全 文 ：钩距虾脊兰 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
彭德镇 ,孙小琴 ,孔令杰 ,李恩香 ,杨柏云＊　(南昌大学生命科学学院 ,江西南昌 330031)
摘要　[目的 ]为钩距虾脊兰种质资源研究奠定基础。 [方法]以钩距虾脊兰为试验材料 ,利用改良的 CTAB法提取钩距虾脊兰基因组
DNA,并对影响 ISSR扩增反应的各因素进行优化。 [结果]获得了高质量的钩距虾脊兰基因组 DNA;同时 , 建立了最适的钩距虾脊兰
ISSR-PCR体系 ,即 25μlPCR反应体积中 , 2.5μl10×PCRbufer, 2.0mmol/LMgCl2 , 100ng模板 DNA, 240 μmol/LdNTPs, 1.75UTaqDNA聚合酶 , 0.4μmol/L引物;最佳扩增程序为 94℃预变性 5min,然后进行 40个循环:94℃变性 30s,复性温度根据各引物的 TM值
略低 1～ 2℃, 30s, 72 ℃延伸 50s,循环结束后 72℃延伸 7min, 4℃保存。 [结论]这一优化系统的建立为进一步利用 ISSR分子标记
技术进行钩距虾脊兰遗传多样性研究提供了基础。
关键词　钩距虾脊兰;DNA提取;ISSR分子标记
中图分类号　S682.31　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)31-15160-03
EstablishmentandOptimizationofISSR-PCRReactionSystemforCalanthegracilifloraHayata
PENGDe-zhenetal　(ColegeofLifeSciences, NanchangUniversity, Nanchang, Jiangxi330031)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtolaythefoundationforthegermplasmresourcesresearchesofCalanthegracilifloraHayata.
[ Method] WithC.gracilifloraasthetestmaterials, thegenomicDNAwasextractedfromC.graciliflorabyusingimprovedCTABmethod.Dif-
ferentfactorsthatafectedISSRamplificationreactionwereoptimized.[ Result] High-qualitygenomicDNAwasobtainedfromC.graciliflora
Hayata.AndthereactionsystemandamplifiedprocedurethatweresuitableforC.gracilifloraHayatawereasfolows:25μlamplificationreac-
tionssystemcontained2.5μl10×PCRbufer, 2.0mmol/LMgCl2 , 100 nggenomicDNA, 240μmol/LdNTPs, 1.75UTaqDNApolymeraseand0.4 μmol/LISSRprimer.Theoptimalamplifiedprocedurewasasfolows:pre-denaturingfor5 minat94 ℃, 40cyclesofdenaturingfor
30 sat94 ℃, annealingfor30sdueto1-2 ℃lowerthandenaturingtemperatureofdiferentprimer, extendingfor50sat72℃, finalyex-
tendingfor7minat72℃ andpreseringat4℃.[ Conclusion] Theoptimalsystemcouldprovideabasisforfurtherstudyongeneticdiversity
ofC.gracilifloraHayatabyISSRmolecularmarker.
Keywords　CalanthegracilifloraHayata;DNAextraction;ISSR
基金项目　国家环保总局项目(20061A0013)。
作者简介　彭德镇(1986-),男 ,江西九江人 , 硕士研究生 ,研究方向:
植物分子生物学。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2009-06-23
　　钩距虾脊兰(CalanthegracilifloraHayata)属于兰科(Or-
chidaceae)虾脊兰属(Calanthe),是多年生草本陆生兰 ,江西
省内均有分布 [ 1] 。兰科植物多为珍稀濒危植物 ,全世界所有
野生兰科植物均被列入 《野生动植物濒危物种国际贸易公
约 》的保护范围 ,占该公约应保护植物的 90%以上 [ 2] 。近年
来 ,由于钩距虾脊兰慢慢地被人们所发掘和利用 ,其自然生
境和野生资源遭到了严重的破坏。我国目前关于兰科植物
的研究主要集中在形态学 、分类学 、生理学 、孢粉学 、区系地
理学 、繁殖生物学和菌根共生等方面 [ 3-6] ,而关于居群遗传
学的研究则很少。近年来 ,应用 ISSR技术对植物进行遗传
多样性的研究已有较多报道 [ 7-10] ,而采用 ISSR技术对野生
钩距虾脊兰的遗传多样性和居群遗传结构进行的研究目前
尚未有报道。
1　材料与方法
1.1　材料　钩距虾脊兰(CalanthegracilifloraHayata)试验样
品采自江西省赣州市安远县的自然居群 ,采集 18个凭证标
本供研究用。提取 DNA使用比较幼嫩的叶片 ,样品用硅胶
干燥法进行干燥 [ 11] 。
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取及检测。采用改良的 CTAB法提取基因
组 DNA,具体步骤为:①取 0.05g硅胶干燥的叶片 ,置于 1.50
ml离心管中 ,加入 0.01 gPVP粉 ,加液氮研磨成粉末 ,加入
65℃预热的 0.75 ml2×CTAB缓冲液(pH值 8.0)、20.00μl
β-硫基乙醇 , 65℃水浴 50min,水浴过程每隔 10 min轻轻摇
动;②冷却至室温 ,加 0.75 ml氯仿∶异戊醇(24∶1),混合均
匀 , 12 000 r/min离心 10 min;③吸取上清液 ,加等体积的氯
仿∶异戊醇(24∶1)再离心抽提 1次;④取上清液 ,加入 0.50倍
体积的 5.00mol/LNaCl,混匀 ,加入等体积 -20 ℃预冷的异
丙醇 ,轻轻摇匀 ,放置 2.0h或过夜;⑤12 000 r/min离心 10
min,使 DNA附着在离心管管底 ,弃水相;⑥加 70%乙醇洗
涤 2次 ,用无水乙醇洗涤 1次 ,风干;⑦用适量的 0.1×TE溶
解 DNA, -20 ℃长期保存备用。通过琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计对 DNA进行检测。用 1.0%琼脂糖电泳检测
DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度 [ DNA纯度用
OD260 /OD280的比值来检测;DNA浓度(μg/ml)=OD260 ×50×
稀释倍数 ] ,计算 DNA获得率 (DNA量 /所用叶片量 ×
100%)。
1.2.2　ISSR-PCR条件筛选 。引物参照哥伦比亚大学提供
的序列(UBC810 ～ UBC900),由上海生物工程技术服务有
限公司合成 ,引物使用浓度为 5.00 μmol/L。TaqDNA聚合
酶 、dNTPs及相应缓冲液购自上海博彩生物有限公司。反应
体系为 25.00 μl,其中 10×bufer2.50 μl,引物浓度为 0.40
μmol/L,为确定 PCR反应中其他因素(DNA模板 、TaqDNA
聚合酶 、Mg2+和 dNTPs)的最佳水平 , DNA的浓度分别为 75、
100、200、400、800 ng, Taq酶浓度为 1.00、1.25、1.50、1.75、
2.00 U, Mg2+的浓度分别为 1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L, dNTPs
的浓度为 120、160、200、240、280 μmol/L。
1.2.3　ISSR引物筛选 。ISSR引物根据加拿大 BritishCo-
lumbia大学公布的序列设计 ,由上海生物工程技术服务有限
公司合成 ,编号为 UBC810 ～ UBC900,共 96条引物。
1.2.4　电泳和拍照 。用含有 0.1%EB的 1.5%琼脂糖凝胶
对 PCR扩增产物进行电泳。在 100 V稳压和 100 mA电流
下电泳约 50 min,电泳后的凝胶在凝胶成像仪下拍照并
保存。
责任编辑　李菲菲　责任校对　傅真治安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(31):15160-15162
2　结果与分析
2.1　DNA模板浓度对 ISSR-PCR反应的影响　从图 1可
以看出 ,模板浓度在 75 ～ 200 ng均能得到清晰 、稳定的条带 ,
基本没有非特异性扩增 ,产物稳定;模板浓度高达 400 ng以
后 ,虽也能扩增出条带 ,但随着浓度的升高 ,条带弥散现象明
显;模板浓度达到 800 ng就完全不能扩增出条带。从图 1中
还可以发现 ,模板浓度在 100ng时扩增出的条带最清晰 。
注:1～ 5.模板浓度 800ng;6 ～ 10.模板浓度 400ng;11～ 15.模板浓
度 200ng;16～ 20.模板浓度 100ng;21～ 25.模板浓度 75ng。
Note:1-5.templateconcentrationof800ng;6-10.templatecon-
centrationof400ng;11-15.templateconcentrationof200ng;
16-20.templateconcentrationof100 ng;21-25.template
concentrationof75ng.
图 1　DNA浓度对ISSR扩增的影响
Fig.1　EffectsofDNAconcentrationonISSRamplification
2.2　TaqDNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR反应的影响　在
不同 TaqDNA聚合酶浓度梯度下 , PCR扩增结果见图 2。从
图 2可以看出 ,随 TaqDNA聚合酶浓度升高呈梯度变化 ,但
不同浓度下产物的差异较大 。当 TaqDNA聚合酶浓度为
1.00 ～ 1.75 U时 ,有较亮条带出现;浓度达到 2.00 U时 ,条
带数目较少且不清晰。当 TaqDNA聚合酶浓度为 1.75 U
时 , PCR扩增产物能得到清晰稳定的条带 ,且无非特异性扩
增 ,背景较暗。因此 , TaqDNA聚合酶浓度在该组试验中的
最适浓度为 1.75U。
注:1～ 5.TaqDNA聚合酶浓度 1.00U;6～ 10.TaqDNA聚合酶浓度
1.25U;11～ 15.TaqDNA聚合酶浓度 1.50U;16～ 20.TaqDNA聚
合酶浓度 1.75U;21～ 25.TaqDNA聚合酶浓度 2.00U。
Note:1-5.TaqDNApolymeraseconcentrationof1.00U;6-10.
TaqDNApolymeraseconcentrationof1.25U;11-15.Taq
DNApolymeraseconcentrationof1.50U;16-20.TaqDNA
polymeraseconcentrationof1.75U;21-25.TaqDNApoly-
meraseconcentrationof2.00U.
图 2　TaqDNA聚合酶对 ISSR扩增的影响
Fig.2　EffectsofTaqDNApolymeraseonISSRamplification
2.3　Mg2+浓度对 ISSR-PCR反应的影响　从图 3和图 4可
以看出 ,电泳结果随 Mg2+浓度升高而呈梯度变化 , 4个浓度
梯度都检测到电泳条带。 Mg2+浓度为 1.5 mmol/L时有条带
出现 ,但数目较少;当浓度过高 ,达 2.5 mmol/L以上时 ,背景
较亮 ,且条带模糊不清 ,非特异性扩增较多。整体比较可以
得出 , Mg2+浓度在 2.0 mmol/L时 , PCR能得到清晰稳定的条
带 ,且无非特异性扩增 ,背景较暗 ,为最适合浓度。因此 ,
Mg2+浓度在该试验中采用 2.0mmol/L。
注:1～ 12.Mg2+浓度为 1.5mmol/L;13～ 24.Mg2+浓度为 2.0mmol/L。
Note:1-12.Mg2+ concentrationof1.5mmol/L;13-24.Mg2+ con-
centrationof2.0mmol/L.
图 3　Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.3　EffectofMg2+concentrationonISSRamplification
注:1～ 12.Mg2+浓度为 2.5mmol/L;13～ 24.Mg2+浓度为 3.0mmol/L。
Note:1-12.Mg2+concentrationof2.5mmol/L;13-24.Mg2+con-
centrationof3.0mmol/L.
图 4　 Mg2+浓度对 ISSR扩增的影响
Fig.4　EffectofMg2+concentrationonISSRamplification
2.4　dNTPs的浓度对 ISSR-PCR反应的影响　从图 5可以
看出 ,试验所采用的 dNTPs浓度对扩增的影响并不明显。
160～ 280 μmol/L时得到的产物基本一致 ,但过高或过低的
浓度都使得 PCR产物较为模糊。因此 ,选用中间的浓度 240
μmol/L进行后续的研究 ,该浓度的条带清晰 ,背景较暗。
注:1 ～ 5.dNTPs浓度为 120 μmol/L;6 ～ 10.dNTPs浓度为 160
μmol/L;11～ 15.dNTPs浓度为 200 μmol/L;16～ 20.dNTPs浓
度为 240μmol/L;21 ～ 25.dNTPs浓度为 280μmol/L。
Note:1-5.dNTPsconcentrationof120μmol/L;6-10.dNTPscon-
centrationof160μmol/L;11-15.dNTPsconcentrationof200
μmol/L;16-20.dNTPsconcentrationof240 μmol/L;21-
25.dNTPsconcentrationof280μmol/L.
图 5　dNTPs浓度对ISSR扩增的影响
Fig.5　EfectsofdNTPsconcentrationonISSRamplification
2.5　引物筛选的结果(表 1)　筛选 DNA模板浓度时 ,同时
各浓度梯度依次筛选 810、821、822、825、828 5个引物 ,如图 1
1516137卷 31期　　　　　　　　　　　　　　　　彭德镇等　钩距虾脊兰 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
筛选出 810、822、825、828。筛选 TaqDNA聚合酶浓度时 ,同
时各浓度梯度依次筛选 843、856、885、886、888 5个引物 ,如
图 2筛选出 843、856、886。筛选 Mg2+浓度时 ,同时各浓度梯
度依次筛选 834、836、840、846、843、849、852、853、855、856、
858、860这 12个引物 ,如图 3和图 4筛选出 840、843、855、
856。筛选 dNTPs浓度时 ,同时各浓度梯度依次筛选 811、
815、855、887、889这 5个引物 ,如图 5筛选出 811、815、855、
887、889。
表 1　ISSR-PCR反应体系各成分优化试验设计
Table1　OptimumdesignofcomponentsforISSR-PCRreactionsystem
序号
No.
　序列
　Sequences
序号
No.
　序列
　Sequences
810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA
811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 855 ACACACACACACACACYT
815 CTCTCTCTCTCTCTCTG 856 ACACACACACACACACYA
822 TCTCTCTCTCTCTCTCA 886 VDVCTCTCTCTCTCTCT
825 ACACACACACACACACT 887 DVDTCTCTCTCTCTCTC
828 TGTGTGTGTGTGTGTGA 889 DBDACACACACACACAC
840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT
　注:N=(A, C, T, G);R=(A, G);Y=(C, T);B=(C, G, T);D=(A, G,
T);H=(A, C, T);V=(A, C, G)。
　Note:N=(A, C, T, G);R=(A, G);Y=(C, T);B=(C, G, T);D=(A,
G, T);H=(A, C, T);V=(A, C, G).
3　结论与讨论
(1)该研究通过对各影响因子的筛选 ,确定钩距虾脊兰
ISSR的扩增条件 ,即 2.5 μl10 ×PCRbufer, 2.0 mmol/L
MgCl2 , 100 ng模板 DNA, 240μmol/LdNTPs, 1.75UTaqDNA
聚合酶 , 0.40 μmol/L引物;最佳扩增程序为:94 ℃预变性 5
min,然后进行 40个循环 , 94℃变性 30s,复性温度根据各引
物的 TM值略低 1 ～2 ℃, 30 s, 72℃延伸 50 s,循环结束后
72℃延伸 7 min, 4℃保存。
(2)Mg2+浓度是 ISSR-PCR的一个主要变化因素 ,作为
TaqDNA聚合酶的辅助因子 , Mg2+浓度不仅影响 TaqDNA
聚合酶的活性 ,还能与反应液中的 dNTPs、模板 DNA及引物
结合 ,影响引物与模板的结合效率 、模板与 PCR产物的解链
温度 、产物的特异性和引物二聚体的形成 [ 12] 。引物与模板
的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响 , Mg2+
浓度影响反应的特异性和扩增片段的产率 [ 13] 。该研究对所
采用的每 12个引物设置了 Mg2+浓度梯度比较 ,即 1.5、2.0、
2.5、3.0 mmol/L。该研究表明 , PCR反应中 , 1.5 ～ 3.0
mmol/L是较合适的 Mg2+浓度范围。考虑到太低 Mg2+浓度
会影响 TaqDNA聚合酶的活性 ,不利于 PCR扩增 ,而高浓度
会导致非特异性扩增的出现 ,使得背景模糊难以统计分析 ,
该试验最终确定了合适的 Mg2+优化浓度为 2.0mmol/L。
　　(3)在 ISSR-PCR反应体系中 , TaqDNA聚合酶直接影
响扩增反应的成功与否 。不同厂家甚至同一厂家不同批次
的产品都会得出不同的 PCR扩增结果 [ 14] ,因此选取合适厂
家的 Taq酶很重要 。在试验过程中 ,要尽量选用同一厂家同
一批次的 TaqDNA聚合酶 [ 15] 。此外 , TaqDNA聚合酶用量
对 PCR扩增也有很大影响 。浓度太低 ,聚合酶的催化能力
不够强 ,合成效率不高;浓度太高 ,会得到非特异性扩增条
带 ,同时扩增条带的背景模糊 ,不易辨认。试验表明 , Taq
DNA聚合酶浓度在 1.00 ～ 2.00 U时能得到清晰的条带 ,但
为减少非特异性扩增条带的出现 ,后续的试验采用 1.75 U
的 TaqDNA聚合酶浓度。
(4)在 PCR反应中 ,作为模板的 DNA所需浓度很低。
在每个反应体系(25.00 μl)中 , DNA所需浓度一般在 3 ～ 8
ng/μl,其适宜浓度范围较大。一般来说 ,模板过少 ,分子碰撞
的机率低 ,偶然性大 ,影响扩增产物的稳定性;模板过多又会降
低特异性扩增效率 ,增加非特异性产物。该研究将钩距虾脊兰
ISSR-PCR扩增的模板用量选定为每个反应 4ng/μl。
(5)dNTPs是 PCR反应的原料 ,常用浓度的 4种 dNTPs
各 100 ～300μmol/L。过高或过低的 dNTPs浓度都使得 PCR
产物模糊不清 ,究其原因可能是浓度太高容易产生错配 ,同
时与 TaqDNA聚合酶竞争 Mg2+ ,使 TaqDNA聚合酶不能充
分发挥聚合活性 ,导致扩增失败;浓度太低则扩增产率低 ,甚
至会因为 dNTPs的过早消耗完而使产物单链化 [ 16] 。所以筛
选比较适合的 dNTPs浓度至关重要。该研究对所采用的每
12个引物设置了 dNTPs浓度梯度比较 ,即 120、160、200、240、
280μmol/L,筛选结果表明 , 240 μmol/L的 dNTPs浓度是最
适合的 。
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