全 文 ：［收稿日期］ 20131006(006)
［基金项目］ 黑龙江省教育厅课题(12521529)
［通讯作者］ * 王丽红，硕士，教授，从事植物药的研究与开发，Tel:13846175975，E-mail:wlh_6663@ 163. com
Box-Behnken响应面分析法优化乌苏里瓦韦中绿原酸提取工艺
王丽红1* ，谭凤田1，赵宏1，姜博2
( 1. 佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007; 2. 佳木斯中心医院，黑龙江 佳木斯 154002)
［摘要］ 目的:优选乌苏里瓦韦中绿原酸的提取工艺。方法:在单因素试验基础上，选取料液比、乙醇体积分数、提取时
间为自变量，绿原酸提取量为响应值，根据 Box-Benhnken试验设计原理，利用响应面分析法优化乌苏里瓦韦中绿原酸的醇提
工艺。结果:最佳提取工艺为加 68 倍量 75%乙醇提取 2 次，每次 41 min;绿原酸提取量达 8. 26 mg·g －1，与理论预测值 8. 47
mg·g －1偏差较小。结论:醇提法与传统工艺比较，具有提取率高、能耗少、时间短和低成本等特点。优选的工艺稳定可行，为
乌苏里瓦韦的工业化生产提供参考。
［关键词］ 乌苏里瓦韦;绿原酸;Box-Behnken响应面分析法
［中图分类号］ Ｒ283. 6 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2014)17-0024-03
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014170024
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20140715． 1326． 006． html
［网络出版时间］ 2014-07-15 13:26
Optimization of Extraction Process for Chlorogenic Acid from
Lepisorus ussuriensis by Box-Behnken Ｒesponse Surface Methodology
WANG Li-hong1* ，TAN Feng-tian1，ZHAO Hong1，JIANG Bo2
(1. College of Pharmacy，Jiamusi University，Jiamusi 154007，China;
2. The Central Hospital of Jiamusi City，Jiamusi 154002，China)
［Abstract］ Objective:To optimize extraction process of chlorogenic acid from Lepisorus ussuriensis．
Method:On the basis of single factor tests，taking material-liquid ratio，ethanol concentration and extracting time
as independent variables，yield of chlorogenic acid in response to a value，according to Box-Benhnken experiment
design principle，extraction process of chlorogenic acid from L． ussuriensis was optimized by response surface
analysis． Ｒesult:Optimum extraction process was as following:extracted twice with 68 times the amount of 75%
ethanol for 41 min per time;extracting amount of chlorogenic acid was 8. 26 mg·g －1，which was close to the
theoretical prediction of 8. 47 mg·g －1 ． Conclusion:Compared with traditional processes，alcohol extraction
process had characteristics，such as high extraction efficiency，less energy consumption，low cost，et al． This
optimized process was stable and feasible for providing a reference for industrial production of L． ussuriensis．
［Key words］ Lepisorus ussuriensis;chlorogenic acid;Box-Benhnken Ｒesponse surface methodology
乌苏里瓦韦别名石茶、树茶、还阳草、大石韦等，
具有清热解毒、利尿、止咳、止血、消肿等功效［1］，主
要成分为绿原酸。该成分是一种缩酚酸，属酚类化
合物，是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸途径形成
的一种苯丙素类化合物。目前关于乌苏里瓦韦的研
究报道主要针对全草鉴定［2］及其化学成分分
离［3-4］，尚未见其提取工艺的报道。故本实验采用
Box-Behnken响应面分析法优选乌苏里瓦韦中绿原
酸的提取工艺，为该药材的工业化生产和资源开发
提供参考。
·42·
第 20 卷第 17 期
2014 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 17
Sep．，2014
1 材料
BP211D 型电子天平(德国赛多利斯公司)，
FA2004 型分析天平仪(上海恒平科学技术有限公
司)，Specturm lab54 型紫外-可见分光光度仪(上海
凌光技术有限公司)。乌苏里瓦韦药材采自佳木斯
市汤原县，经佳木斯大学药学院生药教研室王丽红
教授鉴定为水龙骨科植物乌苏里瓦韦 Lepisorus
ussuriensis (Ｒegel et Maack)Ching全草;绿原酸对照
品(天津一方科技有限公司，批号 20121019)，试剂
为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 材料预处理 将乌苏里瓦韦全草置于通风避
光处阴干至恒重，用中药粉碎机粉碎成细粉，过 60
目筛，备用。
2. 2 标准曲线的绘制 精密称取绿原酸对照品
5. 22 mg，用 75%乙醇定容至 10 mL 量瓶中，得对照
品储备液。精密吸取该储备液 0. 1，0. 2，0. 3，0. 4，
0. 5 mL，分别置于 10 mL 量瓶中，加 75%乙醇定容
至刻度，配成系列对照品溶液，以 75%乙醇作为空
白对照，于 327 nm 处测定吸光度(A)，以 A 为纵坐
标，质量浓度(C)为横坐标，得回归方程 A =
24. 727C － 0. 906 8(Ｒ2 = 0. 996 6)，线性范围 5. 22 ～
26. 1 mg·L －1。
2. 3 单因素试验考察［5-7］ 称取乌苏里瓦韦粉末
0. 2 g，采用超声提取法，通过单因素试验考察料液
比(1∶ 30 ～ 1∶ 75)、乙醇体积分数(30% ～ 90%)、超
声时间(20 ～ 50 min)、提取次数(1 ～ 4 次)对绿原酸
提取量的影响。
2. 3. 1 料液比 设定乙醇体积分数 75%，提取温
度 30 ℃，考察料液比 1∶ 30，1∶ 45，1∶ 60，1∶ 75 对绿原
酸提取量的影响，结果表明当料液比为 1∶ 45 时，绿
原酸提取量基本达最大值，之后增加溶剂用量绿原
酸提取量基本稳定。
2. 3. 2 超声时间 设定料液比 1 ∶ 60，乙醇体积分
数 75%，考察提取时间 20，30，40，50 min 对绿原酸
提取量的影响，结果表明绿原酸提取量随时间增加
而增加，至 30 min 时达最高值，随后提取量急剧
降低。
2. 3. 3 乙醇体积分数 设定料液比 1 ∶ 60，提取温
度 30 ℃，提取时间 30 min，考察不同乙醇体积分数
(30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%)对绿原
酸提取量的影响，结果表明当乙醇体积分数为 40%
和 80% 时，绿原酸提取量最高，乙醇体积分数
50% ～70%时，提取量下降。
2. 3. 4 提取次数 设定乙醇体积分数 40%，提取
温度 30 ℃，提取时间 30 min，考察提取数(1，2，3，4
次)对绿原酸提取量的影响，结果表明绿原酸提取
量随提取数增加而增加，当提取数 ＞ 2 次时，提取量
下降。
2. 4 响应面法试验 在单因素试验基础上［8-9］，选
择液料比、乙醇体积分数、提取时间为考察因素，根
据 Box-Benhnken试验设计原理，以绿原酸提取量为
响应值，运用 Design-Expert 7. 1. 3 设计试验方案，因
素水平见表 1，试验安排及结果见表 2。
表 1 乌苏里瓦韦中绿原酸提取工艺 Box-Benhnken试验因素水平
编码水平 X1 料-液比
X2 乙醇体积
分数 /%
X3提取时间
/min
－ 1 1∶ 45 40 30
0 1∶ 60 60 40
1 1∶ 75 80 50
表 2 乌苏里瓦韦中绿原酸提取工艺 Box-Benhnken试验安排
No． X1 X2 X3
绿原酸提取量
(Y)/mg·g － 1
1 1 0 － 1 5. 22
2 1 － 1 0 6. 71
3 1 1 0 5. 75
4 0 － 1 1 7. 69
5 0 － 1 － 1 6. 84
6 － 1 0 － 1 4. 91
7 0 0 0 6. 61
8 0 0 0 6. 49
9 1 0 1 5. 46
10 0 1 － 1 5. 01
11 0 0 0 8. 26
12 0 0 0 8. 34
13 － 1 0 1 3. 92
14 － 1 － 1 0 7. 69
15 0 1 1 7. 23
16 0 0 0 7. 43
17 － 1 1 0 5. 81
采用 Design-Expert 7. 1. 3 软件对各因素进行回
归拟合，得回归方归 Y = 7. 43 + 0. 1X1 － 0. 64X2 +
0. 23X1X2 + 0. 31X1X3 + 0. 34X2X3 － 1. 38X
2
1 +
0. 44X22 － 1. 17X
2
3，该模型的方差分析见表 3。结果
表明建立的二次多项模型具有显著性 (r =
0. 876 8)，模型拟合度较好，试验误差小，可用此模
·52·
王丽红，等:Box-Behnken响应面分析法优化乌苏里瓦韦中绿原酸提取工艺
表 3 绿原酸提取量回归统计方差分析
方差来源 SS f MS F P
模型 19. 99 9 2. 22 2. 60 0. 010 5
X1 0. 08 1 0. 08 0. 10 0. 765 7
X2 13. 29 1 3. 29 3. 85 0. 090 5
X3 0. 67 1 0. 67 0. 79 0. 404 3
X1X2 0. 21 1 0. 21 0. 25 0. 633 9
X1X3 0. 38 1 0. 38 0. 44 0. 527 1
X2X3 0. 47 1 1. 00 0. 55 0. 482 7
X21 7. 97 1 7. 97 9. 33 0. 018 5
X22 0. 81 1 0. 81 0. 95 0. 361 7
X23 5. 79 1 5. 79 6. 78 0. 035 2
残差 5. 98 7 0. 85
失拟项 2. 91 3 0. 97 1. 26 0. 399 9
纯误差 3. 07 4 0. 77
总离差 25. 97 16
型对乌苏里瓦韦的提取工艺进行预测分析，因素
X1，X3 影响不显著，X
2
1 和 X
2
3 影响极显著，X
2
2 不显
著，交互项 X1X2，X1X3，X2X3 不显著。
根据拟合模型绘制乌苏里瓦韦绿原酸的响应面
的三维图与等高线，可得到各参数范围内的极值及
因素间相互作用对响应值的影响，采用 Design-
Expert 7. 1. 3 软件处理，见图 1。结果显示该回归方
程存在极大值，最大的响应值 8. 47 mg·g －1，此时最
优工艺条件为提取时间 41. 990 min，乙醇体积分数
75. 050%，液料比 68. 730∶ 1。
2. 5 验证试验 结合生产实际考虑，将最佳提取工
艺调整为提取时间 41 min，乙醇体积分数 75%，液
料比 68 ∶ 1。精密称取乌苏里瓦韦粉末 3 份，每份
0. 2 g，按该提取条件进行验证试验，结果绿原酸平
均提取量 8. 26 mg·g －1，与理论预测值基本吻合，说
明采用响应面法优选的提取工艺参数基本准确
可靠。
图 1 液料比、乙醇体积分数、提取时间交互作用对绿原酸提取量影响的响应面和等高线
3 讨论
响应面分析法在提取条件寻优过程中，可连续
对影响因素的各个水平进行分析，并在影响因素与
响应值间确立数学模型，通过对数据拟合得到较好
的试验参数。本文在单因素试验基础上，通过对乙
醇体积分数、料液比、提取时间各水平的多元回归及
二项拟合建立绿原酸提取量与各因素的回归方程，
确定最佳提取工艺，为乌苏里瓦韦的资源深加工提
供参考。
［参考文献］
［1］ 国家中医药管理局《中华本草》编委会．中华本草．第 2
册［M］．上海:上海科学技术出版社，1999:238.
［2］ 王丽红，赵龙，刘德江，等． 乌苏里瓦韦的性状及显微
鉴定［J］．中药材，2013，36(3):394.
［3］ Choi Y H，Lim Y H，Yeo H，et al． A flavonoed diglycoside
from Lepisorus ussuriensis［J］． Phytochemistry，1996，43
(5) :1111.
［4］ Choi Y H，Kim J，Choi Y-H． A steroidal glycoside from
Lepisorus ussuriensis ［J］． Phytochemistry，1999，51
(3) :453.
［5］ 李玉山，范鹏辉． 杜仲叶中绿原酸提取工艺的优化
［J］．湖北农业科学，2012，51(17):3830.
［6］ 胡鲜宝，范贵生，吕加平．绿原酸提取纯化及检测方法
的研究进展［J］．农产品加工·学刊，2009，11(11):85.
［7］ 周舟，彭淼，钟晓红．绿原酸提取分离及检测研究进展
［J］．长江大学学报:自然科学版，2011，8(2):243.
［8］ 王芳芳，余陈欢，聂犇，等． 利用响应面分析法优化杭
白中绿原酸提取工艺研究［J］． 食品科技，2007，33
(9):96.
［9］ 黄家卫，盛振华，余陈欢，等． 利用响应面分析法优化
金银花中的绿原酸的超声提取工艺［J］． 中国现代应
用药学，2010，27(11):995.
［责任编辑 刘德文］
·62·
第 20 卷第 17 期
2014 年 9 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 17
Sep．，2014