全 文 ：扇脉杓兰 AFLP 反应体系的建立
李全健 1，2，王彩霞 2，田 敏 2，李翠新 1
（1. 西南林业大学，云南 昆明 650224；
2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）
摘 要：通过 SDS法、高盐低 pH法、常规 CTAB法、高盐 CTAB法和改良 CTAB法提取扇脉杓兰（Cypripedium japonicum Thunb．）
幼叶基因组 DNA，并对其 AFLP反应体系进行了优化。结果表明：改良 CTAB法所提取的 DNA电泳条带清晰无污染，A260和 A280
比值在 1.8～2.0，用限制性内切酶酶切后条带均一，酶切时间以 4 h为宜。最终确定 50 μL PCR 反应体系的最佳条件为：预扩增产
物稀释 20倍 4 μL，dNTP（2.5 mmol/L）3 μL，Mg2+（25 mmol/L）4 μL，Mse Ⅰ（10 μmol/L）和 EcoRⅠ（10 μmol/L）各 1.5 μL，Taq DNA
聚合酶（5 U/μL）0.3 μL。
关键词：扇脉杓兰；基因组 DNA；扩增片段长度；多态性
中图分类号：S682.31 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2012）01-0107-04
Establishment of AFLP Reaction System for Cypripedium japonicum Thunb.
LI Quan-jian1,2, WANG Cai-xia2, TIAN Min2, LI Cui-xin1
(1. Southwest Forestry University, Yunnan 650224, PRC;
2. Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Zhejiang 311400, PRC)
Abstract: Genomic DNA was extracted from young leaves of Cypripedium japonicum Thunb. by SDS method, high salt
and low pH method, routine CTAB method, CTAB with high salt method and modified CTAB method, respectively, and
an optimized AFLP reaction system was established for Cypripedium japonicum Thunb.. The results showed that DNA
electrophoresis strips, which were extracted by the modified CTAB method, were clear and without contamination, and the
proportion of A260 to A280 was from 1.8 to 2.0. After double digestion by restriction enzyme, the strips were uniform. 4 h is
appropriate for enzyme restriction. The optimum PCR reaction system (50 μL) consisted of 4 μL 20 fold dilution of the
pre-amplification product, 3 μL dNTPs (2.5 mmol/L), 4 μL Mg2+ (25 mmol/L), 1.5 μL MseⅠ(10 μmol/L), 1.5 μL EcoR
Ⅰ(10 μmol/L) and 0.3 μL Taq DNA polymerase (5 U/μL).
Key words: Cypripedium japonicum Thunb.; genomic DNA; amplified fragment length polymorphism (AFLP)
扇脉杓兰（Cypripedium japonicum Thunb．）属兰
科（Orchidaceae）杓兰属（Cypripedium Linn．），生于
海拔 1 000～2 000 m 的灌木林下、林缘、荫蔽山坡
等湿润和腐殖质丰富的土壤上[1]。目前对于扇脉杓
兰的研究主要集中在传粉生态学[2]方面，有关扇脉
杓兰分子生物学相关的研究尚未见报道。
扩增片段长度多态性 （amplified fragment
length polymorphism，AFLP）是限制性片断长度多态
性（RFLP）技术和聚合酶链式反应（PCR）技术的结
合[3]，是一种理想的分子标记技术。已经在杜仲[4]、苹
果[5]、葡萄[6]等多种植物[7-8]上建立了 AFLP体系，并
对菊花[9]、红花[10]等多种植物进行了遗传多样性研
究。尽管 AFLP 标记技术应用广泛，但是其操作复
杂，操作中的影响因素较多。建立扇脉杓兰 AFLP
体系，对进一步研究其种质资源多样性和分子标记
辅助育种有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材 料
试验材料为野生扇脉杓兰嫩叶，取材后立即放
入冰盒中带回实验室，保存在-80℃冰箱中。
1.2 方 法
SDS法[11]、高盐低 pH法[12]、常规 CTAB 法[11]、高
盐 CTAB 法（将常规 CTAB 法提取缓冲液中的 Na－
Cl 的浓度由 1.4 mol/L增至 2.0 mol/L，其它和常规
CTAB 法相同）和改良 CTAB法。
试验步骤：将材料研磨成粉末后，取约 50 mg
的冻粉于离心管中再加入 CTAB（50 mmol/L Tris-
HCl、10 mmol/L EDTA、0.7 mol/L NaCl）200 μL 和
10 μL β-巯基乙醇，充分混匀后加入 800 μL 65℃
收稿日期：2011-09-22
基金项目：浙江省科技重大攻关项目（2010C02004-2）
作者简介：李全健（1985-），男，吉林梅河口市人，硕士研究
生，研究方向为植物资源与利用。
通讯作者：李翠新
湖南农业科学 2012，（01）：107~110 Hunan Agricultural Sciences
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2012.01.044
图 1 改良 CTAB法提取的基因组 DNA琼脂糖电泳图
（M：λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；1～7：不同样品基因组 DNA）
M 1 2 3 4 5 6 7
23 000 bp
表 1 PCR反应体系中处理因素和水平
1
2
3
4
5
6
水 平 模板 DNA 稀释倍数（倍）
5
10
20
40
60
80
2.5 mmol/L dNTP（μL）
2
3
4
6
8
10
25 mmol/LMg2+（μL）
2
3
4
6
8
10
引物 10 μmol/L（μL）
0．5
1．0
1．5
2．0
4．0
6．0
5 U/μL Taq 聚合酶（μL）
0．1
0．2
0．3
0．4
0．5
0．6
预热的 CTAB和 10 μL 蛋白酶 K，颠倒数次，65℃
恒温水浴 60 min，10 min/次摇匀；取出冷却后加入
800 μL酚∶氯仿∶异戊醇（体积比为 25∶24∶1），颠倒混
匀 2 min，静置 5 min后 12 000 r/min离心 15 min；
取上清液，加等体积的氯仿∶异戊醇（体积比为 24∶
1）颠倒 2 min ，静置 5 min后 12 000 r/min 离心 15
min；取上清液，加 1/10 体积 5 mol/L 的醋酸钠和等
体积的异丙醇，沉淀 15 min。8 000 r/min 离心 10
min ，去上清；70 % 乙醇洗涤两次，风干后溶于 400
μL 去离子水；加入 10 μL RNase，37℃消化 1 h，
65℃ 水浴 20 min，稍冷却加入等体积的氯仿∶异戊
醇（24∶1），混匀后 12 000 r/min离心 15 min；取上清
液，加入 1/10 体积 5 mol/L 的醋酸钠和两倍体积 -
20℃无水乙醇，－20℃ 沉淀 20 min；8 000 r/min 离
心 10 min；70% 乙醇洗涤两次（10 min/次），风干后
加 40 μL去离子水，置－20℃冰箱保存备用。
1.3 DNA纯度及浓度检测
取 5 μL DNA样品，加 1 μL 6×Loading buffer，
在 1.0% 的琼脂糖凝胶电泳；用紫外分光光度计检
测总 DNA在 260 nm和 280 nm 处的吸光值。根据
电泳谱带和 A260/A280值判断 DNA的纯度，根据公
式：DNA浓度（μg mL-1）=A260×50 μg/mL×稀释倍数，
计算总 DNA的浓度。
1.4 限制性内切酶酶切分析
1.4.1 酶切体系 酶切反应体系为 20 μL，各组份
为：模板 DNA 1 μg，10×NEB 缓冲液 2.0 μL，EcoR
Ⅰ（10 U/L）0.5 μL，MseⅠ（10 U/L）0.5 μL，BSA 0.2
μL，加双蒸水至 20 μL。为了获得扇脉杓兰 DNA 酶
切的最佳反应时间，酶切时间分别设为 1、2、3、4、5
h。酶切消化后，65℃ 灭活 20 min。1.5%琼脂糖凝胶
电泳检测酶切效果。
1.4.2 连接体系 在 20 μL 反应体系中加入 10
μL酶切产物，T4 DNA连接酶反应缓冲液 2.0 μL，
MseⅠ接头 1.0 μL，EcoRⅠ接头 1.0 μL，T4 DNA连
接酶（ 400 U/L）1.0 μL，灭菌双蒸水 5 μL。16℃连接
反应 90 min，连接反应结束后，65℃灭活 20 min。
1.4.3 扩增体系 初始扩增体系参照相关研究论
文和常规的 PCR反应中各组分的量，确定扇脉杓
兰 AFLP初始反应体系为：反应总体积 50 μL，内含
0.25 μL Ex Taq，5.0 μL 10×Ex Taq buffer，4.0 μL
dNTP Mixture，4μL Mg2+，模板 DNA 2.5 ng，M00和
E00各 2.0 μL，加灭菌蒸馏水至 50 μL。对 AFLP反
应体系中的 5种反应成分分别进行单因素试验（见
表 1），确定合适反应条件。
预扩增程序为 95℃预变性 5 min；然后进行 30
个循环：95℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃ 延伸 60
s；循环后 72℃延伸 10 min；10℃保存。
选择性扩增程序为：94℃ 5 min；94℃变性 30
s，65℃复性 30 s，72℃延伸 70 s；65～56℃ （每个循
环降 0.7℃）退火 30 s，72℃延伸 70 s，共 13个循环；
94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 70 s，共 24
个循环；72℃延伸 10 min，10℃ 保存。
1.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 取 6 μL（含上样缓
冲液）样品，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳 2 h（80 W 恒
功率）。电泳结束后，银染、拍照，从中选择谱带清晰
和容易计数的引物作为 AFLP反应的最佳引物。
2 结果与分析
2.1 电泳检测结果
图 1 所示为改良 CTAB 法提取基因组 DNA
1% 琼脂糖凝胶电泳电泳图，DNA电泳条带清晰无
拖尾，点样孔无污染，DNA 无降解，大小在 23 000
bp左右。
2.2 紫外检测结果
第 01期湖南农业科学108
表 2 不同方法提取总 DNA结果的比较
提取方法
SDS法
高盐低 pH法
常规 CTAB法
高盐 CTAB法
改良 CTAB法
A260
0.273
0.133
0.436
1.664
0.885
A280
0.181
0.065
0.187
0.785
0.480
A260/A280
1.508
2.046
2.331
2.119
1.843
得率（ng/μL）
0.273
0.133
0.436
1.664
0.885
（M：DL2 000 DNA Marker；1～4：改良 CTAB 法提取的
不同 DNA 酶切效果）
M 1 2 3 4
图 2 酶切效果
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
M 1 2 3 4 5 6
图 3 预扩增产物稀释倍数对选择性扩增的影响
（M：DL2000 DNA Marker；1～6：预扩增产物的稀释倍数
分别为 5、10、20、40、60、80 倍）
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 M
图 4 dNTP 浓度对选择性扩增的影响
（M：DL2000 DNA Marker；1～6：dNTP用量
分别为 2、3、4、6、8、10 μL）
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
1 2 3 4 5 6 M
图 5 Mg2+浓度对选择性扩增的影响
（M：DL2000 DNA Marker；1～6：Mg2+用量分别为 2、3、4、6、8、10 μL）
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
图 6 引物用量对选择性扩增结果的影响
（M：DL2000 DNA Marker；1～6：引物用量分别为
0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 μL）
M 1 2 3 4 5 6
由表 2所示：5种提取方法在去除蛋白质、多
糖及酚类等污染物方面存在差异。改良 CTAB法得
到的 DNA A260/A280在 1.8～2.0之间，说明污染物去
除较为完全，DNA 纯度高。如果 A260/A280<1.8，说明
DNA被蛋白质或多糖污染。A260/A280>2.0，说明 RNA
未去除干净。
2.3 限制性内切酶酶切结果
AFLP 分析中基因组 DNA 常采用双酶切，通
常一个为稀有碱基切点酶，另一个为常见碱基切点
酶。根据图 2 可知，酶切产物电泳均匀，无主条带，
主要分布在 100～1 000 bp之间，说明酶切消化良
好，可以用于分子标记。
2.4 AFLP选择性扩增反应体系的优化结果
2.4.1 预扩增产物的稀释倍数对扩增结果的影响
由图 3可知，在设定的 6个稀释倍数范围内均能扩
增出清晰谱带，然而，浓度较大时（稀释 5～20倍），
小片段的谱带较清晰，当浓度较小时（稀释 40～80
倍），大片段的谱带清晰可见，而小片段的谱带变
弱。因此选定产物稀释 20倍为模板 DNA。
2.4.2 dNTP 用量对扩增的影响 由图4 可知
dNTP使用量对扩增的影响较大。当 dNTP的用量
为 3.0～4.0 μL时扩增条带均清晰稳定，扩增的产物
浓度较高；用量少于 2.0 μL时扩增条带较弱，而用
量多于 4.0 μL（4.0～10 μL）时扩增产物变化不大，
而且扩增条带减少且不清晰。说明 dNTP 浓度太低
或太高都会使扩增产物减少，影响扩增效果。因此
选择 3.0～4.0 μL为 dNTP的适宜用量。
2.4.3 M g2+用量对扩增的影响 图 5 显示不同
Mg2+使用量条件下的 PCR扩增结果。结果显示，2.0
μL的 Mg2+用量太低，影响了 DNA聚合酶的活性，
基本上没有产物或者产物的量较少；用量为 3.0～10
μL下扩增条带均清晰稳定，考虑到 Mg2+用量过大
时容易出现非特异性条带，因此，选择 3.0～4.0 μL
作为 Mg2+最优使用量。
2.4.4 引物用量对扩增的影响 引物使用量对扩
增的影响较为显著。由图 6可见，引物用量为 1.5～
第 01期 李全健等：扇脉杓兰 AFLP反应体系的建立 109
图 8 不同引物选择性扩增电泳图
（M：DL2000 DNA marker；1～50：为引物筛选电泳图）
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 131415 16 17 18 1920 21 22 23 24 252627282930 3132333435 36 373839404142 434445464748
2.0 μL时扩增谱带较为清晰，少于 1.5 μL时谱带
变弱甚至无扩增产物，而用量大于 2.0 μL（4～6 μL）
时，谱带出现特异性条带，且位点发生变异，可能是
引物浓度过高产生的错配现象。因此，选择 1.5～2.0
μL为引物的最佳使用量。
2.4.5 Taq DNA 聚合酶用量对扩增的影响 图7
表明，随着 Taq DNA聚合酶用量的增加，谱带也越
来越明亮，Taq聚合酶的用量少时（0.1 μL），扩增条
带亮度小，说明产物浓度小；但使用量在 0.2～0.6
μL的范围内谱带明亮，扩增产物浓度较高，之间亮
度在增加但差异不明显。在节省又不影响试验结果
的前提下，选取用量 0.2～0.3 μL可达到试验要求。
2.5 AFLP反应体系稳定性的鉴定
图 8为 24对引物对优化体系的验证，引物编
码记为 E11/M1，E11/M2，E11/M12 和 E12/M1，E12/
M2……E12/M12。体系各组分的最佳用量为预扩增
产物稀释 20 倍液 4.0 μL，dNTP 3.0 μL，引物 1.5
μL，Taq DNA 聚合酶 0.3 μL，Mg2+ 4.0 μL，每对引
物一个重复，以鉴定扇脉杓兰 AFLP反应体系的稳
定性。结果如图 8所示，24对引物在 2个 DNA中
均能扩增出清晰可辨的谱带，经反复试验表明，利
用优化后的反应体系能有效地对扇脉杓兰 7个不
同群体 DNA进行 AFLP扩增，而且具有较好的稳
定性和可重复性，可以推断，优化后的 AFLP反应
体系是稳定可靠的。
3 讨 论
植物组织中的多糖、酚、酯和萜等次生代谢物
质会对 DNA的提取造成较大的困难，样品不纯，会
影响后续酶解和 PCR反应，研究发现扇脉杓兰叶
片中多糖、蛋白质、酚类化合物、等次生代谢产物的
含量较高。在提取过程中加入 β-巯基乙醇，能够与
多酚物质竞争可防止叶片中的多酚物质氧化而使
DNA 呈褐色。高浓度醋酸钠的引入及相应的低温
冰冻，可以提高扇脉杓兰基因组 DNA的纯度和得
率，建议在提取扇脉杓兰次生代谢物质含量高的植
物基因组 DNA时采用。
AFLP 反应是先进行酶切消化，再对连接产物
进行选择性扩增。酶切时间过短，则消化不完全，接
头难以连接；时间过长，不仅会延长整个试验周期，
而且容易出现星号活性。酶切与连接的时间应控制
适当，以确保酶切消化完全和连接充分。预扩增产
物的浓度对选择性扩增影响很大，模板浓度过高会
引起非特异性扩增；稀释倍数过大，PCR产物过少，
影响统计分析。并且体系各组分的多少都会对选择
性扩增产生影响。只有对各因素的用量筛选后，才
能建立具有较高稳定性的 AFLP反应体系。
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（责任编辑：高国赋）
M 1 2 3 4 5 6
2 000 bp
1 000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
图 7 Taq DNA 聚合酶用量对选择性扩增的影响
（M：DL2000 DNA Marker；1～5：Taq DNA 聚合酶用量分
别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL）
第 01期湖南农业科学110