全 文 ：高效液相色谱法测定紫珠果中齐墩果酸和熊果酸＊＊
高秀丽 1 , 王鹏娇1 , 彭安堂 1 , 刘祉莉 2 , 刘安发 1
(1.贵阳医学院 药学院 , 贵州 贵阳　550004;2.贵州省肿瘤医院 , 贵州贵阳　550003)
[摘　要 ] 目的:建立紫珠果药材中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法。方法:采用 RP-HPLC法 , Phenomenex
KromasilODS-Cl8(4.6 mm×250 mm, 5μm)色谱柱;流动相为甲醇-水(90∶10);流速 1.0 ml/min;柱温 25 ℃ ;检
测波长为 215 nm。结果:齐墩果酸在 0.011 5 ～ 0.103 5 g/L呈良好的线性关系;熊果酸在 0.030 32 ～ 0.272 88
g/L呈良好的线性关系;齐墩果酸平均回收率为 99.70%, RSD为 0.32%(n=9), 熊果酸平均回收率为
100.06%, RSD为 0.87%(n=9)。结论:该方法操作简便快速 , 结果可靠 ,重复性好 , 可为有效控制紫珠果药材
及其制剂的质量提供依据。
[关键词 ] 色谱法 ,高压液相;齐墩果酸;熊果酸;紫珠果
[中图分类号 ] R284.1　　 [文献标识码 ] A　　 [文章编号 ] 1000-2707(2010)04-0352-03
DeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidinZizhuFruit
byHighPerformanceLiquidChromatography
GAOXiuli1 , WANGPengjiao1 , PENGAntang1 , LIUZhili2 , LIUAnfa1
(1.SchoolofPharmacology, GuiyangMedicalColege, Guiyang550004 , Guizhou, China;
2.GuizhouCancerHospital, Guiyang550004 , Guizhou, China)
[ Abstract] Objective:Toestablishahighperformanceliquidchromatography(HPLC)methodfor
determinationofoleanolicacidandursolicacidinZizhufruit.Methods:TheHPLCmethodwascar-
riedonC18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)columnusingmethanol-water(90∶10 , V:V)asthemobile
phase, anddetectionwavelengthwas215 nm.Theflowratewas1.0 ml/minandthetemperatureof
column25℃.Results:Thecalibrationcurveforoleanolicacidwaslinearintherangeof0.011 5 ～
0.103 5g/L, andthecalibrationcurveforursolicacidwaslinearintherangeof0.030 32 ～ 0.272 88
g/L, Theaveragerecoveryofoleanolicacidwas99.70%, andRSDwas0.32%(n=9), whileaver-
agerecoveryofursolicacidwas100.06%, RSD0.87%(n=9).Conclusions:Themethodiscon-
venient, precise, reliableandwithgoodreproducibilityfordeterminingthecontentsofoleanolicacid
andursolicacidinZizhu, whichmayprovidebasisforefectivequalitycontrolofZizhufruitproducts.
[ Keywords] chromatography, highpressureliquid;oleanolicacid;ursolicacid;Zizhufruit
　　紫珠果为马鞭草科植物华紫珠 Calicarpa
cathayanaH.T.Chang、大叶紫珠 Calicarpamacro-
phylaVahl或老鸦糊 CalicarpagiraldiHeseexRe-
hd.或其他同属近缘植物的干燥成熟果实。其性
味淡 、涩 、凉 ,具有清热利湿 、解毒的作用 ,用于湿热
黄疸 、胁痛不适。紫珠果药材收载于 《贵州省中药
材 、民族药材质量标准(2003年版)》,标准中未见
含量测定项 。于 2000年和 2001年先后对紫珠果
进行了化学成分研究 ,结果表明紫珠果含脂肪酸和
熊果酸 。现采用 RP-HPLC法同时测定紫珠果药材
中齐墩果酸和熊果酸的含量 ,该方法操作简便快
速 、结果可靠 、重复性好 ,可为有效控制紫珠果药材
的质量提供依据 。
352
第 35卷　第 4期
2010年 8月 　　　 贵 阳 医 学 院 学 报JOURNALOFGUIYANGMEDICALCOLLEGE　　　Vol.35　No.42010.8
＊ ＊ [基金项目 ]贵阳市科技局基金项目(合同号:[ 2007]筑科计合同字第 6-15号)
1　实验部分
1.1　仪器与试药
Angilent1100高效液相色谱仪 , AB104N-Met-
ler电子天平 , PhenomenexKromasilODS-C18色谱柱
(250mm×4.6 mm, 5 μm);齐墩果酸对照品(批号
110709-200304 ,供含量测定用)和熊果酸对照品
(批号 110742-200313,供含量测定用),由中国药
品生物制品检定所提供 。紫珠果药材采自贵州息
烽 ,鉴定为大叶紫珠的干燥成熟果实;甲醇为色谱
纯 ,其它试剂为分析纯 。
1.2　方法与结果
1.2.1 　溶液的制备
1.2.1.1　对照品溶液储备液的制备:精密称取齐
墩果酸对照品 11.50 mg、熊果酸对照品 15.16 mg,
分别置于 25 ml容量瓶中 ,加甲醇使溶解并稀释至
刻度 ,即得。
1.2.1.2　对照品溶液的制备:精密吸取齐墩果酸
对照品溶液储备液 1ml、熊果酸对照品溶液储备液
2ml置 10ml容量瓶中 ,用甲醇稀释至刻度 , 摇匀 ,
即得 。
1.2.1.3　供试品溶液的制备:精密称取紫珠果粉
末 0.2 g, 置于 100 ml具塞锥形瓶中 , 精密加入
95%乙醇溶液 25 ml,称定重量 ,超声提取 20 min,
放冷 ,用 95%乙醇溶液补足损失重量 ,充分振摇 ,
滤过 ,取续滤液 0.45μm微孔滤膜过滤 ,即得 。
1.2.2　色谱条件的确定与系统适用性试验
参照文献 [ 1 ～ 6] ,对色谱条件进行了实验选
择 ,最后确定最佳色谱条件为:色谱柱为 Phenome-
nexKromasilODS-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);
流动相为甲醇-水(90∶10);检测波长为 215 nm,流
速为 1.0 ml/min,柱温为 25 ℃,进样量 10 μl。在
此条件下 ,分别精密吸取齐墩果酸与熊果酸对照品
溶液 、供试品溶液分别进样 ,色谱结果见图 1,齐墩
果酸与熊果酸分离度达到 1.62,能有效分离 ,理论
塔板数以齐墩果酸和熊果酸计 ,分别为 10 911和
10 852。
A　对照品　　　　　　　　　　　　　　　　B　样品
a:齐墩果酸(Oleanolicacid);b:熊果酸(Ursolicacid)
图 1　齐墩果酸与熊果酸对照品 、紫珠果的 HPLC色谱结果
Fig.1　ThechromatogramofoleanolicacidandursolicacidinZizhufruitandreferencesubstances
　　由图 1A可见 , 齐墩果酸与熊果酸的保留时间
分别为 14.538 min和 15.466 min,样品与对照品
在同一保留时间里有一相应的色谱峰 。
1.2.3　线性关系考察
精密吸取齐墩果酸与熊果酸对照品储备溶液
2.5ml与 5ml置于 10ml容量瓶中 ,用甲醇稀释至
刻度 ,摇匀;精密吸取该液 1、3、5、7、9ml置于10ml
容量瓶中 , 用甲醇稀释至刻度 , 摇匀分别进样
10 μl,以样品量为横坐标 ,峰面积为纵坐标进行线
性回归 , 齐墩果酸线性方程为 Y=2 895.4X-
7.995(r=0.999 6), 齐墩果酸在 0.011 5 ～
0.103 5g/L呈良好的线性关系;熊果酸线性方程
为 Y=2 461.2X-4.725(r=0.999 9),熊果酸在
0.030 32 ～ 0.272 88 g/L呈良好的线性关系。
1.2.4　精密度试验　分别吸取对照品溶液 10 μl,
重复进样 6次 , 记录峰面积 ,齐墩果酸峰面积的
RSD=1.34%(n=6),熊果酸峰面积的 RSD=
1.08%(n=6)。
1.2.5　稳定性试验　按 1.2.2项下测定条件 ,对
同一供试品溶液在 0 , 1, 2, 4, 8, 12 h分别进样
10μl,测定样品中齐墩果酸和熊果酸 ,齐墩果酸和
熊果酸的 RSD分别为 1.28%(n=6)和 0.64%(n
=6),表明供试品溶液在 12 h内稳定。
1.2.6　重复性试验　取紫珠果药材粉末 ,分别称
取样品 6份 ,按 1.2.1.3项下供试品溶液制备方法
制备 ,并按 1.2.2项下方法进行测定。样品中齐墩
353
　4期 高秀丽等　高效液相色谱法测定紫珠果中齐墩果酸和熊果酸
果酸平均含量为 5.90 mg/g, RSD为 1.85%(n=
6);熊果酸平均含量为 19.27 mg/g, RSD为 1.56%
(n=6)。
1.2.7　回收率试验　精密称取紫珠果药材粉末
0.1g,平行操作 9份 ,每 3份分别精密加入齐墩果
酸对照品储备液溶液各 1 ml、1.5 ml和 2 ml,与熊
果酸对照品储备液溶液各 2ml、3ml和 4ml,挥干 ,
按供试品溶液制备项下方法制备 ,并在上述色谱条
件下进行色谱分析和测定 ,计算加样回收率 ,结果
齐墩果酸平均回收率为 99.70%, RSD为 0.32%
(n=9),熊果酸平均回收率为 100.06%, RSD为
0.87%(n=9)。见表 1。
表 1　齐墩果酸和熊果酸加样回收实验结果
Tab.1　Recoveryratesofoleanolicacidandursolicacid
组分 样品中的量(mg) 加入量(mg) 测得量(mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%)
0.702 1 0.460 0 1.158 6 99.24
0.613 0 0.460 0 1.061 3 97.46
0.594 7 0.460 0 1.046 9 98.30
0.616 6 0.690 0 1.316 8 101.48
齐墩果酸 0.613 6 0.690 0 1.297 9 99.17 99.70 0.32
0.669 7 0.690 0 1.360 1 100.06
0.604 8 0.920 0 1.540 1 101.66
0.613 0 0.920 0 1.524 2 99.04
0.653 7 0.920 0 1.581 7 100.87
2.293 1 1.212 8 3.508 3 100.20
2.002 2 1.212 8 3.214 8 99.98
1.942 4 1.212 8 3.152 3 99.76
2.013 7 1.819 2 3.856 9 101.32
熊果酸 2.004 1 1.819 2 3.794 7 98.43 100.06 0.87
2.187 1 1.819 2 3.999 9 99.65
1.975 2 2.425 6 4.431 1 101.25
2.002 2 2.425 6 4.423 4 99.82
2.135 1 2.425 6 4.564 1 100.14
1.2.8　样品测定　取紫珠果药材粉末 3批 ,分别精
密称取 ,按 1.2.1.3项下供试品溶液制备方法制备 ,
并按 1.2.2项下方法进行测定。样品中齐墩果酸平
均含量为 6.15mg/g, RSD为 1.85%(n=3);熊果酸
平均含量为 19.20 mg/g, RSD为 1.24%(n=3)。
2　讨论
2.1　对色谱条件进行实验选择时 ,对流动相种类
和配比进行了选择:分别选取了乙腈-甲醇-水-醋
酸铵(68∶10∶22∶0.5), 甲醇 -水 -磷酸 (90∶10∶
0.1),乙腈-0.1%磷酸(75∶25)和甲醇-水(90∶10)
作为流动相 ,最终优选为甲醇-水(90∶10)。
2.2　实验表明 ,调整流动相种类和配比对熊果酸
和齐墩果酸的分离度无明显影响 ,而不同型号色谱
柱对熊果酸和齐墩果酸的分离影响较大 ,本试验采
用甲醇-水(90∶10)为流动相 ,对 PhenomenexKro-
masilODS-C18(4.6mm×250mm, 5 μm)、Diamonsil
ODS-C18(4.6 mm×250mm, 5 μm)和 AgilentODS-
C18(4.6mm×150 mm, 5 μm)3种色谱柱进行了考
察比较 , Kromasil柱的分离效果最佳 ,熊果酸和齐墩
果酸的分离度为 1.62,符合色谱定量分析的要求。
2.3　在紫珠果样品的处理研究上 ,对提取溶剂进
行了实验选择 。分别以甲醇 、95%乙醇 、乙醚和氯
仿作为样品提取溶剂 ,结果显示:甲醇与 95%乙醇
提取率相当 ,但以 95%乙醇作为提取溶剂时 ,色谱
峰杂质少 ,分离较好 ,故选用 95%乙醇为供试品溶
液制备提取溶剂 。
2.4　在紫珠果样品提取方法上 ,本文分别考察了
热回流提取 、索氏提取和超声提取 3种提取方法 ,
结果显示:索氏提取效果较差 ,热回流提取和超声
提取 2种方法无显著性差异 ,故选用操作简单方便
的超声提取法 ,并对其超声时间进行了考察 ,超声
提取 20 min便能将紫珠样品中齐墩果酸和熊果酸
提取完全。
(下转第 357页)
354
贵 阳 医 学 院 学 报　 35卷　
3　讨论
氟是人体所必需的元素 ,与人类健康密切相
关 ,但过量的氟可对机体产生多方面的毒性作用 ,
最大的危害是对骨骼和牙的影响。随着氟研究的
不断深入 ,氟化物的致突变性和致癌性日益受到重
视 。国内外许多机构分别从氟化物对癌的诱发作
用 、流行病学调查和相关性研究以及促进致癌作用
等方面进行了长期的研究 ,表明在一定的条件下 ,
氟化物对肝癌 、纤维肉瘤 、肿瘤性转化等具有诱发
作用 ,与口腔癌 、咽癌 、结肠癌 、直肠癌 、肝胆管癌 、
排泄器官癌 、男性骨癌 、泌尿系癌 、淋巴造血系癌 、
肺癌 、膀胱癌等的发生密切相关[ 7, 8] ,但是在机理方
面和剂量-效应关系的研究资料还很少。CYP1A1
是一个具有芳香烃羟基化活性酶(AHH),催化多环
芳烃(PAH)等多种致癌剂氧化。大量研究表明 ,
吸烟和环境中的多环芳烃是肺癌发生的主要危险
因素。 PAH进入人体后首先经过 CYP1A1代谢活
化 ,生成具有强致癌活性的亲电子环氧化物 ,攻击
DNA,形成 PAH-DNA加合物 ,改变 DNA的正常结
构 ,进而引发癌变 , CYP1A1酶的诱导活性成为决
定 PAH致癌的关键 [ 9, 10] 。本实验结果显示氟化钠
可诱导 CYP1A1酶活性 ,诱导程度与染毒时间有显
著相关性 ,提示长期摄入氟化物可能会导致某些前
致癌物的活化 ,增加罹患肿瘤的风险性。
4　参考文献
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(2010-01-29收稿 , 2010-04-11修回)
(上接第 354页)
2.5　采用 RP-HPLC法测定紫珠果中的含量 ,该方
法简便 、准确 、重现性好 ,不同批号的紫珠果样品测
定结果表明 , 齐墩果酸和熊果酸的含量稳定。该
法可用于紫珠果中齐墩果酸和熊果酸的含量测定。
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357
　4期 雷霆雯等　氟化钠对小鼠肝脏细胞色素 P4501A1酶活性的影响