全 文 ：Vol. 32 No. 2
Feb. 2012
第 32卷 第 2期
2012年 2月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
桉树系统引种和栽培在中国已开展 20年多年，
通过尾叶桉等的引种，在桉树遗传改良、资源保
存及推广应用上取得重大进展 [1]。尾叶桉具有速生、
适应性广及多种用途的特点，通过引入其它具有
速生、耐寒、耐旱、抗逆性强的优良桉树花粉，
利用控制授粉技术获得更加优良的杂种子代。只
有通过优树及其杂种子代的基础研究才会使尾叶
桉杂种人工林获得更大发展，满足社会对于木材
的巨大需求，以期获得更大的经济效益和社会效
益。分子水平的研究，使杂种目的性状的获得具
有不同于表型选择的稳定性和可靠性。
SSR标记因具有：整个基因组中随机分布；
尾叶桉杂种子代 DNA提取和 SSR引物筛选
李光友，徐建民，吴世军，杜志鹄，韩 超，王 伟，陆钊华，李宝琦
(中国林业科学研究院 热带林业研究所，广东 广州 510520)
摘 要： 以 SSR分子标记法分析尾叶桉 (Eucalyptus urophylla)及其杂种间关系，采用改良 CTAB法提取总
DNA，同时优化提取方法和 PCR扩增条件。从文献中选取尾叶桉 100对 SSR引物中筛选出多态性高、稳定性好
的 17对引物作为实验尾叶桉杂种材料的 SSR分析引物，为进一步对其进行遗传多样性和有效基因资源利用研究
奠定基础和提供依据。
关键词： 尾叶桉家系；DNA提取；SSR引物筛选
中图分类号： S792.39　　 文献标志码： A　 文章编号：1673-923X(2012)02-0081-05
DNA extracting and SSR primer screening of Eucalyptus hybrids
LI Guang-you, XU Jian-min, WU Shi-jun, DU Zhi-hu, HAN Chao, WANG Wei, LU Zhao-hua, LI Bao-qi
(Research Institute of Tropical Forestry, CAF, Guangzhou 510520,Guangdong,China)
Abstract: The total DNA of Eucalyptus urophylla and the hybrids were analyzed using SSR markers. The total DNA was extracted by
means of improved CTAB isolation method, the extraction methods and PCR amplifi cation conditions were optimized. 17 primers were
screened from 100 primers which were from a published-article existing in Eucalyptus urophylla, which had high polymorphism and
stability. The results provide references for genetic diversity research of Eucalyptus urophylla families and single tree using SSR marker.
Key words: Eucalyptus urophylla; DNA extraction; SSR primer screening
多态性高；重复性好；技术难度低；引物序列公
开发表等特点 [2]，而在动植物的遗传分析 [3-5]中
得到了广泛应用，随后林学专家开展了该标记在
林木研究中的利用 [6-7]。SSR的共显性标记适用于
QTL定位研究，便于对有关QTL的遗传动态跟踪，
增强对数量性状的遗传操纵能力，提高育种中数
量性状位点判读的准确性以加速利用。在育种工
作中，SSR技术与现有育种程序相结合，为尾叶
桉的分子辅助选择和遗传改良提供了科学依据，
促进目的基因的定位和选择、为其有效利用提供
技术和材料保证，从而加快育种进程。
收稿日期：2011-09-15
基金项目：十二五“高产抗逆桉树”新品种的选育研究（2012BAD01B04-1）；广东省林业科技创新项目（2009KJCX004-02）；广
东省林业标准化（2009-BS01）；国家科技成果推广项目“桉树速生丰产地力维持与可持续经营技术推广示范”；国家公益行业专项
（201104003）
作者简介：李光友 (1970—)，男，重庆开县人，副研究员，博士，主要从事热带林木遗传育种研究；E-mail: rwater3000@sohu.com
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2012.02.027
李光友，等：尾叶桉杂种子代 DNA提取和 SSR引物筛选82 第 2期
表 2 尾叶桉SSR分子标记用引物序列及退火温度
Table 2 The primer sequence and annealing temperature for SSR of Eucalyptus urophylla
引物名 引物序列 /(5’ to 3’) 退火温度 /(℃ )
EMBRA8 F: CACAACTAAAAATCAAAACCC B: AAAGAGCAGATTATTACAGAAGC 56
EMBRA10 F: GTAAAGACATAGTGAAGACATTCC B: AGACAGTACGTTCTCTAGCTC 56
EMBRA13 F: ATTTCCCTAGGTTTGACATG B: TCCAACATCTTACTCAACCA 56
EMBRA15 F: TTTGTTGGATGAGGACTT B: CAACATGTTCTCCGAAAAG 56
EMBRA16 F: CAACGTTCCCCTTTCTTC B: ATGTTAGGCCAAACCCAG 56
EMBRA23 F: GGTTGTTTCATCTTTTCCATG B: AGCGAAGGCAATGTGTTT 56
EMBRA24 F: CGCTATAATTCTATGCCG B: TGAGAGAGATATTCGCGT 56
EMBRA32 F: ATCAGCCTCCACGTTCTA B: GGAGAAGGAAGGTGTATCAA 56
EMBRA44 F: GGGGTTTGTTCTGCTTAG B: CAAAAGAGTTCAGCTGTG 50
EMBRA59 F: GTTGTGCATGGGCCTCTTG B: CGACGGCCAGTGAATTGTAA 52
EMBRA70 F: GTCACTGTGTTCAAGAACGTA B: TTGTTGCTGATACCAATCC 56
EMBRA77 F: GAACACTATTTGGGAAGCA B: CTCCTCTCTCCTCTCAACTC 60
EMBRA80 F: GCTTGTCAATTGCTGATGTA B: ATGGCCTTTGTCACCTCT 56
EMBRA132 F: GAACGCTATTCCTCGGATGA B: CATGATTACGCCAGCTCG 58
EMBRA140 F: GGTTTGATAGGTGGATTGGG B: GGTTGATGACTGAGAGATGAAGG 64
EMBRA141 F: GCCGTATGCCTACTGTTA B: TACCACCATGTGCGAGT 59
EMBRA219 F: GATTCCACTGCGGCCAGACA B: CGAACGTAAGACTAGGTCCGAAGA 57
1　材料和方法
1.1　材料
实验用尾叶桉家系来自课题早期引种种子园。
具体参试种源及家系来源见表 1。不同家系随机取
样，不同个体分别登记，共 151株。每株取其幼
嫩叶片，擦拭干净低温保存。注入与未注入家系
间关系及研究方法参见文献 [8]。
1 mL CTAB液 (含 2%B-巯基乙醇 )，65 ℃水浴
45 min，需数分钟 1次震荡；离心 10 min，12 000
r·min-1；取上清于 1 mL新管中，200 μL枪头，然
后各管中加入等体积氯仿 -异戊醇液 (24∶ 1, v/v)；
离心 10 min，取上清于新管中，加入 550 μL氯
仿 -异戊醇液；离心 10分钟，再取上清于新管中，
加入 4 ℃异丙醇约 400 μL沉淀；－ 20 ℃冰箱冰冻
10 h以上；取出解冻，离心 10 min，倒上清，吸
干；加入 75%酒精 1 mL洗涤洗 3次，然后吸干；
重复本步骤；45 ℃下干燥机内干燥 5 min；加入
1×TE150 μL，离心 10 min，将上清移至新管中，
管中液体即为含有 DNA的样品；
提取后对 DNA浓度检测。每样品取 2 μL加
4 μL Loading buffer，移液枪混匀后用 1%琼脂糖
凝胶电泳。以 100 bp plus的 DNA Ladder标定，
初步判定 2 μL样中所含 DNA量，然后根据检测
浓度将提取各 DNA样稀释成相同的实验浓度，供
PCR扩增时采用。
1.2.2　引物筛选 [12]具体步骤：
(1) 以 2个母本DNA进行条件优化 (采用第 6对
引物来进行，98 bp)进行 32次初筛；(2) 在初筛获得的
优化条件，以该 2母本及其子代进行复筛，各进行多
次重复实验，选择扩增效果好的引物。最终从尾叶桉
100对 SSR引物中筛选出适合本批次样品的 17对引物
用于全部样品扩增和 SSR分析(见表 2)。
表 1 参试桉树种批原产地及家系编号
Table 1 Seeds sources of seed-lots and numbers of families
used in the trial
注入家系 未注入家系
种源
批号 原产地
纬度
/(o, ′ )
经度
/(o , ′ )
海拔
/m
182,183,
200,201 181, 199 13 010 Ulanu R. IND 8 20 S 124 27E 700
2, 4 17, 19 14 533 Flores Island IND 8 31 S 122 45 E 340
PCR过程中用于实验筛选的 100引物引自文
献 [9]，由上海生工生物技术有限公司合成，同时
实验用 Taq 酶、dNTPs、Loading buffer 及 Maker
等均购自该公司。
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取和浓度确定 [10-11]
采用改进 CTAB法提取的桉树进行 DNA提
取。取适量叶碎样于 2 mL磨样管中，加入钢珠；
在球磨仪上磨 3.5 min，24次 /秒，P1模式；加入
83第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
1.2.3　PCR 扩 增 PCR 扩 增 反 应 在 AB 2720
Thermal Cycler上完成。
对Mg2+、Taq酶、dNTPs及模板浓度条件的多
次优化和筛选，同时每次 PCR做一个负对照来检
测试剂是否污染。反应在灭菌的 0.2 mL薄壁离心
管中和 PCR扩增仪上进行。反应体系采用 10 μL
反应体系，即 10 × buf fer1.0 μL、25 mM MgCl2
0.6 μL、l0 mM dNTPs 0.30 μL、Primer 0.4 μL、
5UTaq DNA聚合酶 0.1 μL和 2.0 μL DNA模板 4
ng，最终加 ddH2O至 Total10 μL。样品 94 ℃预变
性 4 min；94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃
延伸 1 min，进行 30个循环；然后 72 ℃延伸 10
min，最后在 4 ℃条件下保存扩增样品。反应步骤：
1)tt冰浴中每反应管中加人 2.0 u1DNA模板；
2)按以上建立反应体系取反应物依次装入 1
灭菌 1.5 mL离心管中，涡旋 2~3 s；
3)取上述混合物 10.0 μL，分别加人 0.2 mL
反应管中，使每管的总反应体积为 10.0 μL；
4)将装有反应液的离心管在台式涡旋机上涡
旋 2~3 s；
5)混匀好的离心管放人台式离心机内离心5~6 s，
取出后离心管盖盖；
6)离心管置于 PCR仪上扩增，结束后，样品
管 4 ℃冰箱保存。
1.2.4　PCR产物检测　
PCR反应结束后，通过 1.2%琼脂糖凝胶电泳
进行 PCR结果检测。
1)配制足够量的电泳缓冲液 (0.5×TBE)，倒
入电泳槽中备用；现配 1.2%的琼脂糖凝胶；
2)凝胶稍凉后加入鼎国生物 GoldviewTM牌
Nucleic Acid Stain染料(5 μL/100 mL)，轻轻摇匀；
3)将制胶模具置于水平板上，调水平，两端
用封口胶封住；
4)常温下置胶于 60 ℃时，倒入模具内，约
3~5 mm厚，然后迅速在模具一端安插上梳子；
5)室温冷却待琼脂糖凝胶全部凝固，轻拔出
梳子，并移去挡板；
6) 用移液枪混匀样品，点样品于凝胶孔内 (
每孔含扩增样 2 μL和 4 μL溴酚蓝 )，样品按顺
序点入，同时点入北京鼎国生产的 DGL 2000 DNA
Marker(100~2000 bP )用于比对；
7)将有样品的一端置于电泳槽负极端，电泳
液没过琼脂糖凝胶 l mm左右，电泳电压为 105 V；
8)电泳结束后，将凝胶平铺在凝胶成像仪内，
打开紫外灯，检测扩增结果并记录。
1.2.5 银染法检测扩增结果的程序
1)对琼脂糖凝胶电泳检测能获得引物专一和
扩增清晰的样品，进行银染法检测；
2)PAGE胶的制备
玻璃板的清洗。用水洗净，垂直晾干；水平
放置玻璃板 +无水乙醇擦 1次；凹板玻璃用剥离
硅烷清洗、纸巾涂匀，4～ 5 min后 95%乙醇擦 2
～ 3次；平板玻璃以 2.0 mL乙醇 +50 μL亲合硅
烷涂匀，3～ 5 min后纸吸去多余亲合硅烷。后组
装玻璃面加上侧边密封条并灌胶；
灌胶。90 mL6%的变性聚丙烯酰胺中加入
TEMED30 μL、10%过硫酸铵 (0.1 g溶于水，现
配 )800 μL，在平稳玻璃面上匀速倾倒胶，同时
扶住凹板玻璃往上扣下，匀速无泡且防胶漏，待
胶流动均匀布满玻璃面后，夹好两块吻合玻璃，
在灌胶口倒插入梳子，聚合 5 min至胶凝固，后取
出梳子，再正向插入梳齿，形成各样孔间密封的
点样孔；
3)电泳
灌装 1×TBE电泳液于上下槽中，竖胶版于
电泳槽内。70 W恒功率预电泳 15 min。断电条件
下点样，点样时的 Maker为 Bio BASIC Inc.生产
的 GM345 DNA Marker (50~1000 bP 1adder-H2)。
每样孔加 6 μL预变性的 PCR扩增混合样品 (
扩增产物与指示剂按 10：3，指示剂为甲酰胺 +溴
酚兰 )，70 W恒功率电泳 90 min(50～ 300 bp扩增
产物 )，电泳结束后，用刀片分开两块玻璃板，胶
会紧贴在涂有 binding Silane 的平板玻璃上。
4)银染
过程：银染 (胶板置入染色液中，轻轻摇动并
淹没板面 10～ 15 min)-冲洗 (用 2 000 ml去离子
水冲洗胶板 3～ 5 min)-显影 (胶板快速转移到 1
600 mL显影液中并轻轻摇动，直到谱带出现 )-冲
洗 (用去离子水或自来水冲洗 3～ 4 min，洗掉其
上的碱性物质 )-干燥：室温下晾干，长期保存。
5)判读，分析
采用上海小源科技有限公司小源凝胶图像分
析系统对所拍图片判读或对银染片直接判读统计。
运用 POPGENE Version 1.32[13]软件进行不同家系 /
李光友，等：尾叶桉杂种子代 DNA提取和 SSR引物筛选84 第 2期
个体间相互关系的数据分析。
2　结果与分析
2.1 DNA提取方法的优化
DNA质量的好坏直接关系到实验的成败。
为了得到高质量的基因组 DNA，试验中对常规
CTAB法进行改良 ,增加了 2%β-巯基乙醇和
DNA材料多次异丙醇沉淀离心、乙醇洗浴和 TE
溶液溶解的步骤洗去杂质，获得了较高质量和浓
度的 DNA (图 1)，从而满足实验所需。
物中筛选合适的引物，进行扩增，在淘汰了无扩增
带和扩增后多态性不理想的引物，选留那些扩增条
带清晰而且有明显多态性片段的引物。最终获得
适用于尾叶桉杂种子代研究的 17对引物 (表 2)。
2.4 同一引物不同样品的扩增效果
对尾叶桉进行了 17对引物的扩增和效果检验，
其中 3对引物的结果见图 2。
图 1 两批次各30个个体DNA浓度检测
(M-100bp plus DNA ladder， Lane1-30：样本DNA)
Fig. 1 The total DNA was extracted from 30 samples of
Eucalyptus urophylla
从图 1 看出，第 1 批 30 个样中，除 16 号
浓度稍低外，其它样品 DNA几乎均高于标准
DNA(M)；第 2批样品中 16、22号 DNA浓度低
于标准浓度。2批次结果表明 16号样品需要重新
提取 DNA。
2.2　扩增条件的优化
通过正交设计和重复试验，在反应体系中以
不同浓度的 MgCl2、dNTP、模板 DNA配比，并
以文献给定 46 ～ 64 ℃的退火温度处理，研究不
同因素组合对扩增产物的影响。结果表明在退火
温度给定的情况下扩增关键在于 Taq酶浓度、引
物浓度以及Mg2+浓度，这与王润辉等 [14]对松树
杂种 SSR反应条件的优化所得结论一致。
2.3　SSR引物的筛选
参考文献，获得本次实验所需的 SSR引物。
尽管在 PCR过程省去对退火温度的优化，但并非
所有现成引物均能扩增产物和产生清晰条带。另
外参试家系通过人工杂交，其子代亲缘关系较近，
因此具有不同于相同引物对天然群体的扩增效果。
因此本研究利用尾叶桉的 SSR标记，从 100对引
图 2 3对SSR引物在尾叶桉不同个体中扩增出的多态图谱
Fig. 2 SSR polymorphism in E. urophylla hybrids with
EMBRA23, EMBRA44 and EMBRA59
图 2为 3对 SSR引物对部分尾叶桉杂种个体
的 PCR扩增后经 PAGE胶电泳后的多态图谱，不
同个体间扩增出差异性条带，个体间表现出差异
和等位基因的分离，多态性明显。
3　讨 论
在现实遗传标记技术中，通过建立、筛选基
因组文库，克隆测序、引物设计等一系列实验，
获得可靠且用于生产实践的 SSR分子标记，需要
投入大量人力、物力。随着参与人员和研究方法
的增多、互联网资源共享，使更有效、更深入的
技术研究获得成效，实用性和目的性更强，实现
着微观指导宏观的现实目标。本实验利用已有文
献中的尾叶桉 SSR引物中筛选出适合尾叶桉人工
杂种使用的 17对引物，实现多态性和稳定性扩
增，达到对近亲群体的进一步研究和利用。从扩
增图谱上看，引物对部分家系材料进行了扩增，
每个样品基本上都获得清晰的扩增条带，多态位
点较多。实验过程中所选的材料包括了尾叶桉自
由或控制授粉全同胞或半同胞家系，具有一定的
代表性，建立的尾叶桉人工杂种子代 SSR扩增体
系，为进一步研究亲缘关系较近群体的遗传多样
性奠定了基础。目前国内对尾叶桉遗传多样性、
85第 32卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
从 DNA水平揭示尾叶桉遗传资源方面的研究文献
[15-16]较少。国外为保障育种项目的长期遗传增益
而进行了尾叶桉育种群体遗传多样性研究 [17-18]。
今后为保障桉树育种工作的有效和持续进行，需
要利用分子标记对天然杂交种的鉴定，繁育系统
的研究，和目的基因定位。本研究也为尾叶桉人
工杂种研究提供了 SSR分子标记引物。随着对尾
叶桉杂种进一步开发利用和研究，SSR分子标记
将应用于尾叶桉杂种子代优良无性系品种鉴定、
遗传分析、遗传图谱建立、分类研究、目的基因
应用以及种质资源鉴定等各个领域。
利用文献获得 100对尾叶桉 SSR分析的引物
中，仅 17对引物产生较好扩增效果和多态性扩增
产物，可能与入选的人工控制授粉家系各个体间
亲缘关系较近有关，今后需进一步深入研究。
参考文献：
[1] 白嘉雨 .桉树遗传育种的回顾及发展前景 [J].广西林业科
学 ,35(4):221-226.
[2] 王红梅 ,张正英 ,陈玉梁 .SSR标记技术及其在植物遗传学中
的应用 [J].西北师范大学学报 ,2003,39(1):113-116.
[3] Dib C. A comprehensive genetic map of the human genome
based on 5264 microsatellites [J].Nature, 1996, 380:152-154.
[4] Taramino G. Simple sequence repeats for germplasm analysis
and mapping in maize[J].Genome, 1996,39: 277-287.
[5] Guiford P, Prakash S, Zhu J M, et al. Microsatellites in
Malusхdomestica (apple): abundance, polymorphism and cultivar
identifi cation[J].Theor Appl Genet, 1997,94: 249-254.
[6] 徐立安 ,李新军 ,潘惠新 ,等 .用 SSR研究栲树群体遗传结
构 [J]. 植物学报 ,2001,43(4):409-412.
[7] 郑 健 ,郑勇奇 ,张川红 ,等 .花楸树天然群体的遗传多样性
研究 [J].生物多样性 ,2008,16(6):562-569.
[8] 李光友 ,徐建民 ,白嘉雨 ,等 .离子注入对桉树萌发及苗期生
长的影响 [J].中南林业科技大学学报 ,2007,27(5):44-48.
[9] Brondani R P V, Williams E R, Brondani C,et al. A microsatellite-
based consensus linkage map for species of Eucalyptus and a
novel set of 230 microsatellite markers for the genus[J]. BMC
Plant Biology, 2006, 6:20doi:10.1186/1471-2229-6-20.
[10] 郭 勇 .利用 EST-CAPS标记构建桉树遗传图谱 [D].中国林
科院硕士论文 ,2008.
[11] 李志辉 ,庞 统 ,杨模华 .桉属植物叶片 DNA抽提 [J].经济林
研究 ,2005,21(2):5-7.
[12] 王艳敏 ,魏志刚 ,杨传平 .白桦 EST-SSR信息分析与标记的
开发 [J].林业科学 ,2008,44(2):78-84.
[13] Yeh F C, Yang R C, Boyle T POPGENE. The User-Friendly
Shareware for Population Genetic Analysis[M]. Molecular
Biology and Biotechnology Centre, Universityof Alberta,
Edomonton, Canada,1997.
[14] 王润辉 , 赵奋成 . 湿地松、加勒比松及其杂交种 DNA
的提取与微卫星 PCR反应体系的优化 [J].广东林业科
技 ,2006,22(1):1-4.
[15] 甘四明 ,施季森 ,白嘉雨 ,等 . RAPD标记在桉属种间杂交一
代的分离方式研究 ,林业科学研究 , 2001,14(2):125-130.
[16] 甘四明 ,白嘉雨 ,吴坤明 ,等 .7个桉树杂交亲本 RAPD位点
多态性和杂合性的研究 [J].林业科学 , 2003,39(2):162-167.
[17] Gaioto F A, Bramucci M, Grattapaglia D. Estimation of
outcrossing rate in a breeding population of Eucalyptus urophylla
using dominant RAPD and AFLP markers [J].Theor. Appl
Genet.,1997,95:842-849.
[18] Leite S M, Bonine C A, Mori E S, et al.Genetic variability in a
breeding population of Eucalyptus urophylla[J].Silvae Genet,
2002,51: 5-6.　
[本文编校：文凤鸣 ]