全 文 ：福建林学院学报 2001, 21 ( 4): 376～ 379
Jou rnal of Fu jian College of Fores t ry
刺桫椤 DNA的简便快速提取方法⒇
王经源 , 黄儒珠
(福建师范大学生物工程学院 , 福建 福州 350007)
摘要: 采用 SDS高盐提取介质简便快速提取刺桫椤 ( Alsophila spinulosa )叶片 DNA,整个提取过
程可在 100 min内完成 ,且对鲜叶或用硅胶快速干燥的干叶均适用 . 提取的 DNA相对分子量为
48 kb, OD260 /OD280 = 1. 84± 0. 03; DN A得 率分别为: 600～ 1 200 μg / ( g· 鲜叶 ) ,
350～ 550μg /( g· 干叶 ) ;提取的 DNA无需经 RNase消化等后处理 , 即可用于限制性内切酶酶
切和 RAPD反应 .
关键词: 刺桫椤 ; DN A提取 ; 限制性内切酶消化 ; RAPD
中图分类号: Q949. 662　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1001-389X ( 2001) 04-0376-04
A Fast and Convenient Method for Preparation of
DNA in Alsophila spinulosa
WANG Jing-yuan, HU ANG Ru-zhu
( Bioengineering College, Fujian Teach ers Univ ersi ty, Fu zhou 350007, Ch ina)
Abstract: A fast and convenient method fo r pr epa ration of DNA in fresh and dried leaves of Alsophila spinulosa w as
int roduced in this paper through which the isolating pr ocess fo r the tota l DN A in leaves only needed 100 min. The
ex trac tion medium w as mainly made up o f SDS ( sodium dodecyl sulfate) and high concentra tion salt ( NaCl) . The isolated
DN A w as 48 kb, and the OD260 /OD280 of DNA w as 1. 84± 0. 03. The production rate of these DNA w ere 600～ 1 200μg /
( g· fr esh leaves ) and 350～ 550 μg /( g· dried leaves ) respec tiv ely. These DN A w ere all suitable for digesting with
r estriction enzyme and RAPD analysis without purified with RNase.
Key words: Alsophila spinulosa; DNA prepara tion; Restric tion enzyme dig esting ; RAPD
刺桫椤 ( Alsophila spinulosa )又称桫椤、树蕨 ,系活化石植物之一 . 刺桫椤分布于我国福建、台湾、广
东、 贵州、 四川等省 , 多数天然种群规模极小 , 加上人为干扰 , 生境恶化 , 该物种已趋渐危 . 刺桫椤不
仅株形优美别致 , 极具观赏价值 , 而且对研究古气候和植物的起源、 进化及区系有重要价值 . 1984年被
列为我国第一批一级重点保护植物 [ 1] . 刺桫椤的研究工作目前主要集中在物候、生态、保护区管理及药理
学等方面 , 分子生物学方面的研究未见报道 . 探讨刺桫椤天然群体在分子水平上的遗传多样性及遗传结
构 , 需获取高质量的基因组 DNA. 因此寻找一种简便快速提取刺桫椤 DNA的方法是研究工作的重要前
提 . 目前 ,种子植物特别是主要经济作物、林木等的 DNA提取 , 已有相当成熟的方法 . 但蕨类植物因其
次生代谢物质含量高 , DN A的提取较困难 , 至今未见成功的报道 . 笔者参考前人在种子植物 DNA提取
方面的成功经验 [2, 3 ] , 经实验摸索 , 总结出了一套简便快速的刺桫椤总 DNA提取方法 . 该法对刺桫椤鲜
叶或用硅胶快速干燥的干叶的 DNA提取均适用 .
1　材料与方法
1. 1　材料
供试材料刺桫椤叶片采自福建省福州国家级森林公园和福建省福安瓜溪刺桫椤自然保护区 . 鲜叶的
采集: 分别采集未完全伸展的拳卷状嫩叶和已经完全展开的成熟叶片 , 置于自封口塑料袋中 , 排去多余
⒇基金项目: 福建省教育委员会科学基金资助项目 ( JA99143) .
第 1作者简介: 王经源 ( 1972-) , 男 , 福建福清人 , 硕士研究生 , 从事分子生物学研究 .
收稿日期: 2001-05-15; 修回日期: 2001-06-25
DOI : 10. 13324 /j . cnki . jfcf . 2001. 04. 023
空气后密封存放于阴凉处 , 带回实验室后于室温下保存 .
干叶的制备:参照谢中稳等 [ 4]的方法 ,取未完全伸展的拳卷状嫩叶置于已经装有变色硅胶的自封口塑
料袋中 , 排去多余空气后密封 , 轻轻抖动硅胶 , 使之与叶片紧密接触 . 当大多数硅胶从蓝色变为浅红紫
色时 , 及时更换新的蓝色硅胶 .
1. 2　 DNA提取及检测
( 1)取 0. 1 g鲜叶 (或 0. 05 g干叶 )于研钵中 , 加少量石英砂和 1 mLSDS高盐提取介质 [内含:
100 mmo l /L Tris( pH8. 3) , 50 mmol /L EDT A( pH8. 0) , 500 mmol /L NaCl , 1. 5% SDS, 400 mmol /Lβ -
巯基乙醇 ] , 迅速研磨成浆状 , 匀浆移至 1. 5 mL Eppendorf管中 , 分别加入 330μL 5 mol /L醋酸钾 , 混
匀 , 置 - 18℃冰箱 20 min;
( 2) 10 000 rpm离心 10 min, 上清液转入新的 Eppendo rf管中 , 加入等体积的酚∶氯仿 ( 1∶ 1) , 温
和混匀 . 10 000 rpm离心 10 min, 小心吸出上清液转到新的 Eppendo rf管中 , 加入等体积的氯仿 , 轻柔
混匀 ;
( 3) 10 000 rpm离心 10 min, 上清液转入新的 Eppendorf管中 , 加入 2倍体积的无水乙醇 , 轻轻转
动离心管 , 使液体充分混合 . 此时可见到絮状的 DNA漂浮在溶液中 , 用广口吸管将其吸出 ,置于新离心
管中 , 稍离心 , 弃去残留溶液 ;
( 4)沉淀用 70%乙醇洗涤 2次 ,然后用无水乙醇洗涤 1次 ,真空抽干 (或空气中干燥 )后加入适量 TE
溶解 , 于 4℃或 - 20℃保存待用 .
( 5)在紫外分光光度计 ( Pharmacia Biotec U / trospec 2000)上 , 测定波长 260及 280 nm处的光吸收
值 , 根据 OD260估算 DNA产率 , 根据 OD260 /OD280比值判断 DNA样品的大致纯度 . 用 0. 8%琼脂糖凝胶
电泳 , 溴乙锭染色 , 检查所得 DNA的大致分子量 .
1. 3　 DNA限制性酶切反应
上述提取的 DNA用限制性内切酶 Eco RⅠ ( 20 U /μg DN A)于 37℃消化 1 h, 70℃灭活 15 min后在
0. 8%琼脂糖凝胶上电泳 ,溴乙锭染色后在 BIO-RAD Gene Doc 1 000凝胶成像仪上检测酶切效果并拍照
记录 .
1. 4　RAPD反应
以上述提取的 DNA为模板 , 用 10个碱基长度的 RAPD引物 ( S35、 S142、 S149、 S1 405、 S1 416)在
BIO-RAD GENE CYCLER PCR仪上 , 进行 RAPD反应 . 反应体积为 20μL, 内含 10 ng基因组 DNA,
0. 3μmol /L引物 , 2 mmo l /L MgCl2 , 1U Taq DN A聚合酶及 Buf fer , 300μmol /L dN TP. 扩增程序为:
94℃预变性 200 s. 然后于 94℃变性 60 s, 37℃复性 60 s, 72℃延伸 90 s, 循环 42次 . 最后在 72℃
延伸 7 min. 扩增产物用 1. 5%琼脂糖凝胶于 3 v /cm电场中电泳 , 溴乙锭染色后在 BIO-RAD Gene Doc
1 000凝胶成像仪上检测并拍照记录 .
上述实验所用试剂及 RAPD引物、 酶均购自上海生工生物工程技术有限公司 .
2　结果与分析
2. 1　 DNA提取
按上述方法从刺桫椤鲜叶和干叶提取的 DNA得率分别为 600～ 1 200μg / ( g· 鲜叶 )和
350～ 550μg /( g· 干叶 ) , OD260 /OD280比值为 1. 84± 0. 03.
图 1为所提取的刺桫椤 DNA及其限制性酶切结果 . 图 1表明 , 在琼脂糖凝胶电泳图上几乎见不到
残留在加样孔中的粘滞性物质 ,且泳道前端的 RNA弥散带很弱 . 这说明提取所得 DNA样品几乎不含多
糖等杂质 , 且残留的 RNA较少 , 纯度较高 [5 ] .
图 1可以看出不同预处理方法的 DNA提取结果 . 分别取样品采集后 2 h、塑料袋封口室温存放 7 d、
硅胶快速干燥的嫩叶为材料提取的 DNA相对分子量基本相同 , 约为 48 kb, 且 DNA降解碎片很少 (图 1
泳道 1. 2. 3 ) , 而以成熟叶片为材料所提得的 DNA有一定程度的降解 (图 1泳道 4) , 此情况即使在研磨
时加入液氮也没有明显的改善 . 这可能与成熟叶片内源 DNase含量较高有关 . 因此取样品材料时应尽
可能采集未完全伸展的嫩叶为宜 . 在冰箱 ( - 18℃ )冻存 3 d的刺桫椤嫩叶用同样的方法提取 , 结果没有
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检测到 DNA. 这可能是材料在冻存过程中细胞内源 DNase释放 , 而使 DNA完全降解之故 . 因此用
- 18℃冻存材料提取 DNA是不适宜的 . 而室温下用自封口塑料袋保存 7 d的材料仍然能够提取获得高
质量的 DNA(图 1) . 这为野外采样和保存提供了依据 .
图 1　刺桫椤总 DNA及其限制性酶切结果　　　　　　　图 2　同一植株鲜叶和干叶总 DNA的 RAPD分析
　　　 Fig ure 1　 Total DN A of Alsophi la spinulosa and i t s
digested resul t wi th Eco RⅠ
　　　 M.λDNA( 48kb) ; 1.采后 2 h鲜叶的 DN A; 2. 采后 7 d
鲜叶的 DNA; 3.干叶的 DN A; 4. 成熟叶的 DN A; 5.
鲜叶 DN A EcoRⅠ 酶切结果 ; 6.干叶 DN A Eco RⅠ 酶切
结果
　　 Fig ure 2　 RAPD analysis of to tal DN A prepared f rom
dried and f resh leav es of identical plant
　　 M. 100bp DN A Ladder; 1. 3. 5. 7. 9.鲜叶 DN A(引物依次
为: S35、 S142、 S149、 S1405、 S1416 ): 2. 4. 6. 8. 10. 干叶
DN A(引物依次为: S35、 S142、 S149、 S1405、 S1416) ;
　　为防止 DNase对 DNA的降解作用 , 一般是在提取过程中加入液氮与组织材料一起研磨 , 然后加入
热的提取介质于 65℃保温 30～ 60 min使 DNase失活 [2～ 5 ] . 而本实验结果表明 , 刺桫椤鲜叶和干叶材料
在含 SDS的高盐提取介质中研磨 , 无需添加液氮 , 也无需水浴加热 , 同样可以达到抑制 DNase的效果 .
由于提取过程不添加液氮 , 不仅节约提取成本 ,而且大大简化提取步骤 ,使得一般需要 3～ 4 h植物 DNA
的提取流程缩短为在 100 min之内完成 , 这对大量样品的 DNA提取有很大意义 .
2. 2　 DNA限制性酶切及 RAPD分析
图 1限制性酶切结果表明 , 以鲜叶或干叶为材料提取的 DNA无需 RNase处理 , 可直接用限制性内
切酶 EcoRⅠ消化 , 且酶切效果良好 .
图 2为刺桫椤鲜叶和干叶 DNA的 RAPD分析结果 . RAPD结果表明 , 5种不同随机引物对从同一个
体的鲜叶 及干叶中提 得的 DNA进 行 RAPD扩增 , 均得到 良好的结 果 . 其 中引物 S142
( GGTGCGGGAA)、 S1416( CCCGGATGGT)扩增的结果基本相同 ,引物 S35( T TCCGAACCC)对二者的
扩增结果略有不同 , 而引物 S149( CTTCACCCGA)扩增结果 , 干叶较鲜叶总 DNA的扩增少了 730、 820
及 1 790 bp三条带 , 引物 S1405( CCCGAAGCGA)扩增结果 ,干叶较鲜叶总 DNA的扩增少了 2 030 bp一
条带 , 而多了一条 390 bp带 . 这表明从刺桫椤同一个体的鲜叶或干叶中提得的 DNA样品均可用于
RAPD分析 ,但不同引物对两者的扩增结果并不完全一致 , 这与汪小全等 [6 ]在对银杉的研究中认为干、鲜
叶样品可以混用的结论不同 . 引起这些差异的原因有待进一步探讨 .
3　小结
所建立的刺桫椤 DNA提取方法简便快速 , 不需液氮也无需水浴加热 , 从 0. 1 g鲜叶或 0. 2 g干叶中
提取 DNA量即可满足 RAPD分析的需要 . 这对于刺桫椤分子生物学其它研究如串联重复序列 ( SSR)、
扩增酶切片断长度多态性 ( AFLP)等提供了重要基础 , 同时也为其它蕨类植物提供一种可供参考的快速
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简便的 DNA提取方法 .
参 考 文 献:
[ 1 ]国务院环境保护局 , 中国科学院植物研究所 . 中国珍稀濒危保护植物名录 (第 1册 ) [ M ] . 北京: 科学出版社 , 1987.
[2 ] Dellapor ta SL, Wood J, Hicks JB. A plant DNA miniprepa ra tion: v ersionⅡ [ J] . Plant Mol Biol Rep, 1983, 4: 19-
21.
[ 3] Guillem P, Marechal-Drouard L. Iso la tion of plant DN A: A fast, inexpensiv e, and reliable method [ J] . Plant Mol Boil
Rep, 1992, 10: 61-65.
[ 4 ]谢中稳 , 葛　颂 , 洪德元 . 从精通野生稻硅胶的小量叶片中制备 DNA用于 RAPD分析和总 DN A库的建立 [ J] . 植
物学报 , 1999, 41 ( 8): 807-812.
[ 5] 李　丹 , 凌定厚 . 五种提取马尾松基因组 DNA方法的比较 [ J] . 植物学通报 , 2000, 17 ( 2): 168-173.
[ 6 ]汪小全 , 邹喻苹 , 张大明 , 等 . RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中的问题 [ J] . 植物学报 , 1996, 38 ( 12): 954-
962.
(责任编校: 卢凤美 )
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