全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOG ICA SIN ICA　35(4):322-326(2005)
收稿日期:2005-01-17;修回日期:2005-03-30
基金项目:浙江省科技厅(成果转化 )项目 (G 20030724);国家高技术研究发展计划(2003AA 2Z 2091);国家自然科学基金资助项目
(30370305)
通讯作者:周雪平 ,教授 ,博导 ,主要从事分子植物病毒学研究;Tel:0571-86971680, E-mai l:zzhou@ zju. edu. cn
第一作者:吴建祥(1968 -),男 ,浙江诸暨人 ,讲师 , 在职博士研究生 ,主要从事免疫学和分子生物学研究;T el:0571-86971677, E-m ail:
wu jx@z ju. edu. cn。
香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用
吴建祥 1 , 王贵珍 1 , 洪 健 1 , 张仲凯 2 , 周雪平 1*
(1浙江大学生物技术研究所 , 杭州 310029; 2云南省农科院生物技术研究所 , 昆明 650223)
摘要:用香石竹斑驳病毒(CarMV)免疫的 BALB /c鼠脾细胞与 Sp2 /0鼠骨髓瘤细胞融合 , 经筛选克隆 ,获得 5株能稳定传
代且分泌抗 CarMV单克隆抗体 (MAb)的杂交瘤细胞 , 并分别制备它们的单克隆抗体腹水。 5株单克隆抗体腹水间接
ELISA效价达 10- 6 , 其中 3G 1、1B9、2A 9和 2F8的抗体类型及亚类均为 IgG1, 而 2F2为 IgG3。W este rn-blo t分析表明 , 5株
单克隆抗体均与 CarMV 38 kD 的外壳蛋白亚基有特异性反应。 利用 2A9单抗建立的抗原包被的间接 ELISA (ACP-
ELISA)检测 CarMV方法 ,病叶 1∶800倍稀释 、提纯 CarMV病毒浓度为 1 ng /mL(绝对检测量为 0. 1 ng)时仍能检测到病
毒。利用 ACP-ELISA对田间香石竹样品的检测表明 , CarMV在香石竹上发病很普遍。
关键词:香石竹斑驳病毒;单克隆抗体;ACP-ELISA
Production ofmonoc lonal an tibod ies toCarnationmottle v irus and its app lication in
virus detection　WU Jian-xiang1 , WANG Gui-zhen1 , HONG Jian1 , ZHANG Zhong-kai2 , ZHOU Xue-ping1
(1 Institute of B iotechno logy, Zhe jiang Un ivers ity, H angzhou 310029, China; 2Biotechnology Research Institute, Yunnan
A cadem y ofA gricu ltura l Science, K unm ing 650223, China)
Abstract:F ive hybridom a cell lines secretingm onoclona l antibodies (MAbs) againstCarnation mo ttle virus
(CarMV)were produced by fusingm ouse m yeloma ce lls (Sp2 /0)w ith spleen cells from BALB /c m ice im-
mun ized by the CarMV particles. The five MAbs could spec ifica lly react w ith CarMV. The titres of ascitic
fluids of the fiveMAbs are 10
- 6
in indirect antigen-coa ted plate (ACP)-ELISA. Iso types and subclasses of
3G1, 1B9, 2A9 and 2F8 belong to IgG1 wh ile that of 2F2 belong to IgG3. W estern-b lo t ana lysis showed that
all the fiveMAbs can reac t specifically w ith the 38 kD coat prote in subun it ofCarMV. The subclass 2A9 was
used in ACP-ELISA for detection of CarMV. ACP-ELISA could successfu lly detect 0. 1 ng purified CarMV or
virus in p lant sap d iluted 800 fold. The presence ofCarMV in fieldD ianthus caryophy llus tissues was investi-
gatedw ith ACP-ELISA and the de tection results showed that CarMV is common in fie ld samples ofD ianthus
caryophyllus.
Keywords:Carnation mottle v irus;monoclonal antibodies;ACP-ELISA
中图分类号:S432. 41;S436. 8　　　文献标识码:A　　　文章编号:0412-0914(2005)04-0322-05
　　香石竹 ,又称康乃馨 ,是世界四大鲜切花之一 ,
也是我国主要的鲜切花 。但香石竹病毒广泛发生
于世界香石竹栽培地区 ,引起香石竹品种退化 ,长
势衰弱 ,植株畸形 ,花叶 ,花枝变小 ,花碎色 ,叶茎和
花出现枯斑 ,因而使产量和品质下降 ,降低了观赏
价值和经济价值[ 1] 。感染香石竹的病毒有 10余
DOI牶牨牥牣牨牫牴牪牰牤j牣cnki牣apps牣牪牥牥牭牣牥牬牣牥牥牱
种 ,其中香石竹斑驳病毒 (Carnation mo ttle v irus ,
CarMV)是最主要的病毒之一 [ 1] 。香石竹斑驳病
毒属番茄丛矮病毒科 (Tombusviridae),香石竹斑驳
病毒属 (Carmovirus)的典型成员 ,病毒粒子呈正二
十面体 ,直径 28 ～ 33 nm。CarMV基因组为单组分
单链正义 RNA ,含 4 003 nt,包括 4个 ORF,其中
ORF2和 ORF3与 ORF1具有共同的起始位点 ,分
别为一次通读区和双重通读区 , ORF4编码 38 kD
的外壳蛋白[ 2 ～ 5] 。 CarMV靠汁液摩擦传播 ,能侵
染香石竹 、中国石竹 、甜石竹 、苋色藜 、菠菜 、千日红
等多种植物 。 CarMV在我国上海 、北京 、昆明等香
石竹产地广泛流行 ,发病严重 [ 6] ,因而迫切需要建
立实用的检测方法 ,为该病毒病的诊断和防治 、脱
毒种苗的生产提供技术支撑。为此 ,我们制备了
CarMV的单克隆抗体 ,并利用制备的单克隆抗体
建立了 ACP-ELISA检测 CarMV的方法 。
1　材料与方法
1. 1　病毒 、培养基和抗体
香石竹斑驳病毒 (CarMV )、甘蔗花叶病毒
(SCMV)、芜菁花叶病毒 (TuMV)、番茄花叶病毒
(ToMV)、烟草花叶病毒 (TMV)、黄瓜花叶病毒
(CMV)、蚕豆萎蔫病毒 1(BBWV-1)、蚕豆萎蔫病
毒 2(BBWV-2)、香石竹环斑病毒 (CRSV) 、马铃
薯 X病毒 (PVX)和马铃薯 Y病毒 (PVY)均由本
实验室鉴定保存 。 RPM I-1640培养基 、HT、HAT、
抗体类型及亚类鉴定试剂盒 、碱性磷酸酶标记的羊
抗鼠 IgG均为 S igm a产品。
1. 2　病毒提纯及小鼠免疫
将 CarMV分离物接种于中国石竹 , 15 d后采
集病叶 ,并按孔宝华等[ 7]的方法提取 CarMV。病
毒提纯液经 2%磷钨酸 (pH 6. 7)染色后置 JEOL ,
JEM-1200EX电镜下观察粒子形态。参照青玲
等 [ 8]报道的免疫程序 ,用纯化的 CarMV病毒粒子
免疫 8周龄的 BALB /c小鼠 。
1. 3　细胞融合 、筛选与克隆
参照吴建祥等 [ 9]的方法将免疫小鼠的脾细胞
和鼠 Sp2 /0细胞融合。融合细胞培养 5 d后 ,用
HAT培养基再换液一次 ,第 10 d用 HT培养基换
液 ,等到融合细胞覆盖孔底 5% ～ 30%时 ,取上清
用间接 ELISA方法筛选抗体阳性孔 ,筛选时包被
抗原分别为提纯的 CarMV、CarMV感染的病汁液
(以 1∶30稀释 ),并以健康汁液作阴性对照 。选择
强阳性反应的杂交瘤细胞 ,用有限稀释法连续克隆
3次 ,最后一次克隆后检测为阳性孔的所得细胞株
即为分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。杂交瘤细
胞经扩大培养后 ,用于腹水制备和液氮保存。
1. 4　腹水制备及抗体纯化
取 8周龄左右 BALB /c小鼠 ,腹腔注射 0. 3 ～
0. 5mL降植烷 (S igm a), 7 ～ 10 d后腹腔注入 5×
10
5 ～ 10×105个杂交瘤细胞 ,注射后 7 ～ 10 d可见
小鼠腹部明显膨大 ,用针头刺入小鼠腹部收集腹
水 , 3 000 r /m in离心 3m in,收集上清液 ,即为单克
隆抗体腹水。采用辛酸-硫酸铵方法 [ 10]纯化单抗
腹水 ,获得的纯化单抗于 - 70℃保存 。
1. 5　抗体类型及亚类鉴定和腹水效价测定
采用美国 Sigm a公司的羊抗鼠 IgG1、 IgG2a、
IgG2b、IgG3、IgA、IgM标准抗血清 ,将纯化的腹水
抗体作适当稀释后用琼脂双扩散法测定 , 24 h后观
察沉淀线 ,判断 3G1、1B9、2A9、 2F8和 2F2共 5株
单抗的抗体类型及亚类。腹水效价测定以纯病毒
抗原 1 μg /mL浓度包被 EL ISA板 ,倍比稀释的腹
水作一抗 ,碱性磷酸酶标记的羊抗鼠 IgG为二抗进
行间接 ELISA测定单抗腹水效价。
1. 6　W estern-b lo t检测
参照于翠等 [ 11]和施曼玲等 [ 12]的方法 ,用提纯
病毒进行外壳蛋白亚基的 SDS凝胶电泳 ,电泳后
将各孔道电泳胶切割 ,一部分用于考马斯亮蓝染色
观察 ,另外一部分进行电转移 ,然后将电转移所得
的硝酸纤维素膜与不同的腹水单抗 (5株单抗均作
1∶10 000倍稀释)进行Western-blot分析 。
1. 7　ACP-ELISA检测 CarMV的方法
参照 Jiang 等 [ 13] 的操作 步骤进行 ACP-
ELISA。用 0. 05m ol /L碳酸盐缓冲液 (pH 9. 6)30
倍稀释的病叶汁液 100 μL /孔加入 ELISA板 , Car-
MV提纯病毒为阳性对照 ,相应健叶为阴性对照 ,
各单抗腹水按方阵滴定法确定的工作浓度稀释
(1B9、2A9和 2F8作 1∶5 000倍稀释;3G1和 2F2
作 1∶10 000倍稀释)作为一抗 , 8 000倍稀释的 AP
标记的羊抗鼠 IgG 结合物为二抗 , 硝基磷酸盐
(PNPP)为底物 , 用 680酶联免疫检测仪 (BIO-
RAD)测 OD405值 ,以 P /N >2. 1作为阳性判断标
3234期 吴建祥 , 等:香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用
准 。用提纯的 TMV、ToMV、CMV、 SCMV、 PVY、
PVX、BBWV-1、BBWV-2、TuMV、CRSV 1 μg /mL
包被 ELISA反应板 ,以免疫抗原 CarMV为阳性对
照 ,以相应的健叶提取液作阴性对照 ,用上述 ACP-
EL ISA法 ,分别测定 5株单抗的特异性反应 。
1. 8　ACP-ELISA方法检测灵敏度测定
选择 2A9单抗测定 ACP-ELISA的检测灵敏
度 。将 CarMV病叶汁液作 1∶10 ～ 1∶10 240倍比稀
释 、提纯的 CarMV病毒 (5 mg /mL)作 1∶1 000 ～ 1
∶128 000倍比稀释后 , 分别作为抗原包被 EL ISA
板 ,并以对应稀释度的健叶汁液和健叶提纯液为阴
性对照 。以工作浓度的 2A9单抗腹水(1∶5 000倍
稀释)为一抗 ,进行 ACP-ELISA ,确定该单抗的检
测灵敏度。
1. 9　 ACP-ELISA方法田间检测 CarMV的应用
利用制备的 2A9单抗建立的 ACP-ELISA方
法 ,对田间香石竹进行检测 。在杭州市区花卉市场
和云南地区采收的呈病毒症状的香石竹病样 ,作
1∶30倍稀释 ,然后进行 ACP-ELISA 检测 ,用健株汁
液作阴性对照 ,接种 C arMV的汁液作阳性对照 。
2　结果与分析
2. 1　病毒的繁殖 、提纯及小鼠免疫
接种 CarMV的中国石竹病叶用 PEG沉淀和
蔗糖不连续密度梯度离心提取 CarMV。提纯病毒
在 JEM-1200EX电镜下可观察到球形的病毒粒子
(图 1)。利用病毒粒子对小鼠共进行 3次免疫 ,最
Fig. 1　 V irus partic les of purified CarMV
后一次免疫后的第 3 d脱颈椎处死 ,无菌操作取脾
细胞用于细胞融合。
2. 2　杂交瘤细胞的融合 、筛选 、克隆
免疫的 BALB /c小鼠脾细胞和 Sp2 /0小鼠骨
髓瘤细胞按 5 ～ 10 ∶1的比例在 50% PEG下融合 ,
用 HAT培养基筛选 , 5块 96孔细胞板的融合率为
100%。融合 10 d后换用 HT培养基 ,当每孔杂交
瘤细胞覆盖孔底 5% ～ 30%时 ,采用间接 ELISA方
法检测细胞培养上清中抗体的分泌情况 ,有 150孔
呈阳性反应 ,阳性率为 31%。选择 10个呈强阳性
反应的细胞孔 ,进行有限稀释法克隆 ,获得 3G1、
1B9、2F2、2A9和 2F8 5株能分泌抗 CarMV的特异
性抗体的杂交瘤细胞株 。经 6个月以上体外传代
和多次冻存复苏后 , 5株细胞株均能良好生长 ,并
稳定分泌抗体。
2. 3　腹水抗体制备 、抗体类型及亚类鉴定 、效价
测定
注射单克隆杂交瘤细胞的 BALB /c小鼠 ,约 7
～ 10 d后腹部膨大 ,采集腹水 ,以后每天取一次 ,每
只小鼠可取 10 ～ 20 mL腹水。用辛酸-硫酸铵方法
纯化单抗腹水后 - 70℃保存 。抗体类型及亚类鉴
定结果表明 , 3G1、1B9、2A9和 2F8 4株单抗均为
IgG1,而 2F2为 IgG3。 5株单抗腹水间接 EL ISA
效价均达 10- 6(表 1)。
2. 4　W estern-b lot分析
对提纯 CarMV 的 Western-blot分析表明 , 5
株单抗都能与 CarMV的 38 kD外壳蛋白亚基特异
性结合 (图 2),说明所制备的单抗是针对 CarMV
的 38 kD外壳蛋白亚基的特异性抗体 。
Table 1　Properties of m onoclonal an ti-
bodies against CarMV
MAbs Iso type A sc ites titre IgG yield(m g /mL)
3G1 IgG1 10- 6 10. 21
1B9 IgG1 10- 6 5. 21
2F2 IgG3 10- 6 16. 68
2A9 IgG1 10- 6 22. 36
2F8 IgG1 10- 6 15. 21
324 植物病理学报 35卷
Fig. 2　Western-b lo t analysis of CarMV coat pro tein
1:Purif ied Ca rMV;2:P lan t sap infec ted w ith CarMV;3:H ea lthy plan t sap.
2. 5　ACP-ELISA的特异性检测
ACP-ELISA测定表明 , 5株单抗仅对 CarMV有
特异性反应 ,而与 TMV、ToMV、CMV、SCMV、PVY、
PVX、BBWV-1、BBWV-2、TuMV、 CRSV等病毒均
无特异性反应 ,说明用这 5株单抗建立的 ACP-
ELISA方法对 CarMV有很好的特异性(表 2)。
2. 6　ACP-ELISA检测灵敏度的确定
选择 2A9单克隆抗体进行 ACP-ELISA方法
灵敏度检测 ,结果表明 ACP-ELISA方法对 1∶5 ～
800倍稀释的病叶汁液均呈阳性反应 ,即对检测病
叶的灵敏度可达到 1∶800;对纯病毒的检测灵敏度
可达 1 ng /mL ,每孔使用 100μL ,因此 ,病毒的绝对
检出量为 0. 1 ng。
2. 7　 ACP-ELISA的田间检测
利用制备的 2A9单抗和建立的 ACP-EL ISA
方法对杭州市区花卉市场中的香石竹和云南地区
香石竹共 86个样品进行了检测 。结果发现 , 70个
样品呈阳性反应 ,即阳性率高达 81. 4%,说明香石
竹斑驳病毒是田间香石竹流行的主要病毒种类。
3　讨论
本研究通过病毒的动物免疫 、细胞融合 、筛选 、
克隆和腹水制备 ,获得了 5株 CarMV特异性单抗 ,
并用这些单抗建立了对 CarMV有特异性反应 ,而
与 TMV、ToMV、CMV、SCMV、PVY、PVX、BBWV-1、
BBWV-2、TuMV、 CRSV等植物病毒均无反应的
ACP-ELISA检测方法。已报道的 CarMV 血清学
检测方法都是以 CarMV的多抗建立的[ 1, 14] ,但多
抗存在非特异性高 、准确性和均质性差 、产量有限
等缺陷 ,而使这些血清学方法存在不足。本研究研
制的 CarMV单克隆抗体具有特异性强 、均质性好 、
可无限量生产等优点 ,使用该单克隆抗体建立的
ACP-EL ISA血清学方法具有准确性强 、易标准化
Tab le 2　Specificities ofMAbs tested by ACP-ELISA
V irus
MAbs
3G1 1B9 2F2 2A 9 2F8
CarMV
TMV
ToMV
CMV
SCMV
PVY
PVX
BBWV-1
BBWV-2
TuMV
CRSV
H ea lth con trol
1. 310
0. 035
0. 022
0. 022
0. 021
0. 028
0. 036
0. 040
0. 031
0. 028
0. 031
0. 021
1. 323
0. 033
0. 017
0. 029
0. 023
0. 024
0. 028
0. 023
0. 025
0. 026
0. 029
0. 028
1. 454
0. 038
0. 035
0. 030
0. 031
0. 028
0. 032
0. 022
0. 024
0. 032
0. 032
0. 026
1. 370
0. 020
0. 030
0. 031
0. 025
0. 029
0. 021
0. 025
0. 028
0. 027
0. 024
0. 032
1. 231
0. 014
0. 027
0. 031
0. 031
0. 021
0. 023
0. 025
0. 026
0. 021
0. 031
0. 031
3254期 吴建祥 , 等:香石竹斑驳病毒单克隆抗体的制备及检测应用
和大规模生产等特点。此方法已有效用于 CarMV
在田间的检测 ,为该病毒的诊断和脱毒种苗的生产
打下基础。
我国香石竹的栽培发展很快 ,年产鲜切花达10
亿枝以上 ,但由于病毒病的影响 ,香石竹的产量 、质
量不断下降 ,严重影响香石竹鲜切花的生产 。我们
利用制备的单克隆抗体建立的 ACP-ELISA检测方
法 ,对杭州市区花卉市场中的香石竹和云南地区香
石竹共 86个样品进行了检测 , 81. 4%的样品检测
出 CarMV ,说明 CarMV 在田间香石竹上发生普
遍 ,有必要对我国香石竹栽培品种进行脱毒处理 ,
从而提高香石竹鲜切花的产量和质量 。
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责任编辑:于金枝
326 植物病理学报 35卷