全 文 ：2008年7月第5卷第21期 ·论著·
CHINAMEDICALHERALD 中国医药导报
[基金项目]国家自然科学基金中国西部环境和生态科学重大研究计划
(90202016)
[作者简介]刘薇(1984-),女,华中科技大学在读硕士研究生,主要从事
植物生物技术方面的研究。
*通讯作者
药用植物刺山柑悬浮培养细胞聚集体理化性质研究
刘 薇 1,栗茂腾 1*,朱玉梅 2,甘 露 1,余龙江 1
(1.华中科技大学生命科学与技术学院,湖北武汉 430074;2.山东医学高等专科学校现代教育技术中心,山东临沂 276000)
[摘要]目的:探讨不同直径刺山柑细胞聚集体黄酮含量与其颗粒大小、生长状态的关系及可能机制。方法:根据细
胞直径的不同,分拣出3种不同大小的刺山柑细胞聚集体,对它们进行了黄酮含量、相关酶活性及再培养曲线的
测定。结果:不同的细胞聚集体在形态大小、黄酮含量、酶的活性、生长速度等方面均存在着差异,其中颗粒最小的
细胞聚集体黄酮含量约为颗粒较大的细胞聚集体的2倍,并且其丙二醛含量、苯丙氨酸解氨酶及过氧化物酶的活
性及再培养曲线均具有相同的变化趋势。结论:不同聚集体黄酮含量与其颗粒大小及生长状态有一定的关系,个
体较小的与氧气、培养基养分接触充分,利于细胞生长与次生代谢物的积累有关。
[关键词]刺山柑;悬浮培养;聚集体;黄酮;直径
[中图分类号]R961 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2008)07(c)-019-04
Theresearchforthephysico-chemicalpropertyofCapparisSpinosaL.sus-
pensioncelaggregation
LIUWei1,LIMao-teng1*,ZHUYu-mei2,GANLu1,YULong-jiang1
(1.ColegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan 430074,China;2.
ModernEducationCenter,ShandongMedicalColege,Linyi276000,China)
[Abstract]Objective:Toinvestigatetherelationsbetweenflavonecontentandparticlesize,growthconditionofdiferent
diametersofCapparisSpinosaL.celaggregationanddiscussthepossiblemechanism.Methods:Accordingtothedifer-
encesofceldiameter,weselected3diferentsizesofCapparisSpinosaL.celaggregationanddeterminedflavonecon-
tent,corelatedenzymeactivitiesandrecultivatecurve.Results:Thecelaggregationshaddiferencesinshapeaswelas
size,flavonecontent,enzymeactivities,growthspeedandsoforth.Theflavonecontentofthesmalestcelaggregation
wasapproximatelytwicecomparedtothelargerones,anditsmalonaldehydecontent,thephenylalanineammonialyase
andperoxideenzymeactivitiesandrecultivatecurvepresentedthesamechangetendency.Conclusion:Theflavonecon-
tenthascertainrelationswithparticlesizeandgrowthconditionofdiferentcelaggregation.Thesmalindividualcon-
tactsfulywiththeoxygenandthenutrientofculturemedi-
um,whichisbenefittocelgrowthandthesecondary
metaboliteaccumulation.
[Keywords]CapparisSpinosaL.;Suspensionculture;Ag-
gregation;Flavone;Diameter
块,使用超薄切片机进行超薄切片,经电子染色后用透射电
镜观察叶绿素颗粒所在部位及淋巴结各种亚细胞的超微结
构。看经过染色后不同时间内叶绿素颗粒出现在哪些部位及
淋巴结超微结构是否发生变化以证实CDS是否具有毒性作
用。实验显示染色淋巴结的超薄切片上,注射 CDS后,叶绿
素颗粒多位于巨噬细胞内,髓窦内亦可见叶绿素颗粒。注射
后4.0h巨噬细胞内含大量叶绿素颗粒;注射 CDS24h后,
皮质、髓质内叶绿素颗粒变少。该实验还发现,注射 CDS后
的不同时间间隔内,染色淋巴结内细胞超微结构形态无明显
改变,这就证实了CDS无急性毒副作用。
[参考文献]
[1]王新明,杨洪霞,解家英,等.叶绿素显示液对淋巴结显色的实验及
临床应用观察[J].中国肿瘤临床,2004,18:17-19.
[2]WangH,TanY,WangX,etal.Identificationofpelviclymphnodes
withchlorophylinafterinjectionintotheuterinecervix;anexperimen-
talandclinicalstudy[J].Lymphology,2001,34(2):69-76.
[3]俞绍音,杨天锡,黄世璇,等.淋巴染色在淋巴清除术中的应用价值[J].
中华妇产科杂志,1986,21(2):104-106.
[4]解家英,王海杰,王新明,等.宫颈注射叶绿素在盆腔淋巴结切除术中
的应用[J].现代妇产科进展,1999,8(1):19-21.
[5]DotingMH,JansenL,NiewegOE,etal.lymphaticwithintra-lesional
traceradministrasioninbreastcancerpatients[J].Cancer,2000,88(11):
2546-2552.
[6]ImotoS,FukukitaH,MurakamiK,etal.Pilotstudyonsentinelnode
biopsyinbreastcancer[J].JSurgOncol,2000,73(3):130-133.
[7]TanisPJ,NiewegOE,ValdesORA,etal.Anatomyandphysiologyof
lymphaticdrainageofthebreastfromtheperpectiveofsentinelnode
biopsy[J].JAmColSurg,2001,192(3):399-409.
[8]仇沂洲,刘清明,张式暖,等.叶绿素染色在喉癌下咽癌颈淋巴结清扫术
中的应用[J].临床耳鼻喉科杂志,2002,16(2):71-73.
(收稿日期:2008-03-07)
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中国医药导报 CHINAMEDICALHERALD
细胞聚集体是液体悬浮培养的植物细胞特有存在方式[1,2]。
在研究中,往往将细胞培养物当作均匀的细胞或细胞聚集体
而忽略了不同细胞聚集体的异质性。由于无性变异、通气量、
摇瓶转速、培养基组成及成分等多方面复杂的影响,细胞培
养中的聚集体无论在物理性质、生长程度、次生代谢产物产
量等方面都存在着一定的差异,这些差异可能是造成次生代
谢物产量波动的原因[2-5],如 Xu等[1]发现圆球形、质地致密、
表现出一定分化水平的自固定化东北红豆杉细胞中紫杉醇
的合成能力较强。刺山柑为白花菜科山柑属植物,在我国主
要分布于新疆、甘肃、西藏等地[6]。刺山柑含有挥发油、生物碱
类、类黄酮类及萜类等物质,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗高血
压及治疗痛风和风湿等功效[7-9],其中所含有的类黄酮类物质
是其抗菌抗炎等药效的主要成分。由于刺山柑生长环境特
殊、生长周期较长、野生资源不断遭到破坏,因此细胞培养成
为最为重要的积累其有效次生代谢物的方法。目前,我们已
经实现了刺山柑愈伤组织的诱导[10,11]。对已经诱导出的刺山
柑愈伤组织细胞,发现其呈现出大小不同的聚集体形态。在
本实验的研究中,把刺山柑细胞聚集体的直径作为一个指
标,分拣出三种大小不同的细胞聚集体,以阐明刺山柑悬浮
培养中的聚集体理化性质及黄酮含量与细胞大小的关系。
1材料与方法
1.1实验材料
刺山柑愈伤组织由叶诱导而来,其材料为华中科技大学
实验田种植的刺山柑植株。
1.2培养条件
采用 MS培养基作为基本培养基,内含 1mg/L2,4-D、
1.5mg/L6-BA,蔗糖 30g/L,pH5.8~6.0。高温 121℃下灭菌
20min。光照培养的培养条件:光照强度 2000Lux;光周期
14h光/10h暗;温度(25±1)℃。暗培养的培养条件:光照强
度<50Lux;温度(25±1)℃。
1.3细胞聚集体的分拣
使用刻度尺进行测定,将颜色、状态相似且长势较好的
刺山柑愈伤组织细胞按直径不同分拣为0~2、2.1~5、5.1~8mm
三种梯度,进行重培养及各指标的检测。
1.4实验方法
1.4.1黄酮含量的测定 依照文献[12,13]的方法修改,取烘干的甘
草细胞,磨成粉末后,过100目筛,取0.05g细胞粉末至3ml离
心管中,加入75%乙醇 3ml,超声处理1h后,8000转/min离
心6min。取上清夜 1ml,加 3ml95%乙醇,8000转/min离
心6min。取两管(1个实验管,1个对照管)各加上清夜1ml,实
验管中加 1ml甲醇,再加 0.5mlKOH,显色 5min后补足甲
醇至5ml;对照管直接加甲醇补足到5ml。在410nm下测其
OD值。
1.4.2过氧化物酶的测定 采用愈创木酚法测定过氧化物酶
活性[14]。取 0.5g愈伤组织细胞加入磷酸缓冲液,研磨成匀
浆,离心,取上清。依次加入以下反应液,2.9ml0.05mol/L磷
酸缓冲液液、1.0ml2%H2O2及 1.0ml0.05mol/L愈创木酚。
以加热煮沸 5min的酶液为对照。反应体系加入酶液后于
37℃水浴中保温3min,470nm波长下比色,每隔1min记录
一次吸光值,共计5次。然后以每分钟A470变化0.01为1个
酶活单位。
1.4.3丙二醛含量的测定 采用硫代巴比妥酸分光光度法[15]。
取 0.5g愈伤组织细胞,加入 5%TCA5ml研磨成匀浆,由
3000转/min离心10min,上清液即为丙二醛提取液;吸取2ml
上清液,加入0.67%TBA2ml混合后于沸水浴上加热30min,
冷却后再离心 1次。分别测定上清液在 450,532和 600nm
处的吸光度值,并按公式 C(μmol/L)=6.45(A532-A600)-0.56A450
算出MDA浓度。
1.4.4苯丙氨酸解氨酶的测定 参阅文献[16]略做修改。取愈伤
组织0.5g,加7ml含5mmol/L巯基乙醇的硼酸缓冲液冰浴
中研磨,10000转/min离心 15min,取上清液。酶液适当稀
释。1ml酶液加1ml0.02mmol/L苯丙氨酸、2ml蒸馏水。对
照不加底物,多加 1ml蒸馏水,30℃中保温 0.5h后置于冰
浴。用紫外分光光度计在290nm处进行吸收测定。
1.5不同大小细胞聚集体的再培养
将分得的三种直径不同的细胞聚集体收集于培养基中
重新培养。取54个50ml的三角瓶,每瓶分装20mlMS培养
基,并接种 0.8g鲜细胞,每种直径的细胞设 3组对照,置于
22℃光照条件下摇床培养。每隔4d称取细胞鲜重,1个生长
周期后绘制细胞聚集体再生长曲线。
2结果与分析
2.1不同大小细胞聚集体的黄酮含量变化
实验结果表明,直径为 0~2mm的刺山柑细胞聚集体中
黄酮的含量最高(0.68mg/L),约为后两种黄酮含量的两倍,
说明其合成次生代谢物能力最强。随着细胞直径的增大,黄
酮含量呈下降趋势但无显著性差异(P>0.05)。同时发现直径
较大的细胞聚集体形状趋于不规则球状,质地较硬,不易分
散为较小的细胞团块。在悬浮培养的条件下,植物细胞较容
易聚集在一起,在聚集的细胞团块中,位于表面和中央的细
胞处于不同的分化状态,从而常常表现出与游离细胞不同的
次生合成能力[3]。这可能是由于后两种细胞聚集体成团块程
度超过正常大小,细胞内部成分与氧气、营养物质等接触障
碍,正常生理活动受到影响,导致黄酮类物质的正常积累受
阻。且随细胞团块增大,黄酮含量降低但不显著(图1)。
2.2不同大小细胞聚集体的丙二醛含量变化
我们测定了细胞聚集体的丙二醛含量。结果表明,颗粒
最小的细胞聚集体丙二醛含量最高,随着细胞直径的增大,
丙二醛含量依次呈下降趋势且差异显著(P<0.05)。上述实验
结果我们可以认为,颗粒较小的细胞聚集体与培养基中的营
养物质、氧气接触充分,新陈代谢旺盛,往往会产生较多的氧
自由基。未参与细胞正常生理活动的氧自由基使细胞质膜过
氧化导致丙二醛含量上升。随着细胞团块直径的增大,细胞
内新陈代谢水平下降,氧自由基减少,丙二醛含量相应下降
(图1)。
2.3不同大小细胞聚集体的POD酶活性变化
实验结果显示,个体最小的细胞聚集体其 POD酶活性
明显高于后两种,直径较大的两种细胞聚集体 POD酶活性
无显著性差异(P>0.05)。由于直径较小的细胞团产生的氧自
由基较多,导致POD酶活性迅速提高,清除多余的自由基以
减少对植物体的损伤,同时引起次生代谢物黄酮的大量积
累。直径较大的两种细胞聚集体质地硬不易分散,与养分氧
气接触不充分,氧自由基产生较少,POD活性相对较低。这与
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丙二醛及黄酮含量的变化趋势相一致(图1)。
2.4不同大小细胞聚集体的苯丙氨酸解氨酶活性变化
PAL的活性测定结果表明,个体最小的细胞聚集体中PAL
活性明显高于另外两种,直径较大的两种愈伤组织聚集体
PAL活性无显著性差异(P>0.05)。这与上述各指标的变化趋
势相一致。在新陈代谢较为旺盛的小颗粒细胞聚集体中,
PAL参与细胞生长的多种代谢途径,酶活较高;同时丙二醛
含量的升高,氧自由基的增多也会使 PAL活性有一定程度
的提高,刺激植保素黄酮的积累。直径较大的两种细胞聚集
体,新陈代谢水平与丙二醛含量均低于第一类细胞,PAL活
性有一定程度的下降,黄酮含量也稳定在较低水平(图1)。
图1不同大小细胞聚集体几种生理指标的含量
Fig.1Thecontentofseveralphysiologicalfactorsindiferentsizeof
celaggregation
2.5不同大小细胞聚集体的再培养
把不同直径的刺山柑细胞聚集体重新培养,发现其生长
情况也有所不同。悬浮细胞生长趋势呈“S”型分布,个体较小
的细胞聚集体延迟期较短,生长较迅速;直径较大的两类细
胞聚集体生长缓慢且差异不显著。图2是三种直径细胞聚集
体再培养生长曲线,充分反映了上述情况。
图2不同直径细胞聚集体再培养生长曲线
Fig.2Kineticcurveofcelgrowthofdiferentdiameterofcelaggregation
3讨论
根据直径大小,使用刻度尺将培养物进行区分是最容易
的一种用来分拣聚集体的方法。实际操作中,我们发现,刺山
柑愈伤组织聚集体形状较规则,培养物无黏液,利于使用这
种方法进行分拣,从而获得不同状态的细胞聚集体。需要注
意的是,分拣时要尽量挑选状态正常、长势较好且时期一致
的细胞聚集体,把个体差异作为唯一变量。
次生代谢是植物细胞及组织发育、分化到一定阶段的生
理活动,在细胞生长阶段也有一定程度的积累。黄酮类物质
作为刺山柑的有效成分,具有抑菌、抗真菌、抗肿瘤、抗诱变、
抗病毒、抗氧化、保肝等广泛的药理作用[17-19]。本实验以不同
大小的刺山柑细胞聚集体为材料,研究了黄酮含量的变化趋
势,并发现其与丙二醛含量、POD及PAL的活性变化相一致。
植物组织中的丙二醛是膜脂过氧化作用后产生的化合物[20]。
它是指植物膜中的不饱和脂肪酸在自由基诱发下发生的过
氧化反应,导致膜中的不饱和脂肪酸含量降低。涂三思等[21]
研究表明,高温胁迫下黄姜叶片丙二醛含量升高,这表明其
体内存在相当数量的氧自由基,从而导致细胞质膜发生过氧
化代谢而分解形成MDA。齐曼·尤努斯等[22]研究发现,在NaCl
胁迫下,大果沙枣叶片中MDA的含量明显高于对照。植物体
内多余的氧自由基由其保护酶系统主要成员过氧化物酶
(POD)清除,POD存在于细胞壁或质外体部分[23],与质膜表
面结合紧密,能够产生超氧化物氧化使自由基氧化,避免其
在植物体内的积累。王倡宪等[24]研究表明,在对黄瓜幼苗接
种尖孢镰刀菌后,其根系中POD活性上升,导致黄酮和总酚
含量高于对照。本实验中,个体最小的细胞聚集体,与培养基
中的氧气及营养物质接触充分,新陈代谢旺盛,生理活动正
常,产生的氧自由基较多,未参与细胞正常代谢活动的自由
基使质膜过氧化导致丙二醛含量上升,引起POD含量的升
高及次生代谢物黄酮的积累。个体较大的细胞聚集体形状趋
于不规则球状,质地较硬,不易分散为较小的细胞团块。不易
与养分充分接触,正常生理代谢下降,黄酮积累受阻。苯丙氨
酸解氨酶(PAL)是植物体内次生代谢的关键酶和限速酶,在
植物细胞生长发育、输导组织形成、花色素代谢、以及植物抗
逆和抗病等生理代谢中起非常重要的作用 [25],并参与木质
素、香豆素、类黄酮、羟基肉桂酸脂以及异类黄酮衍生物等在
内的植物抗毒素的合成[26],本实验中,PAL活性的提高直接
导致次生代谢物黄酮含量的积累,这和先前指标的变化趋势
相一致。
本实验所分拣出的三种细胞聚集体,颗粒最小的各指标
均高于另外两种,而直径较大的两种则差异不显著。其再培
养生长曲线也得到相同的结果。此结果对我们以后进行大规
模培养刺山柑细胞,保证其生长速度及次生代谢物产量具有
理论指导意义。此外,在进行次生代谢物合成相关酶活性分
析、基因表达差异分析、细胞分化及凋亡研究中,具不同状态
级次生代谢物含量的差异细胞的获取至关重要[5]。本实验所
使用的方法及结果,具有一定的参考意义。
[参考文献]
[1]XuJF,YinPQ,WeiXG.Self-immobilizedaggregatecultureofTaxus
cuspidataforimprovedtaxolproduction-calusculturefortaxolprepa-
rationusedasacytostaticagent[J].BiotechnolTech,1998,12(3):241-
2.1 5.1
(mm)
0～2mm
2.1～5mm
5.1～8mm
(d)
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thestomach[J].Oncology,2003,64(3):266-274.
[3]SugimachiK,TanakaS,TaguchiK,etal.Angiopoietinswitchingregu-
latesangiogenesisandprogressionofhumanhepatocelularcarcinoma[J].
JClinPathol,2003,56(11):854-860.
[4]LeeOH,BacSK,BaeMH,etal.Identificationofangiogenicpropertiesof
insulin-likegrowthfactorⅡ invitroangiogenesismodels[J].BrJCan-
cer,2000,82(2):385-391.
[5]李杰,时昌文,曹莉莉,等.原发性肝癌手术前后 T细胞亚群及细胞
因子测定的临床意义[J].山东医药,2007,47(3):46-48.
[6]董宝玮,温朝阳,梁萍,等.微波消融与手术切除治疗原发性小肝癌对
癌细胞播撒入血的影响[J].中华肿瘤杂志,2006,28(1):39-42.
(收稿日期:2008-02-27)
244.
[2]YukimuneH,MatsubaraK,HaraY.Producingtaxane-typediterpense
e.g.taxol,usefulastherapeuticagentsincancertreatmen[P].Europe
Patent:1999,EP99-047885/05.
[3]张泓.植物培养细胞的形态分化与次生代谢产物的生产[J].植物学通
报,1994,11(4):12-19.
[4]KetchumREM,GibsonDM,CroteauRB,etal.TheKineticsoftaxol
ccumulationincelsuspensionculturesofTaxusfolowingelicitation
withmethyljasmonate[J].BiotechBioeng,1999,62(1):97-105.
[5]臧新,梅兴国,周忠强,等.中国红豆杉悬浮培养细胞聚集体异质性
的初步研究[J].生命科学研究,2002,3(6):60-63.
[6]张立运,杨春.保护风蚀地的刺山柑[J].植物杂志,2004,34(1):3-4.
[7]JouadH,HalouiM,RhiouaniH,etal.Ethnophar-macologicalsurveyof
medicinalplantsusedorthetreatmentofdisbetes,cardiacandrenaldis-
easesinthenorthcentreregionofMorocco(Fez-Boulemane)[J].Journal
ofEthnopharmacology,2001,77:175-182.
[8]AliM,RamachandramR,RafiulahMR,etal.Preventionofcarbonte-
trachloride-inducedhepatotoxicitybytheethanolextractofCapparis
moonifruitsinrats[J].PharmaceuticalBiology,2004,42:286-288.
[9]EddouksM,LemhadriA,MichelJB.Hypolipidemicactivityofaqueous
extractofCapparisspinosaL.innormalanddiabeticrats[J].Journalof
Ethnopharmacology,2005,98:345-350.
[10]栗茂腾,王艳婷,甘露,等.药用植物刺山柑快繁再生体系的建立[J].
华中农业大学学报,2007,2(26):25-29.
[11]王艳婷,甘露,刘薇,等.药用植物刺山柑愈伤组织的诱导及细胞代
谢特征研究[J].现代生物医学进展,2007,7(12):1779-1783.
[12]伍蔚萍,孙文基,阎宏涛,等.分光光度法测定甘草中总黄酮的含量
[J].药物分析杂志,2005,25(4):469-472.
[13]王冰,李宏涛,缪铭,等.甘草总黄酮提取工艺的研究[J].郑州工程
学院学报,2004,25(3):61-63.
[14]梁迎暖,郭巧生,张重义,等.怀菊花期次生代谢物含量及同功酶活
性动态变化研究[J].中国中药杂志,2007,2(32):199-202.
[15]李合生.植物生理生化实验原理和技术[M].第2版.北京:高等教育
出版社,2003.
[16]马春红,李运朝,董文琦,等.低浓度玉米小斑病菌 T毒素对玉米叶
片苯丙氨酸解氨酶活性的诱导研究[J].华北农学报,2007,22(1):
40-43.
[17]邢国秀,李楠,王童,等.甘草中黄酮类化学成分的研究进展[J].中国
中药杂志,2003,28(7):593-597.
[18]敖明章,高莹莹,余龙江.刺山柑化学成分及其药理活性研究进展
[J].中草药,2003,3(38):463-467.
[19]张丽,常金华,罗耀武.不同高粱基因型感蚜虫前后POD、PPO、PAL
酶活性变化分析[J].农业生物技术科学,2005,7(21):40-42.
[20]方旭燕,俞慧娜,刘鹏,等.Fe2+对大豆幼苗生理特性的影响[J].生态
环境,2006,15(2):341-344.
[21]涂三思,秦天才.高温胁迫对黄姜叶片脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含
量的影响[J].湖北农业科学,2004,4:98-100.
[22]齐曼·尤努斯,李秀霞,李阳,等.盐胁迫对大果沙枣膜脂过氧化和
保护酶活性的影响[J].干旱区研究,2005,12(22):503-507.
[23]彭兰华,高甜慧.青变菌毒素对黑松松针可溶性 Pr、POD酶和 PPO
酶活性的影响[J].河南林业科技,2004,6(24):4-5.
[24]王倡宪,秦岭,冯固,等.丛枝菌根真菌对接种尖孢镰刀菌后黄瓜根
系次生代谢物的影响[J].植物保护学报,2005,32(2):148-152.
[25]贺立红,张进标,宾金华.苯丙氨酸解氨酶的研究进展[J].食品科技,
2006,7:31-34.
[26]LiskerN,CohenL,ChalutzE,etal.Fungalinfectionssuppressethy-
lene-inducedphenylalanineammonialyaseactivityingrapefruits[J].
Physiol,PlantPathol,1983,22:331-338.
(收稿日期:2008-03-13)
22