全 文 ： 2012, Vol. 33, No. 02 食品科学 ※工艺技术124
熊果酸纯化工艺优化
王建辉 1，黄 婉 2，李赤翎 1
(1.长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114；2.中国人民大学环境科学学院，北京 100872)
摘 要：为了将熊果酸的纯度自 25%提取纯化到 98%以上，以熊果酸提取率及其纯度为评价指标，综合考虑乙醇
体积分数、溶解温度、料液比及料炭比(原料质量与活性炭质量的比值)对熊果酸提取纯化的影响，并对其提取纯
化工艺进行优化。结果表明：熊果酸纯化的最佳工艺条件为乙醇体积分数 95%、提取温度 80℃、料液比 1:20(g/
mL)、料炭比 2:1，在此条件下熊果酸的提取率为 45.68%，纯度达 98.55%。
关键词：熊果酸；提取；纯化；正交试验
Optimization of Extraction and Purification Process for Ursolic Acid
WANG Jian-hui1，HUANG Wan2，LI Chi-ling1
(1. College of Chemistry and Bioengineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410114, China；
2. School of Environmental Science, Renmin University of China, Beijing 100872, China)
Abstract ：In order to improve the purity of ursolic acid, the extraction and purification process of uroslic acid was optimized
to explore the effects of ethanol concentration, extraction temperature, material/liquid ratio and material/activated carbon ratio on
extraction rate and purity. The results showed that the optimal extraction and purification process conditions were ethanol
concentration of 95%, extraction temperature of 80 ℃, material/liquid ratio of 1:20 and material/activated carbon ratio of 2:1.
Under the optimal conditions, the extraction rate and purity of uroslic acid were 45.68% and 98.55%, respectively.
Key words：ursolic acid；extraction；purification；orthogonal test
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)02-0124-03
收稿日期：2011-08-07
基金项目：第 39批留学回国人员科研启动基金项目；湖南省自然科学基金项目(11JJ6025)；
湖南省科技厅科技计划项目(2010NK3004)；湖南省教育厅科学研究项目(10C0391)
作者简介：王建辉(1980—)，男，副教授，博士后，研究方向为食品资源开发与利用。E-mail：wangjh0909@yahoo.com
熊果酸(ursolic acid)是一种弱酸性五环三萜类化合
物，在自然界分布很广，如冬凌草、车前草、枇杷
等植物中，且多以游离单体或糖苷形式存在[1]，其纯品
在乙醇中析出时为白色针状结晶，不溶于水和石油醚，
易溶于乙醇、甲醇、吡啶等。熊果酸具一系列的抗肿
瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒作用，能诱导肝癌细胞
的凋亡[2]，减少D-GalN诱导的急性肝细胞损伤[3]，抑制
G＋和 G －菌及真菌生长。此外，熊果酸还具有抗疟、降
血压、抗高血脂、促利尿和降血糖等活性作用，在抗癌
保健食品、饮料和护发素、生发剂等方面广泛使用[4- 5]。
国内外多采用大孔吸附树脂法[6-7]、超临界 CO2萃取[8]、
超声波辅助提取[9-1 0]、索式提取法[11 ]、醇提凝析法[12 ]、
气相色谱法[13]和高效液相色谱法[14-16]对熊果酸进行提取、
分离和纯化。本研究以含量 25%的熊果酸为研究对象，
进行熊果酸的分离纯化方法研究，通过对不同分离纯化
条件所得产物的提取率及产物中熊果酸的含量进行比较
分析，确定最佳纯化方案，为熊果酸的进一步研究与
开发提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
熊果酸(纯度分别为 25%和 80%) 长沙一科生物科
技有限公司；熊果酸(纯度 98%) 中国食品药品检定研
究院；无水乙醇、乙酸乙酯为国产分析纯；甲醇为色
谱醇；活性炭。
BS124S电子天平 德国赛多利斯；SHB-III循环水
多用真空泵 郑州杜甫仪器厂；R系列旋转蒸发仪 上
海豫康科技仪器设备有限公司；电子恒温不锈钢水浴锅
上海宜昌仪器纱筛厂；高效液相色谱仪 上海五丰科学
仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 工艺流程
称取纯度为 25%的熊果酸 20g，置于 500mL的烧杯
125※工艺技术 食品科学 2012, Vol. 33, No. 02
中，加入 300mL一定体积分数的乙醇溶液，在某温度水
浴锅中置放 1h，期间每隔 5min搅拌一次。然后过滤，滤
液用活性炭脱色 20min，过滤，用热乙醇淋洗，合并滤
液，将滤液浓缩至 1 /2 的体积，静置至室温，过滤，冷
乙醇淋洗，将滤渣再用 300mL相应体积分数的乙醇溶液，
在相同水浴温度中溶解，过滤，热乙醇淋洗合并滤液，浓
缩至原体积的 1/3后静置到 50℃过滤，结晶干燥后，称量。
1.2.2 熊果酸提取率计算方法

N×m
熊果酸提取率W/%＝————× 100

M
式中：N 为样品中熊果酸质量浓度 /(g/mL)；m 为
样品质量 / g；M 为原料中熊果酸的质量 / g。
1.2.3 色谱条件
Hypersil Cl8色谱柱(250mm× 4.6mm，10μm)；填
充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；流动相：0.1%磷酸溶
液 -乙腈 -甲醇(7:33:60)；检测波长 205nm；流速 1mL/
min；检测温度 30℃；理论塔板数按熊果酸峰计算应不
低于 3000[13]。
1.2.4 对照品和供试品溶液的制备
精密称取熊果酸对照品和供试样各 20mg，分别置于
50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即可。
1.2.5 熊果酸测定
取对照品溶液和供试品溶液各 5μL，注入液相色谱
仪，测定，计算，即得。熊果酸含量测定采用外标
法，即精密称取一定量的对照品和供试品，配制成溶
液，分别精取一定试样，以定量环进样，注入仪器，
记录色谱图，分析计算对照品和供试品待测成分的峰面
积(或峰高)，算熊果酸纯度：

C对照× A样品
C 样品＝———————

A对照
式中：C 表示样品纯度，A 表示峰面积。
1.2.6 溶剂选择
称取纯度为 98% 的熊果酸 1g，完全溶解于甲醇、
无水乙醇和乙酸乙酯，计算溶剂总量；并测定各溶液的
沸腾温度，冷却结晶，计算熊果酸回收率，液相色谱
法测定熊果酸含量。
2 结果与分析
2.1 熊果酸纯化溶剂的选择
通过对纯度为 80%的熊果酸在甲醇、无水乙醇、乙
酸乙酯中的溶解情况以及纯化后熊果酸纯度和回收率来
确定最佳溶剂。由表 1可知，甲醇为溶媒的熊果酸的回
收率略高于无水乙醇，但甲醇属于有毒物质，在生产
中会给工人带来身体伤害，且以无水乙醇为溶媒得到的
熊果酸在同等工艺流程下纯度高于以甲醇为溶媒所得熊
果酸，故综合考虑，选择乙醇作为溶媒。
溶剂
熊果 消耗溶 沸腾温 结晶 熊果酸 回收
酸量 /g 剂量 /mL 度 /℃ 质量/g 纯度/% 率/%
甲醇 0.9998 70 70 0.4611 95 54.75
无水乙醇 1.0013 62 80 0.4191 98 51.27
乙酸乙酯 1.0192 350 78 0.3539 86 37.33
表 1 熊果酸纯化最佳溶剂的筛选
Table 1 Screening of optimal solvent for ursolic acid purification
2.2 熊果酸提取纯化工艺优化
影响熊果酸纯化的因素很多，如乙醇体积分数、
溶解温度、料液比、活性炭加入量、提取时间、浓
缩后的体积、析出结晶时的温度控制等等。根据以往
单因素试验结果和相关资料[4-12]，本研究以乙醇体积分
数、溶解温度、料液比及料炭比(原料质量与活性炭质
量的比值)为研究因素，采用 4因素 3水平的正交试验设
计，以熊果酸提取率及其纯度为考察指标，具体因素
水平设计表及试验分析结果见表 2、3。
水平
A 乙醇体
B 温度 /℃
C 料液 D 料炭
积分数 /% 比(g/mL) 比(m/m)
1 70 60 1:10 5:1
2 85 70 1:15 2:1
3 95 80 1:20 10:1
表 2 熊果酸提取纯化工艺优化 L9(34)正交试验因素水平表
Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for optimizing the
extraction process of ursolic acid
试验号 A B C D
熊果酸提 熊果酸
取率/% 纯度/%
1 1 1 1 1 20.16 56.02
2 1 2 2 2 33.12 72.00
3 1 3 3 3 40.02 95.00
4 2 1 2 3 25.46 67.00
5 2 2 3 1 33.24 80.31
6 2 3 1 2 30.01 70.60
7 3 1 3 2 28.81 90.00
8 3 2 1 3 23.31 63.01
9 3 3 2 1 44.12 98.50
熊 k1 25.12 21.31 18.96 28.31
果 k2 31.14 27.88 43.31 36.57
酸 k3 41.56 40.05 43.28 25.12
提 R 16.44 18.74 24.35 11.45
取 因素主次 C＞ B＞ A＞D
率 优方案 A3B3C2D2
熊
k1 74.34 71.01 63.21 78.28
果
k2 72.64 71.77 79.17 77.53
酸
k3 83.84 88.03 88.44 75.00
纯
R 11.20 17.03 25.23 3.27
度
因素主次 C＞ B＞ A＞D
优方案 A3B3C3D1
表 3 熊果酸提取纯化工艺优化 L9(34)正交试验设计及结果
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests
2012, Vol. 33, No. 02 食品科学 ※工艺技术126
由表 3可知，按照极差 R大小可以判定上述 4个因
素影响熊果酸提取率和纯度的主次顺序均为C＞B＞A＞
D(即料液比＞提取温度＞乙醇体积分数＞料碳比)。正
交试验设计中，熊果酸提取率及其纯度的最佳组合均为
A3B3C 2D1，此时，熊果酸的提取率为 44.12%，纯度为
98.50%，液相色谱图见图 1、2。根据正交试验结果分
析发现，自熊果酸提取率的角度分析，各因素水平的
最佳组合为 A3B3C2D2，而从熊果酸纯度的角度分析，各
因素水平的最佳组合为 A3B3C3D1；两评定指标的因素水
平差异集中在C和D两因素，因C2和C3水平对熊果酸
提取率影响相当，故取对纯度影响较大的因素 C 3；而
D1和 D 2对熊果酸纯度影响相当，故选对熊果酸提取率
影响较大的因素D2，故综合两评定指标选择最优方案为
A 3B 3C 3D 2。
因正交试验设计中无该组合，故需做进一步验证实
验。称取纯度为 25%的熊果酸粉末 0.25g，按照A3B3C3D2
中各因素水平进行试验，此时，熊果酸的提取率为
45.68%，熊果酸纯度为 98.55%。结果表明，熊果酸提
取纯化的最优工艺为乙醇体积分数 95%、提取温度 80℃、
料液比 1:20、料炭比 2:1。
醇、乙酸乙酯中的溶解情况及纯化后熊果酸的含量和回
收率，得到最佳溶剂为无水乙醇。综合各提取分离因
素与水平，熊果酸分离纯化的最佳工艺为乙醇体积分
数 95%、提取温度 80℃、料液比 1:20 (g/mL)、料碳
比 2:1。在以上条件下可将纯度为 25%的熊果酸纯化至
98.55%。然而，试验过程中发现熊果酸的溶解度与乙
醇体积分数和温度密切相关，同时，因活性炭对产品
的吸附作用，加之，纯化时过滤除杂等过程中，环境
温度的骤然下降会造成少量产品损失，影响产品的回收
率，是故其工艺过程尚有待进一步完善以确保产品的回
收率。
参 考 文 献 ：
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图 1 标准样品的高效液相色谱图
Fig.1 HPLC chromatogram of standard sample
6.00
1.80
－2.40
－6.60
－10.80
－15.00
9.66
m
A
U
时间 /min
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
图 2 第 9 号试验的高效液相色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of sample No.9
6.00
1.60
－2.80
－7.20
－11.60
－16.00
10.38
m
A
U
时间 /min
0.0 1.9 3.8 5.7 7.6 9.5 11.4 13.3 15.2 17.1 19.0
3 结 论
本研究通过对 80%含量的熊果酸在甲醇、无水乙