溶磷的另一个重要机
制.本研究中,出芽短梗霉 F4 分泌的有机酸有草酸、
柠檬酸和酒石酸,这与其他溶磷菌产生的有机酸种
类相似[7-9],但其有机酸含量较低,且与菌体的溶磷
量无显著相关性,有机酸对溶磷贡献较小.溶磷菌对
磷酸盐的溶解效果,因无机磷源的化学结构和菌株
本身的性质而异[5] . 大量研究表明,出芽短梗霉在
发酵时 pH随着时间的延长而降低,且发酵前期是
产酸高峰期[29-30] .本研究中,接种出芽短梗霉 F4 的
4 种培养基 pH 均在 48 h 内迅速降至较低水平,这
可能与出芽短梗霉自身的发酵性质有关. 出芽短梗
霉 F4 在 4 种难溶性磷酸盐的培养基中的溶磷量均
与 pH呈显著负相关,pH 降低,氢离子浓度升高,难
溶性磷酸盐溶解平衡发生迁移,变为可溶性的二氢
盐.本研究中以磷酸铝和磷酸铁为磷源的培养基的
pH降低幅度要比以磷酸钙和磷矿粉为磷源的培养
液大,从而导致溶磷效果好.
溶磷微生物的溶磷能力受基质 pH 值、温度、重
金属离子等的影响[7],因此即使纯培养条件下具有
很强溶磷能力的溶磷微生物,各种不利因素也会导
致其实际应用效率的降低.因此,溶磷微生物的应用
研究具有重要意义.研究表明,只向尾矿中施入出芽
短梗霉 F4 不能有效增加尾矿磷含量,而同时添加有
机物质葡萄糖,能够显著提高尾矿速效磷含量,这可
能是由于尾矿中有机物质的缺乏不利于出芽短梗霉
F4 的生长、繁殖,通过向尾矿中添加生物所需要的
碳源能够促进出芽短梗霉 F4 的存活和溶磷作用的
发挥[31] .同时,有机物质能够通过对重金属的络合
(螯合),在一定程度上降低溶磷菌可能引起的铜尾
矿中重金属的迁移.
4摇 结摇 摇 论
出芽短梗霉 F4 对 4 种难溶性磷酸盐溶磷能力
大小依次为磷酸铝>磷酸铁、磷酸钙>磷矿粉,溶磷
量均超过 200 mg·L-1,出芽短梗霉 F4 表现出较强
的溶磷能力,溶磷量与 pH 呈显著相关,pH 降低可
能是引起出芽短梗霉 F4 溶磷的主要原因.对于养分
贫瘠的铜尾矿,出芽短梗霉 F4 与有机物质葡萄糖的
共同施入能够有效提高尾矿速效磷含量,但酸性物
质增加可能导致的重金属释放及有机物质对重金属
的固定等问题还有待于进一步研究.
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作者简介摇 王摇 丹,女,1988 年生,硕士研究生.主要从事环
境修复技术研究. E鄄mail: shuiwuyou123@ gmail. com
责任编辑摇 肖摇 红
4802 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 25 卷