全 文 ：安徽农业大学学报 , 2010, 37(4):744-747
JournalofAnhuiAgriculturalUniversity
酢浆草清除 DPPH有机自由基活性研究①
李若男
(安徽农业大学经济技术学院 ,合肥 230036)
摘　要:用二苯基苦基苯肼自由基薄层实验法(DPPH-TLC-ASSAY)和 DPPH-TiterplateAssay的方法 , 对不同环
境 、不同生长势 、不同种的酢浆草上不同部位鲜叶的甲醇提取物进行定性和定量分析。发现酢浆草鲜叶提取物的
自由基清除能力与样品浓度呈正相关关系 ,样品浓度越高 , 其自由基消除率越高;同时发现不同种的酢浆草的自由
基清除活性不同 , 其中红花酢浆草提取物的自由基清除活性较强 ,同一种酢浆草因为生长环境的不同其自由基清
除活性也不同 , 试验发现盆栽样品的活性较强。薄层图谱中还可看到同一种的 DPPH-HPTLC图谱较类似 , 而不同
种的 DPPH-HPTLC图谱有较大的差异。
关键词:酢浆草;自由基清除活性;二苯基苦基苯肼自由基(DPPH);鲜叶提取物
　　中图分类号:Q949.752.1 文献标识码:A 文章编号:1672-352X(2010)04-0744-04
FreeradicalscavengingactivitiesofextractsfromleavesoftheOxalisfamily
LIRuo-nan
(SchoolofEconomicsandTechnology, AnhuiAgriculturalUniversity, Hefei230036)
Abstract:ADPPH-microplateassayandaDPPH-titerplateassayweremadetodeterminethefreeradicals
scavengingactivitiesofmethanolextractsfromfreshleavesoftheOxalisfamily.Theresultsrevealedthataltested
plantshavediferentfreeradicalscavengingactivities.Ofaltestedplants, Oxalisrubrahasthestrongestfreeradi-
calscavengingactivities.Testsalsoshowedthatthefreeradicalscavengingactivitiesofextractsfromthetested
plantsarerelatedpositivelytotheirconcentrations, andplantsplantedingardenpothavestrongerscavengingactiv-
itiesthanthatinotherplace.DPPH-TCLassaysrevealedthatdiferentground-driveplantshavediferentchromato-
grams, andthesameplantshavethesameTCLmaps.
Keywords:Oxalis;freeradicalscavengingactivity;1 , 1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH);methanolextracts
fromfreshleaves
　　自由基又叫游离基 ,从化学结构上看是指含未
配对电子的基团 、原子或分子 。自由基是反应的中
间产物 ,它具有很强的氧化能力。自由基清除剂指
能与自由基反应并使之还原成非自由基化合物的物
质 。自由基清除剂能有效地清除体内过多的自由
基 ,从而起到防病 、治病及抗衰老保健作用 [ 1-4] 。自
由基清除剂常常也是抗氧化剂 ,由于自由基清除剂
具有广泛的生理活性 ,因而有关研究受到世界各国
的重视 。其中天然自由基清除剂是该领域研究最为
活跃的课题之一。目前已经发现的天然自由基清除
剂主要包括酶和非酶两大类 。酶类如:超氧化物歧
化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘酞过氧化物
酶(GSH-Px)等;非酶类:肽和非酶蛋白类 、生物碱及
含氮杂环类 、抗坏血酸 、生育酚 、胡萝卜素类 、多酚
类 、黄酮及类黄酮 、苷类 、苯丙素类 、萜类等 。另外 ,
还有大量有关食品 、蔬菜 、植物 、药材等粗提物的自
由基清除活性的一般比较研究 [ 2-11] 。由于世界上物
种极其丰富 ,目前天然自由基清除剂的研究还刚起
①收稿日期:2010-05-10
作者简介:李若男 ,女 , 助教。
步 ,大部分生物还没被探索 。
从文献资料上看自由基与营养的研究逐年猛
增 ,需氧生物体内活性氧的产生 、清除 、利用 、危害及
其所致生物分子损伤的修复以及 NO和它的衍生物
活性氮与其代谢和作用不仅是这门新兴学科的主要
内容而且其研究范围还扩展的其他生命科学。生物
体系中包含着大量的脂质氧化和自由基反应 ,现代
医学证明:衰老 、癌症及炎症等疾病与体内脂质过氧
化和自由基有直接的关系 。有些自由基会使体内的
脂质与蛋白质发生链式反应 ,造成相关细胞的结构
与功能的破坏。另外 ,食用油脂和油脂食品的酸败
(脂质过氧化)也是由自由基引发的 ,它不仅使油脂
本身被破坏而丧失营养 ,更重要的是其氧化产物和
中间产物会导致生物膜 、酶 、维生素 、蛋白质及活细
胞功能 ,其中的一些是公认的致癌物质。因此 ,对清
除自由基和抑制过氧化效应的研究应得到普遍关
注 。长期以来我国用于食品中抗氧化剂的有 2, 6-
二叔丁基对甲酚(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)及
叔丁基对苯二酚 (TBHQ)等 , 其多为化学合成品 。
动物实验证明它们具有一定的毒性致癌作用 [ 2-3] 。
目前在回归自然的热潮中 ,人们越来越趋向于尽可
能的使用纯天然的物质作为食用对象 ,因此价廉 、质
优 、丰富 、易得的中草药成为国内外关于清除自由基
活性成分研究的重要对象 。
酢浆草是酢浆草科 ,酢浆草属多年生常绿小草 ,
属于宿根花卉 ,茎细 ,多分枝 ,匍匐延伸 ,掌状三出复
叶 ,小叶倒心形 ,长 5 ～ 10 mm,花腋生 ,单一式少数
组成伞形花序 ,花黄色 ,长约 9 mm,蔌果近圆柱形 ,
花期 3 ～ 8月 ,喜阴 ,耐寒及耐旱 。
红花酢浆草又名多花型红花酢浆草 ,为酢浆草
科 ,酢浆草属常绿或半常绿多年生草本植物 。植株
丛生 ,高仅 20 ～ 30 cm,花瓣 5枚 ,基部连合 ,花色玫
瑰红或紫红色 、粉红色 ,数朵构成伞房花序 , 4 ～ 7月
和 9 ～ 11月有两次盛花期 ,盛夏 8月植株处于半休
眠状态 。
栽培品种 [ 15] :①大花酢浆草 (Oxalis.bowiei
Lindl.):具肥厚纺锤形根茎 ,小叶倒卵形 ,花大 ,紫
红色 , 产南非 。 ②多花酢浆草 (Oxalis.corymbosa
DC.):又名紫花酢浆草 ,全株疏生长毛 ,花多 ,花紫
红色具深色条纹 , 产美洲 。 ③山酢浆草 (Oxalis.
grifithiEdgew.):一年生草本 ,小叶倒三角形 ,叶及
叶柄具柔毛 ,玫瑰紫色 ,产我国长江流域各地。 ④黄
花酢浆草 (Oxalis.pes-capraeL.):小叶具紫色斑点 ,
花黄色 ,产非洲。 ⑤四川酢浆草 (Oxalis.tetraohyla
Cav.):小叶四枚 ,倒三角形 ,花红色 ,产墨西哥 。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　树木样品　采自安徽农业大学校园内。采
样日期为 5月中下旬 ,样品为成熟的各种情况下的
老叶和新叶。
1.1.2　化学药品　二苯基苦基苯肼自由基 、槲皮
苷 、槲皮黄素 、表没食子酸儿茶酚 、抗坏血酸 、芦丁 、
β-胡萝卜素等试剂。
1.1.3　主要仪器　高效薄层(HPTLC)铝板固定相
为 Silicagel60, F254 , Ascent酶标仪购自新西兰;
感量为 0.1 mg的电子天平购于上海分析仪器厂。
1.2　试验方法
1.2.1　样品制备　从户外 、室内采回新鲜叶后 ,立
即称取剪碎的鲜叶 0.1 g左右(精确至 0.0001 g),
按 10 μL·mg-1加入 80%甲醇 ,室温下振荡浸提 48
h, 5 000g离心 20min,取上清液稀释到相当于鲜叶
质量浓度为 5、2和 1 mg·mL-1备用。
1.2.2　自由基清除剂的测定　加不同浓度的样品
溶液 100 μL和 1 mmol·L-1 DPPH试液 100 μL于
96孔酶标板中 ,平行实验 3次。样品加入后震荡 30
s,在 37℃和 517 nm波长下测定其吸光值 (Ap);
37℃保温 5 min后再测定一次 ,共测 5次;同时测定
不加 DPPH的样品空白吸收值(Ac)和加 DPPHD但
不加样品 (以 100 μL甲醇代替样品)的吸收值
(Amax)。最后按下列公式计算:
自由基清除率 =[ 1 -(Ap-Ac)/Amax] ×
100%
然后利用浓度和自由基清除率间对应关系 ,求
出自由基清除率为 50%时样品溶液的浓度(IC50)。
IC50值越小 ,则表示该样品的自由基清除活性越高。
1.2.3　自由基清除剂组成实验　用高效薄层试验
法(DPPH-HPTLLassay)。将不同种叶提取物点样 4
μL到高效薄层层析板上 ,然后在以 CHCl3∶MeOH∶
H2O=65∶35∶15的展开剂中展开 。展开后先记下自
然光下斑点及颜色;在波长为 254 nm的紫外光下 ,
用铅笔划下荧光猝灭点(fluorescencequenching)斑
点 (以实线圈出)和荧光激发(fluorescenceexcita-
tion)斑点(以虚线圈出);然后喷 DPPH试剂 , 3 min
后用数码相机记录下图谱。显黄色处为清除自由基
成分 ,因为 DPPH为一种稳定的自由基 ,能强烈吸收
517 nm的长波(呈紫色),当自由基清除剂反应后 ,
其吸收波长蓝移(变黄色),因此通过观察薄层板上
的颜色变化而断定出提取物中自由基清除剂在薄板
上的位置 。
74537卷 4期 李若男　酢浆草清除 DPPH有机自由基活性研究
2　结果与分析
2.1　不同种自由基清除率的比较
按前述自由基清除率测试方法 ,对不同种的鲜
叶甲醇提取物的自由基清除率进行测定 ,结果见表
1(表中数值为 3次测定的平均值 )。
从表 1可看到:(1)酢浆草鲜叶提取物的自由
基清除能力与样品浓度呈十分明显的正相关 ,样品
浓度越高 ,其自由基消除率越高 ,但不同种自由基清
除率随浓度变化的幅度不同。
(2)同一种在盆栽和自然栽培条件下酢浆草鲜
叶提取物的自由基清除能力有较大的差异 ,其中红
花酢浆草和紫叶酢浆草的差异达到极显著水平 ,盆
栽和自然栽培条件下紫叶酢浆草的自由基清除能力
方差分析得出:处理 1,样本数为 4 ,均值为 7.536aA;
处理 2 ,样本数为 3,均值为 6.571bB。盆栽和自然栽
培条件下红花酢浆草的自由基清除能力方差分析得
出:处理 1,样本数为 4,均值为 6.778aA;处理 2,样本
数为 5,均值为 5.633bB。说明栽培条件对酢浆草的
自由基清除能力有较大的影响。
表 1　不同质量浓度 、不同时间和不同种鲜叶提取物的自由基清除率
Table1　Freeradicalscavengingactivitiesofextractsfromdiferentfreshleaveswithdiferentconcentrationsandtime
编号
No.
种
Namesoftheplants
自由基清除率 /% Freeradicalscavengingrate
10.0mg·mL-1
25 min
5.0mg·mL-1
25 min
2.5 mg·mL-1
25min
IC50
1 紫叶酢浆草(盆栽 良好) 65.771 55.338 16.584 6.525
4 紫叶酢浆草(室外差老叶) 57.543 51.041 14.965 7.415
5 紫叶酢浆草(室外良好老叶) 53.982 49.853 15.472 7.894
9 紫叶酢浆草(室外良好幼叶) 60.954 47.492 16.422 7.394
10 紫叶酢浆草(室外差幼叶) 62.793 46.537 16.469 7.441
13 紫叶酢浆草(盆栽 良好) 65.400 56.560 22.890 6.470
14 紫叶酢浆草(盆栽 差) 62.800 55.040 23.350 6.720
2 红花酢浆草(室外老叶差) 62.248 56.423 12.753 6.974
6 红花酢浆草(室外老叶良好) 62.780 55.040 23.348 6.716
7 红花酢浆草(室外幼叶差) 59.797 52.228 14.780 7.308
8 红花酢浆草(室外幼叶良好) 71.462 60.635 15.917 6.114
11 红花酢浆草(盆栽幼叶好) 72.983 61.928 31.543 5.554
12 红花酢浆草(盆栽差) 65.400 56.565 22.891 6.469
13 红花酢浆草(盆栽良好) 76.417 57.882 26.438 5.673
16 红花酢浆草(盆栽良好) 80.830 54.190 20.240 5.730
15 红花酢浆草(盆栽良好) 80.835 54.194 20.243 5.740
14 大花酢浆草(盆栽良好) 66.120 56.984 23.446 6.385
3 大花酢浆草(盆栽老叶) 69.036 63.621 20.313 6.031
17 大花酢浆草(盆栽 差) 67.070 63.974 15.721 6.262
　　(3)在盆栽样品中不同生长状态下不同种酢浆
草鲜叶表现有不同的自由基清除能力 ,其中供试的
紫叶酢浆草和红花酢浆草 、红花酢浆草和大花酢浆
草的自由基清除活性差异都达到极显著水平 ,但紫
叶酢浆草和大花酢浆草的自由基清除活性差异未达
到显著水平 。盆栽条件下紫叶酢浆草和红花酢浆草
的自由基清除能力方差分析得出:处理 1 ,样本数为
3,均值为 6.571aA;处理 2, 样本数为 5, 均值为
5.633bB。盆栽条件下红花酢浆草和大花酢浆草的
自由基清除能力方差分析得出:处理 1 ,样本数为 5,
均值为 5.633aA;处理 2, 样本数为 3, 均值为
6.226bB。盆栽条件下紫叶酢浆草和大花酢浆草的
自由基清除能力方差分析得出:处理 1,样本数为 3,
均值为 6.571aA;处理 2 , 样本数为 3, 均值为
6.226aA。
(4)在自然栽培条件下不同种酢浆草鲜叶的自
由基清除能力不同 ,其中供试的紫叶酢浆草 、红花酢
浆草的自由基清除活性差异都达到显著水平 ,但未
达到极显著水平。自然栽培条件下紫叶酢浆草和红
花酢浆草的自由基清除能力方差分析得出:处理 1,
样本数为 4 ,均值为 6.778aA;处理 2,样本数为 4,均
值为 7.536bA。另外 ,不同生长状况的酢浆草的自由
基清除能力也不同 ,但规律性不明显。
746 安 徽 农 业 大 学 学 报 2010年
2.2　不同种的清除自由基活性物质初步检验
采用前述的 DPPH-HPTLC法及参照有关文献
对酢浆草科中自由基清除活性成分进行初步检验 。
以 10mg·mL-1的不同种的老叶和幼叶甲醇提取液
进行 DPPH薄层试验 ,点样 4 μL,展开剂为 CHCl3:
MeOH∶H2O=65∶35∶5。未喷 DPPH试剂时在 254nm
波长下记录荧光猝灭点(fluorescencequenching)图
谱 ,并用铅笔标样(实线);在 365 nm波长下记录荧
光激发点(fluorescenceexcitation)图谱 ,并用铅笔标
样(虚线)。喷 DPPH试剂后在可见光下立即扫描 ,
图谱见图 1。
图中编号与表 1一致
Thenumberinthefigureisconsistentwiththatintable1
图 1　酢浆草鲜叶提取物 DPPH-TLC图谱
Figure1　DPPH-TLCchromatogramforextractsfromleaves
oftheOxalisfaimly
从图中可看到:(1)酢浆草的自由基清除活性
较弱 ,仅有 2、3、6、7、8、11、12、15、16有较浅的黄色
斑点。 (2)紫叶酢浆草比红花酢浆草及大花酢浆草
的自由基清除能力差 ,图中紫叶酢浆草都未能及时
显现黄色。 (3)从 Rf值来看 ,图中的黄色斑点的 Rf
值都在 0.1左右 ,说明该活性物质的极性较大 ,可能
为酚类物质 。从图中还可看到同一种的 DPPH-
HPTLC图谱较类似 ,不同种的 DPPH-HPTLC图谱有
较大的差异。
3　小结
由于红花酢浆草花叶秀美 ,园林用途很广 ,宜做
盆栽观赏 ,也可做花坛的镶边材料 ,同时全株可入
药 ,值得深入研究。总之 ,本试验仅对所采集的酢浆
草样品的清除自由基活性以及 IC50进行了测定 ,并
对其 DPPH-HPTLC图谱做了初步分析 ,有关酢浆草
科植物的成分与种及生长环境间关系仍需进一步研
究 ,以便更好地应用到园林生产中去。
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