全 文 ：文章编号:　1001-4675(2008)01-0098-09
荒漠刺叶墙藓 DNA的提取及 PCR扩增反应条件＊
王红玲 1, 2 , 　张元明 1 , 　吴　楠 1, 2 , 　陈荣毅 1, 2 , 　聂华丽 1, 2 , 　张　静 1, 2
(1中国科学院 新疆生态与地理研究所 , 新疆 乌鲁木齐　830011;2中国科学院 研究生院 , 北京　100049)
摘　要:采用改进 CTAB法 、NaOH法和直接 PCR法(directPCRamplification)提取藓类生物结皮中刺叶墙藓
(TortuladesertorumBroth.)基因组 DNA, 比较其分离效果以及 ISSR扩增效果。结果表明:改进 CTAB法提取的基
因组 DNA质量好 、纯度高 , ISSR扩增反应效果好。直接 PCR法一旦体系建立 ,则是最简易快速 、经济高效的模板
制备方法 , 适于植株矮小 、生物量很小的荒漠藓类植物个体模板 DNA的制备。利用改进 CTAB法获得的基因组
DNA作为模板 , 对 ISSR反应组分浓度及反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化实验 , 建立了刺叶墙藓最优
ISSR反应体系。反应总体积为 20μL, 各反应组分终浓度为:2 μL10×Bufer, 2 mMMg2+, 0.1 mMdNTPs, 0.2 μM
引物 , 10 ～ 40ng模板 DNA, 1UTaq酶 。扩增程序为:94℃ 4 min, 1个循环;94℃ 45 s, 退火温度(Tm)45 s, 72℃
1 min, 35个循环;72 ℃ 7 min, 1个循环;4 ℃保存。刺叶墙藓是组成古尔班通古特沙漠藓类生物结皮的优势种 ,研
究结果为进一步开展刺叶墙藓遗传多样性的研究奠定了基础。
关键词:刺叶墙藓;DNA提取;ISSR扩增;藓类生物结皮;古尔班通古特沙漠
中图分类号:Q946　　文献标识码:A
　　荒漠地表生物结皮是由土壤微生物 、藻类 、地衣
和苔藓等孢子植物类群与土壤形成的有机复合体 ,
它的形成使土壤表面在物理 、化学和生物学特性上
均明显不同于松散沙土 ,具有较强的抗风蚀 、水蚀功
能 ,也是干旱荒漠区植被演替的重要基础 〔1〕。荒漠
生物结皮中的苔藓植物作为整体 ,在群落演替的过
程中起着非常重要的作用 。这些小型绿色植物是许
多初生演替阶段的先锋植物 ,它们通常群集在开阔 、
多贫瘠 、且多是维管植物无法生存的地方 〔2〕。古尔
班通古特沙漠是我国最大的固定半固定沙漠 ,参与
该沙漠地表生物结皮的藓类植物共计 3科 3属 5
种 ,耐旱性极强 ,其中刺叶墙藓是构成藓类结皮的优
势种 〔3〕。刺叶墙藓 (TortuladesertorumBroth.)隶属
于丛藓科(Potiaceae)墙藓属 (TortulaHedw.),夏
季无降水时植物体黑色 ,处休眠状态 ,在丘间低地形
成纯群斑块 〔4〕 ,其产生的大量假根能有效固沙 ,保
护土壤 ,减少风蚀和水蚀 ,起到改善沙地小环境和固
定沙丘的作用〔5〕。荒漠干旱条件下 ,生物结皮中藓
类植物的繁殖生长受水分条件的限制 〔6〕 ,对其繁衍
以及种群的扩散将产生一定的影响。为了深入探讨
藓类植物参与土壤结皮的形成过程及机理 ,有必要
开展刺叶墙藓遗传多样性及其在斑块内(间)、居群
内(间)遗传分化的研究 ,研究结果将为荒漠藓类生
物结皮的形成以及扩散模式提供理论依据。
DNA分子标记技术广泛应用于群体遗传多样
性和保护生物学的研究 , 如限制性片段长度多态
(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、微卫星 (Micro-
satelite)和扩增限制性片段长度多态分析(AFLP)
等〔7 ～ 11〕。 ISSR(inter-simplesequencerepeat)又称简
单重复序列间扩增 ,是近年来发展起来的一类新型
的分子标记技术。它可以揭示出比 RFLP, RAPD,
SSR更多的多态性 ,现已在种质资源鉴定 、遗传作
图 、基因定位 、遗传多样性 、进化 、系统发育 、分子标
记育种等研究方面被广泛应用〔12 ～ 18〕。在实验过程
中 , DNA质量是影响实验的关键因素之一 。
荒漠耐旱藓类植物通常具有株体矮小的特点。
刺叶墙藓高 0.5 ～ 1.2 cm,单株个体平均质量仅为
0.5 mg,且体内含有较多的次生代谢物质 ,要想获得
纯度高且能满足 PCR扩增需要的基因组 DNA有一
定困难。国内外关于苔藓植物 DNA提取的研究主
要集中在极地或水分条件较好的林地 〔19 ～ 25〕 ,而以荒
漠藓类植物为研究对象进行 DNA提取的研究为数
不多 〔26, 27〕。张道远等对刺叶墙藓 DNA提取方法以
及 RAPD/ISSR扩增体系的建立进行了初步研究〔27〕。
其中 , DNA提取研究方法采用快速提取法 、 2 ×
CTAB法以及 DNA试剂盒提取 ,未对操作简易的模
第 25卷　第 1期
2008年 1月 　　　　　　　　　　　　　　　　
干 旱 区 研 究
ARID　ZONE　RESEARCH　　　　　　　　　　　　　　　　
Vol.25　No.1
Jan.　 2008
＊ 收稿日期:2006-12-25;　修订日期:2007-01-03
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(KZCX3-SW-343);国家自然科学基金项目(40571085, 40771114)资助
作者简介:王红玲(1977-),女 ,新疆乌鲁木齐人 ,在读博士生 ,主要从事植物生态与分子生物学研究.E-mail:ladywhl@gmail.com
DOI :10.13866/j.azr.2008.01.003
板 DNA获取方法 NaOH法和直接 PCR法(direct
PCRamplification)进行对比研究 。同时 ,对影响 IS-
SR扩增反应的各反应组分的浓度 ,以及引物退火温
度和循环次数未进行交叉实验的深入研究。基于
此 ,本文以刺叶墙藓为研究对象 ,采用改进 CTAB
法 、NaOH法和直接 PCR法 ,对 DNA提取效果进行
了比较 ,并对影响 PCR扩增反应的反应组分浓度以
及反应循环条件进行了优化和筛选 ,以期找出荒漠
藓类植物 DNA提取的最适方法 ,使之能够获得清晰
和稳定的扩增效果 ,为进一步开展刺叶墙藓遗传多
样性的研究奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　供试材料的采集
供试材料刺叶墙藓采集于古尔班通古特沙漠南
缘丘间低地(44°35′N, 88°14′E),海拔 446 m,选取
发育较好的纯群斑块装入铝盒带回实验室 。刺叶墙
藓为变水植物 ,尤其在干旱少雨的荒漠地区 ,其变水
特性表现得尤为突出 ,在自然状态下 ,其植物体强烈
失水收缩 ,呈休眠状态 ,遇水后叶片即刻展开 ,呈绿
色可进行光合作用 。因此 ,在采样过程中可以不需
要对供试材料进行液氮固定或硅胶干燥处理。
1.2　实验材料的准备
刺叶墙藓在假根部位以及叶片上会粘结大量沙
粒 ,为了有效去除这些杂质 ,而不至于影响 DNA的
提取 ,先将单株个体用镊子取下 ,剪去假根 ,将上部
植株放入 ddH2O冲洗 1次 , 然后再将其装入加满
ddH2O的离心管中 ,用超声波轻微振荡清洗约 10
min,再用 ddH2O反复冲洗 3次 ,用滤纸吸干表面水
分 ,用于 DNA的提取。
1.3　DNA提取方法
1.3.1　改进 CTAB法 〔28〕
(1)将单株个体放入比色皿中(或同一斑块相
邻 10株个体的混合样品放入研钵中研磨),加入液
氮 ,用圆头玻璃棒 (或研杵)迅速研磨成粉末状 ,转
移至 1.5 mL离心管 ,加入预热的 2×CTAB提取缓
冲液 400 μL,再用 200 μL提取液冲洗。将冲洗液
倒入离心管后 ,加入 2%的 β -巯基乙醇 , 2%蛋白酶
k(10mg/mL),置 65℃水浴 30 ～ 60min,期间每隔 5
min轻轻上下摇动。
(2)冷却至室温 ,加入等体积氯仿 -异戊醇
(24∶1),上下摇动 10 min混匀 ,静置分层 , 4 ℃下
12 000 r/min离心 15 min。
(3)用剪过的枪头吸取上清液 ,转移至 1.5 mL
离心管 ,加入 2倍体积的预冷无水乙醇沉淀 DNA,
放入 4 ℃冰箱过夜。
(4)4℃下 12 000 r/min离心 5 min,倒去无水
乙醇 ,用 70%的预冷乙醇洗涤沉淀在管壁的 DNA1
～ 2次 , 4 000r/min离心 2 min,倒去乙醇 ,室温下风
干。
(5)加 200 μLTE,充分溶解 ,加 RNA酶 A(10
mg/mL),置 37 ℃水浴 30 min。
(6)放入 -20 ℃保存 ,待检测。
所需试剂:2×CTAB提取缓冲液(2%CTAB, 1
MTris-HClpH为 8.0, 0.5 MEDTA, 5 MNaCl, 2%
PVP);2%β -巯基乙醇 , 2%蛋白酶 k, RNA酶 A;氯
仿 -异戊醇(24∶1),无水乙醇 , 70%乙醇;TE缓冲液
(10 mMTris-HCl, 1 mMEDTA, pH为 8.0)。
1.3.2　NaOH提取法〔29〕
(1)将洗净的植株地上部分放入 0.2 mLPCR
管 ,加入 5 μL0.5 MNaOH,用不锈钢镊子捣碎 。不
锈钢镊子用 0.5 MHCl清洗 。
(2)加入 15μL0.5 MNaOH,研磨 1 ～ 2 min,
4℃下 12 000 r/min离心 2 min,取上清 ,以不同比
例(1∶10, 1∶50, 1∶100, 1∶150, 1∶200)溶于 100 mM
Tris-HCl, pH为 8.0。
所需试剂:0.5 MNaOH, 0.5 MHCl, 100 mM
Tris-HCl(pH为 8.0)。
1.3.3　直接 PCR法 〔29〕　用镊子夹取约 0.2 mm2
的植株绿色叶片 ,用 ddH2O冲洗干净 ,放入 0.2 mL
PCR管进行扩增 。此方法不需要对 DNA进行任何
处理 ,只需将扩增材料清洗干净。
1.4　DNA检测
1.4.1　紫外检测　将提取到的 DNA直接在分光光
度计(BeckmancoulterDu800)上检测 ,测定在波长
260 nm和 280 nm下的 OD值 。根据 OD260 /OD280
值 ,估计 DNA纯度。
1.4.2　电泳检测　基因组 DNA片段大小用 0.8%
琼脂糖凝胶电泳进行检测(BIO-RAD),电压 90 V,
电泳时间 30 ～ 40 min, Marker为大连宝 Takara
DL15000。电泳结束后 ,将凝胶放在 0.5 μg/mL溴
化乙锭溶液中染色 20 ～ 30 min, 在凝胶成像仪
(GeneGeniusBioimagingSystem)上观察并照相。
1.5　ISSR-PCR反应
以上述 3种方法得到的 DNA作为 PCR扩增模
板 , ISSR引物(表 1)、Bufer以及 dNTP均由上海生
工合成 , Taq酶选用上海捷瑞 。整个扩增反应在
BIO-RADPCR扩增仪上进行。 PCR扩增产物在
99
1期　　　　　　　　　 　　　王红玲等:荒漠刺叶墙藓 DNA的提取及 PCR扩增 反应条件　　　　　　 　　　　　　
1.2%的琼脂糖凝胶上电泳分离 , 电压 43 V, 160
min, Marker为 TakaraDL2000。扩增产物用 0.5
μg/mL溴化乙锭染色 20 ～ 30 min,在凝胶成像仪上
观察并照相 。
表 1　引物序列表
Tab.1　Listoftheprimers
引物编号 引物序列 引物编号 引物序列
Primer807 (AG)8T Primer840 (GA)8YT
Primer808 (AG)8C Primer841 (GA)8YC
Primer809 (AG)8G Primer861 (ACC)6
Primer811 (GA)8C Primer868 (GAA)6
Primer813 (CT)8T Primer876 (GATA)2(GACA)2
Primer817 (CA)8A Primer881 (GGGTG)3
Primer823 (TC)8C Primer885 BHB(GA)7
Primer825 (AC)8T Primer886 VDV(CT)7
Primer826 (AC)8C Primer888 BDB(CA)7
Primer834 (AG)8YT Primer891 HVH(TG)7
B=(C, G, T);D=(A, G, T);H=(A, C, T);V=(A, C, G);Y=(C, T)
1.6　ISSR-PCR扩增体系优化实验设计
采用改进 CTAB法提取的基因组 DNA为 ISSR
扩增体系优化模板 ,对可能影响引物清晰度和多态
性的因子:模板 DNA浓度 、Mg2+浓度 、dNTP浓度 、
Taq酶浓度以及引物浓度进行交叉比较实验 , 确定
最优的反应体系 ,以期得到稳定的反应结果。
1.7　ISSR反应程序的优化
根据 20个 ISSR引物理论退火温度来设定退火
温度范围 ,进行不同退火温度条件下的 PCR扩增 ,
筛选出扩增出清晰的 、可重复性较好的且可产生 3
个以上的多态位点的引物 ,为以后的进一步研究工
作奠定基础 。
表 2　刺叶墙藓不同个体数提取 DNA纯度测定结果
Tab.2　MeasuredresultsoftheDNApurityofTortula
desertorumextractedfromdifferentindividuals
编号 OD260 OD280 260 /280 浓度 /(ng· μL-1)
D1(单株) 0.115 0 0.062 9 1.81 6
D2(10株) 1.148 9 0.634 7 1.81 57
D3(10株) 0.659 9 0.362 9 1.81 33
D4(10株) 1.311 8 0.724 6 1.81 66
D5(10株) 0.792 5 0.431 3 1.83 40
2　结果与分析
2.1　3种方法对刺叶墙藓基因组 DNA提取的比较
利用改进 CTAB法分别对刺叶墙藓单株和混合
相邻单株进行了 DNA提取。结果表明 ,紫外检测单
株提取的 DNA含量只有 6ng/μL左右 ,电泳几乎没
有条带产生;而相邻 10个单株混合提取的 DNA含
量较高 ,模板含量在 30 ～ 70 ng/μL,且纯度较好(表
2和图 1)。用此方法提取的 DNA扩增出来的 PCR
产物条带清晰 ,易于识别与鉴定(图 2)。
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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干　旱　区　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
　　NaOH法提取 DNA的结果表明 ,引物 811以
1∶100比例稀释的 DNA模板利用扩增得到的产物较
为清晰 ,条带最多(图 3)。直接 PCR法结果表明 ,
所取叶片面积为 4 mm2时 ,引物 811无扩增条带产
生 ,而所取叶片面积为 1 mm2和 0.25 mm2时有扩
增条带产生 ,说明只需微量 DNA,就可扩增出条带
(图 4)。
(1～ 3泳道表示取 ca=4mm2 , 1 mm2 , 0.25mm2小叶为模板)
图 4　引物 811对直接 PCR扩增结果
Fig.4　PCRamplificationfragmentofgenomicDNAextracted
bydirectPCRmethodwithprimer811 (theleaveswere
selectedwithca=4mm2 , 1 mm2 and0.25mm2
astheDNAtemplateinline1 ～ 3)
通过对 3种提取基因组 DNA方法的比较发现 ,
改进 CTAB法步骤最多 ,耗时最长 ,但扩增产物较为
清晰和稳定;NaOH法步骤相对简单 ,虽然提取的
DNA经紫外检测不到其吸收峰值 ,但也有 PCR扩增
条带出现;直接 PCR法步骤最少 ,甚至不用提取基
因组 DNA,直接取微量面积的叶片作为 DNA模板
进行 PCR反应 ,操作最简单。
(1～ 4泳道模板浓度分别为 40ng, 30ng, 20 ng, 10ng)
图 5　引物 811对不同模板浓度 PCR扩增结果
Fig.5　PCRamplificationfragmentofdiferentDNAtemplate
concentrationswithprimer811 (thetemplateconcentrations
were40ng, 30 ng, 20 ngand10 ngrespectivelyinline1 ～ 4)
2.2　ISSR-PCR扩增体系优化
2.2.1　DNA模板浓度优化　设置了 DNA模板梯
度为 10 ～ 40ng,用引物 811进行 PCR扩增(图 5)。
引物浓度为 0.2 μM, dNTP为 0.1 mM, Mg2+为 2
mM, Taq酶 1U, ddH2O补充 ,使终反应总体积达到
20 μL。结果表明 ,模板浓度在 10 ～ 40 ng都可扩增
出条带。在 20 ～ 30ng,扩增条带清晰且稳定 。
2.2.2　不同浓度模板 DNA与不同浓度 dNTP, Taq
酶 、Mg2+、引物交叉实验 　对各反应成分设定了 4
个梯度(表 3),分别交叉进行 PCR反应。模板 DNA
浓度为 6 ng/μL。结果表明 , 1, 2, 7, 8泳道和 9泳
道均能扩增出条带(图 6),其他反应组合均没有条
带产生。其中 7泳道和 8泳道条带最为清晰 。模板
浓度在 20 ～ 50 ng, Taq酶为 1U, dNTP为 2 μL或 4
μL,引物为 2μL, Mg2+为 2μL为最佳反应条件。从
节约实验费用考虑 , dNTP取 2 μL。
表 3　不同浓度 DNA模板与不同浓度 Taq酶 、dNTP、
引物 、Mg2+交叉实验设计表
Tab.3　ListofcrossingexperimentsbetweendifferentDNA
templateconcentrationsanddifferentTaqE, dNTP,
primerandMg2+concentrations /μL
编号 反应组分Taq酶 dNTP 引物 Mg2+ 模板浓度
1 0.12 2 2 2 2
2 0.2 2 2 2 4
3 0.12 2 2 2 6
4 0.2 2 2 2 8
5 0.2 2 2 2 2
6 0.2 4 2 2 4
7 0.2 2 2 2 6
8 0.2 4 2 2 8
9 0.2 2 2 (2)4 (2)4
10 0.2 2 2 (2)4 (2)8
11 0.2 2 2 (2)3 (2)4
12 0.2 2 2 (2)3 (6)8
编号 1～ 4:模板浓度梯度与 Taq酶浓度梯度交叉反应;编号 5～ 8:模
板梯度与dNTP梯度交叉反应;编号 9 ～ 10:模板浓度梯度与引物梯
度交叉反应;编号 11～ 12:模板浓度梯度与 Mg2+梯度交叉反应。引
物为 811。
图 6　引物 811各组分交叉实验 PCR扩增结果
Fig.6　PCRamplificationfragmentofcrossingexperiment
betweendiferentDNAtemplateconcentrationsanddifferent
TaqE, dNTP, primerandMg2+concentrations
101
1期　　　　　　　　　 　　　王红玲等:荒漠刺叶墙藓 DNA的提取及 PCR扩增 反应条件　　　　　　 　　　　　　
2.2.3　最优 ISSR-PCR扩增反应体系的建立　通
过以上各个组分梯度实验反应 ,最终确立了刺叶墙
藓最优 ISSR-PCR扩增反应体系(表 4)。
表 4　刺叶墙藓最优 ISSR-PCR扩增反应体系
Tab.4　ReactionsystemforanoptimizedISSR-PCR
amplificationofTortuladesertorum
组分 反应体积 /μL 终浓度
ddH2O 7.8
bufer10× 2 1×bufer
Mg2+ 20mM 2 2mM
dNTPs10mM 2 0.1mM
引物 20 μM 2 0.2μM
模板 DNA/ng 4 10～ 40ng
Taq酶 5U/μL 0.2 1U
总体积 20
2.3　引物退火温度的筛选
不同退火温度设定从 48 ～ 55 ℃(表 5)以及 48
～ 58 ℃(表 6),对表 1所列的引物进行筛选 。
表 5　退火温度梯度
Tab.5　Temperaturegradientofanneal
编号 A B C D E F G H
退火温度 Tm/℃ 55 54.5 53.7 52.4 50.6 49.4 48.5 48
表 6　退火温度梯度
Tab.6　Temperaturegradientofanneal
编号 I J K L M N O P
退火温度 Tm/℃ 58 57.3 56.1 54.2 51.7 50 48.7 48
由图 7可以看出 ,在所有退火温度下的 2泳道
和 3泳道 ,引物分别为 809和 811都能扩增出条带。
较高温度下(A～ D)比较低温度下(E～ H)扩增条
带多 。在 50.6 ℃时条带最清晰 ,但扩增条带较少。
由图 8可以看出 ,在 A退火温度条件下 ,大部
分引物都能扩增出条带 。其中 A1泳道引物 861, A2
泳道引物 868, A6泳道引物 891和 A7泳道引物 886
都能扩增出较多较清晰的条带 , Tm温度为 5 5℃。
102
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干　旱　区　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷
(I～ P为表 6中不同退火温度 , 1 ～ 4引物顺序为 807, 826, 823, 841,每条引物每个退火温度下重复 2次)
图 9　不同引物退火温度 PCR扩增结果
Fig.9　PCRamplificationfragmentofdifferentannealtemperatures(I～ ParethediferentannealtemperaturesinTab.6;
theprimersareinasequenceof807, 826, 823and841)
而在 B, C, D, E和 F较低的退火温度条件下 ,扩增
出来的条带模糊 ,呈弥散状态。
对引物 807, 826, 823和 841在不同退火温度下
进行了 PCR扩增(图 9)。结果表明 , L4, M1 , M2, P3
泳道扩增结果较好 ,即引物 841在 54 ℃,引物 807
在 52℃,引物 826在 51.7 ℃,引物 823在 48 ℃时
条带清楚 ,条带数从 3 ～ 6条不等。其中 ,引物 826
扩增条带数最多 ,达到了 6条。
表 7　刺叶墙藓 ISSR-PCR扩增反应筛选引物
最适退火温度及扩增条带数
Tab.7　Optimizedannealtemperatureandnumberof
amplifiedbandsofISSR-PCRinTortuladesertorum
编号 理论退火温度Tm/℃
优化退火温度
Tm/℃ 扩增条带
Primer809 52 50 3
Primer811 52 50 3
Primer861 60 55 4
Primer868 48 55 3
Primer886 50 55 3
Primer891 50 55 3
Primer807 52 52 5
Primer826 55 52 6
Primer823 55 48 5
Primer841 56 54 4
　　最终确定并筛选出 10条适合刺叶墙藓 ISSR-
PCR扩增反应的引物及各自最适退火温度(表 7)。
从表 7可以看出 ,引物 868, 886和 891优化得到的
Tm要大于各自理论 Tm, 而其他引物优化 Tm则低
于各自理论 Tm。所有引物优化 Tm浮动范围都不超
过 5℃。
2.4　 ISSR-PCR反应程序的优化
最初采用 Hassel〔30〕等对苔藓进行 ISSR分析时
的反应程序:94 ℃ 4min, 1个循环;94℃ 1 min,退
火温度 (Tm)2 min, 72 ℃ 1 min, 30个循环;72 ℃
7min, 1个循环 。结果表明 ,对刺叶墙藓扩增效果
不理想 ,条带较模糊 。遂将变性时间 ,退火时间缩
短 ,将循环次数增加 ,扩增条带比较清晰稳定 。最终
建立了刺叶墙藓 ISSR-PCR扩增反应程序为:94 ℃
4min, 1个循环;94 ℃ 45 s, 退火温度 (Tm)45 s,
72 ℃ 1min, 35个循环;72 ℃ 7 min, 1个循环;4 ℃
保存 。
3　讨　论
荒漠耐旱藓类植物由于长期生活在恶劣的自然
环境中 ,形成了一系列的生态适应特性 ,包括植株体
矮小(高 0.5 ～ 1.2 cm)、单株个体生物量极低(仅为
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1期　　　　　　　　　 　　　王红玲等:荒漠刺叶墙藓 DNA的提取及 PCR扩增 反应条件　　　　　　 　　　　　　
0.5mg),且体内含有较多的次生代谢物质等 ,在很
好适应了自然生境的同时 ,却给基因组 DNA的提取
带来了困难 。由于刺叶墙藓假根和茎叶可以粘结沙
粒 ,为了使样品组织保持洁净 ,可利用超声波轻微振
荡 ,再反复用 ddH2O冲洗 ,避免杂质污染 DNA。为
了减少研磨过程中原材料的损失 ,采用较小的比色
皿以及自制圆头玻璃棒代替研钵和研杵。已有研究
使用微型杵或微型钻头直接在 Eppendorf管中进行
植物组织微量 DNA提取 , 且提取效果很好 〔27, 30〕。
荒漠植物为了适应恶劣的环境 ,体内会合成一些次
生代谢物质 ,如多酚类物质 ,这些物质抑制了 PCR
反应而得不到较好的扩增效果 〔31〕。CTAB提取缓冲
液中加入的 PVP可以去除刺叶墙藓植物体内的多
酚类物质 ,使 DNA纯度满足 PCR扩增反应的顺利
进行 〔27, 32〕。苔藓 DNA易降解 ,因此在提取过程中
加大 β -巯基乙醇的浓度和蛋白酶 K的浓度 (从
0.2%增加到 2%),可以有效防止 DNA被氧化和去
除蛋白质〔26〕。提取过程中 ,苔藓 DNA可能会被空
气中的寄主真菌污染 ,而轻微污染不会影响条带的
扩增〔30〕。
理想的 DNA提取方法 ,通常要求快速 、简易 、低
成本 、无污染 ,提取的 DNA满足特定研究目的的要
求 。改进 CTAB法提取的 DNA用于 PCR扩增时产
生的条带清晰稳定。张道远分别用快速提取法 、2×
CTAB法以及 DNA试剂盒 ,对刺叶墙藓进行了基因
组 DNA提取 ,结果表明 , 2×CTAB法获得的 DNA扩
增效果最好 ,条带最清晰稳定 〔27〕 ,与本实验获得的
结果一致。目前苔藓植物的 DNA提取大多数都采
用改进 CTAB法 ,能获得质量较高的 DNA〔24, 33 ～ 37〕。
也有研究表明 ,高盐 、低 pH法在提取苔藓植物基因
组 DNA上要优于 CTAB法〔23〕。 CTAB法已日趋成
熟和完善 ,但操作步骤繁多 ,耗时耗力 。另有一些研
究利用 DNA试剂盒 〔27, 30〕 ,但比较昂贵。相比较而
言 , NaOH法和直接 PCR法由于操作步骤少 、省时省
力 、低成本 、无污染 ,是最经济有效的 DNA模板制备
方法。 Werner对苔藓植物(2种苔类和 15种藓类)
利用 NaOH法和直接 PCR法获得的 DNA模板进行
PCR扩增 ,都能扩增出条带〔29〕。本研究利用 NaOH
法和直接 PCR法也扩增出谱带 ,但发现直接 PCR
法扩增结果不稳定 ,还需进一步摸索实验条件 。可
以预见 ,直接 PCR法一旦稳定成熟 ,可节约大量时
间及实验费用 ,对样本数量较大居群的 DNA提取具
有广阔的应用前景 ,尤其适用于荒漠藓类植物这样
个体矮小 、生物量很小的单株 DNA模板制备 。
特异性 、有效性和忠实性是检验 PCR扩增效率
的 3个指标〔38〕。影响 ISSR扩增结果的因素包括反
应组分的浓度和反应程序的设定 。对反应组分中的
模板浓度 、Taq酶 、dNTP和 Mg2+、引物浓度优化结
果表明 ,所有反应组分浓度都在各自范围之内。对
ISSR扩增体系影响因素进行了更加深入地研究 ,建
立了 20 μL反应总体积时刺叶墙藓最优反应体系 ,
与张道远等将刺叶墙藓最优 RAPD体系作为 ISSR
体系 〔10 μL反应体系包括 1 μL10×EXBufer(包
含 Mg2+), 0.2mMdNTPs, 0.2 μM引物 , 2 ～ 5 ng模
板 DNA, 1.5UTaq酶 〕〔27〕有所不同 ,说明虽然反应
总体积不同 ,但只要对各个组分的浓度进行适当的
优化调整 ,达到最合适的比例 ,都能获得清晰稳定的
扩增条带 。
反应程序中对引物的退火温度以及热循环条件
进行了优化 ,确定了最优的反应程序体系。结果表
明 ,筛选得到的引物其优化 Tm值在理论 Tm±5 ℃
范围内 。一般来说 , 优化 Tm值为理论 Tm-5
℃〔38〕。但是在 Tm允许的范围内 ,推荐使用尽可能
高的退火温度 。因为退火温度过低会增加退火时间
的延长 ,这个时间虽然能够确保达到退火温度 ,但是
增加了低温下产生非特异性产物的机会 〔30〕。
4　小　结
利用改进 CTAB法提取得到的刺叶墙藓基因组
DNA纯度较高 ,质量较好 , ISSR扩增条带清晰稳定。
NaOH法和直接 PCR法步骤简单 ,但是要想获得稳
定且重复性好的结果 ,还需要进行反复摸索最适条
件。一旦方法成熟 ,对于样本容量较大的居群分子
生物学的研究有着重要的应用价值。本文优化得到
的刺叶墙藓 ISSR扩增体系为后续开展遗传多样性
的研究奠定了基础 。
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DNAExtraction, OptimizationofPCRAmplificationConditionsand
SelectionofPrimersofTortuladesertoruminBioticCrust
intheGurbantonggutDesert
WANGHong-ling1, 2 , 　ZHANGYuan-ming1 , 　 WUNan1, 2 , 　 CHENRong-yi1, 2 , 　
NIEHua-li1, 2 , 　ZHANGJing1, 2
(1.XinjiangInstituteofEcologyandGeography, ChineseAcademyofSciences, Urumqi830011, China;
2.GraduateSchool, ChineseAcademyofSciences, Beijing100049, China)
Abstract:　Inthisstudy, theDNAofTortuladesertorumBroth.inbioticcrustintheGurbantonggutDesertisex-
tractedusingthemethodsofmodifiedCTAB, NaOHextractionanddirectamplification, andtheisolationandISSR
amplificationefectsofthesemethodsarecompared.TheresultsshowthatthecontentandpurityofgenomicDNA
extractedwiththemodifiedCTABmethodisveryhigh, andtheDNAcanbesuccessfulyusedinISSRamplifica-
tion.OncethePCRamplificationsystemisdeveloped, thedirectPCRamplificationistherapidestandsimplest,
andthecostisthelowestinpreparingplantsampleforPCR, especialythemethodisapplicabletoextracttheDNA
fromtheshortdesertmosseswithverylowbiomass.BasedonthegenomicDNAextractedfromTortuladesertorum
withthemodifiedCTABmethod, themainfactorsafectingtheresultofISSRamplificationaretestedandcom-
pared.AnoptimalISSRreactionsystemapplicableforextractingtheDNAofTortuladesertorumisdeveloped.The
total20-μLvolumeisconsistedof2 μL10 ×bufer, 2 mMMg2+ , 0.1mMdNTPs, 0.2 μMprimer, 10 ～ 40 ng
templateDNAand1UTaqpolymerase.Theamplificationprofileisconsistedofonecycleof4 minutesattempera-
tureof94 ℃, 35cyclesof45sattemperatureof94℃, 45 satannealtemperatureand1minuteattemperatureof
72 ℃, andonecyclewithafinalextensionstepof7 minutesattemperatureof72 ℃.Tortuladesertorumisthe
dominantspeciesinbioticsoilcrustintheGurbantonggutDesert, andtheresearchachievementcanberegardedas
thebaseoffurtherstudyingthegeneticdiversityofTortuladesertorum.
Keywords:　TortuladesertorumBroth.;DNAextraction;ISSRamplification;mossbioticsoilcrust;Gurban-
tonggutDesert.
106
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干　旱　区　研　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　25卷