全 文 ：C I H N ES H EO I RTC U LTU A R B ES A T RC TS
观赏竹芋 O NA 的提取与 RA PO 体系优化
姚 敏
(云南世博园艺有限公司 , 云南 昆明 6熨 2 2钓
摘 要 : 文章 用多种方法对观赏竹芋进行 DN八的提取和 RA DP 体 系优化研究 , 结果表明 CT BA 法较适合于观赏竹芋
DN八的提取 , RA DP 体 系优化还有待进一步确 定 。
关键词 : 竹芋 ; DN八提取 ; RA DP 体系
竹芋 类植物 多 达百 余 种 , 大 多 归属 于 肖竹芋 属
(aC la ht
e
a) 和竹芋属 。翻 ar n at ) , 大为多年生草本 , 叶面有
各种斑纹 、 斑条 、 斑块镶嵌等美丽的色彩 , 观赏价值较高 ,
为现今室内观叶植物之上品 , 也适合庭 园栽培 。 现在我国
海南 、 广西 、 广东等省栽培较多 。 目前对其研究报道相对
较少 , 对其分子方面的研究尚未报道 。 对其 D N A 的提取
及 R A P D 体系优化是实施分子标记 、 基因文库构建及其遗
传转化和鉴定等的基础工作 。
植物细胞不同于动物细胞 , 除了具有细胞壁外 , 还含
有大量的多糖 、 脂质 、 色素和酚类物质 , 给 D N A 的提取
和纯化带来许多困难 。 提取植物 D N A 常用的试剂主要是
C T A (B 十六烷基三甲基澳化钱 )和 S D (S 十二烷基磺酸钠 ) 。
C T A B 和 S D S 都可以破坏植物细胞膜 , 以利于细胞内容物
的释放 。 此外 , C T A B 可与核酸结合形成复合物 , 有利于
D N A 与变性蛋白及多糖分开 , S D S 可与蛋白质 、 多糖等形
成复合物 , 经离心与 D N A 分开 。 众所周知 , 不同植物材
料的细胞内容物在组成上有所不同 , 因此 , 对不同的植物
材料采取不同的 D闪A 提取方法 , 以保证提取的 D闪A 质量 。
为此本试验以竹芋的嫩叶为材料对 2 种提取方法进行 了
比较 。
R A P D (R a n d o m A n 月)l i if e d P o l y l l l O印h i e D N A ) 因其
试验方法简单 , 对 D N A 多态性检测效率高而逐渐被用于
基因的定位 、 遗传作图等方面 。 但由于其结果稳定性较差 ,
因此 , 必须对反应条件进行筛选优化 , 以提高反应结果的
稳定程度 , 最大限度地降低其随机性 。 本试验以竹芋科植
物为试验材料 , 旨在建立一个稳定的 R A D P 反应体系 , 为
后续试验结果的稳定性 、 可信性提供保证 。
1 材料与方法
1
.
1 试验材料
天 鹅绒竹芋 (aC la ht ea : e br l ne ) ; 双 线竹芋 。 翻 r an at
l
e u e o r n e u r a c 、 . F a s c i n a to r ) ; 肖 竹 芋 (aC la ht e a : e b r , n e ) ;
豹 斑 竹 芋 (aC al ht ae le oP a idr an ) ; 银 影 竹 芋 (aC al ht ae
lP
c ut ar at vc
.
A gr e n et a)
; 波 叶 竹 芋 (aC al ht ae lP c ut ar at
`
A gr 即 et a ’ ) ; 白斑 竹芋 (aC al ht ae lu b ber sl an a) ; 箭 纹
竹 芋 (etC n an ht 。 卿岁en he lm lan a) ; 银 羽 竹 芋 ( C et n a n ht e
se ot as)
; 玫瑰竹芋 (aC al ht ao lo vsP op cl a)t ; 孔雀竹芋 (ca al ht ae
作者简介 : 姚 敏 ( 19 79 一 ) , 男 , 园林工程师 ; 主要从事园林工
程工作 。
m碗 , u 月 a ) ; 黄 绿 单 体 竹 芋 (ca al ht ae zou ls a 。 ` M a iu
Que e n
’
)
; 格 叶 竹芋 护h恻 lu m c aP iat ut m ) ; 七 彩竹 芋
(aC al ht ae lP
c
ut ar at )
; 黄 斑 竹 芋 (aC al ht ae zub b e sr l an a) ;
斑马竹芋 (aC al ht ae ol ul as 。 Que 即 ) ; 美丽竹芋 (aC al ht ae
ve
l
hct
l
an a)
; 彩 虹 竹芋 (ca al ht ae or se oP cl at ) ; 灰纹竹芋
(aC al ht ae lP
c
ut ar at
`
A gr e n et a
’
)
; 紫 背 竹 芋 (ca al ht ae
nI
s
gln ls P
e et rS即 ) ; 圆叶竹芋 (aC al ht ae or ut n 哎lj 乙il a) ; 方角
竹芋 (aC al ht ae 、 护口m a at )。
1
.
2 试验方法
1
.
2
.
1 DS S 法 取新鲜嫩 叶 0 . 3 9 (干样 0 . 伪 g ) , 于液
氮中快速研磨于 1 . , 耐 离心管中 , 加人 2 0 ul s D s 高盐
缓冲提取液 (10 n 叫 T isr 一 CI p H 值 8 . 3 , 刃 田恻 E D T A
p H 值 8 . 0 , , 0 0 n叫 陇 c l , 1 . , % s D s , 4 00 n叫 琉基乙
醇 ) , 然后加人 220 讯 , M K A c , 混匀 , 置于 18 ℃ 冰箱中
2 0 m i n
; 于 10 0 00 印m 下离心 10 m i n , 将上清液转人新
管中 , 加等体积的酚 / 氯仿 (1 : l) , 混匀后于 10 0 0 印m
下离心 10 m in , 取上清液于新管中 , 加人等体积的氯仿 ,
混匀后于 10 00 印m 下离心 10 m山 , 上清液转人新管中 ,
加人 2 倍体 积 的无水 乙 醇沉淀 D N A , 出现沉淀后 于
12 0 0 印m 下离心 , m山 , 倒去上清 , 用 80 % 乙醇清洗
2 次 ; 室温干燥后溶于 40 ul 高盐 T E 缓冲液中 , 加人等
体积的氯仿 / 异戊醇 (24 : l) , 10 00 印m 下离心 , m山 ,
取上清加人等体积异丙醇待出现沉淀后于 12 0 0 r p m 下
离心 , m i n ; 倒去上清液用 80 % 乙醇清洗 2次 , 室温下干
燥后用 0 . l x T E 缓冲液溶解后 (如不能溶可于 6 , ℃ 中促其
溶解 )于 4℃或 一 20 ℃下保存备用 。
1
.
2
.
2 CT BA 法 取新鲜嫩叶 0 . 3 9 (干样 0 .仍 g ) , 放人
液氮中快速研磨于 1 . , 耐 离心管中 , 加人预热至 6 , ℃ 的
2
x
C T A B (2% C T A B
、
ZM T ir s一 H C I
、
0
.
,M E D T A
、
, M
N a C I)提取液 60 0 lu , 在 6 , ℃水浴 l , 一 2 , m山 ; 冷却后
加人 30 0 u l 氯仿 / 异戊醇 (2 4 : l )于 8 00 0 r p m 下离心
10 m i n
; 离心后取上清液加人 1l/ 0 3M N a A c 和等体积
的异丙醇沉淀 D N A , 观察出现沉淀后于 12 0 0 0 印m 下
离心 , m山 ; 离心后倒去上清液 , 用 80 % 乙醇清洗 ; 室
温干燥后溶于 40 ul 高盐 T E 缓冲液中 , 加人等体积的氯
仿 / 异戊醇 (24 : l) , 10 0 0 印m 下离心 , m山 , 取上清
加人等体积异丙醇 , 待出现沉淀后于 12 00 印m 下离心
, m山 ; 倒去上清液用 80 % 乙醇清洗 2 次 , 室温下干燥后
用 0 . 1 x T E 缓冲液溶解后 (如不能溶可于 6 , ℃ 中促其溶解 )
于 4℃或 一 20 ℃下保存备用 。
一 1 0一
中国园艺文摘 203 1年第 6期
D NA 的提取研磨须快速 , 加液氮是为了防止 D N A 降
解 。 为防止 D N a se 对 D N A 的降解作用 , 一般是在提取过
程中加人液氮与组织材料一起研磨 , 然后加人热的提取介
质于 6 j ℃保温 l j 一 20 m山 使 D N a s e 失活 。
1
.
2
.
3 ND A分子量检测 将琼脂糖与 1 “ T B (E , . 4% T ir s
碱 , 27 . , % 硼酸 , 10 n洲 E D T A )按 8 : 1 0 0 的比例置于
锥形瓶 中加热制成 0 . 80(/ W / V ) 的琼脂糖胶液 , 待冷却至
刃 一 60 ℃ 左右 , 加人澳化乙锭 ( 即 E )B 后 , 于水平槽内
插人梳子制成均匀胶片 ; 待胶片完全凝固后拔出梳子 , 将
胶片放人电泳槽内 , 加人 1 “ T B E 缓冲 , 使液面没过凝胶
1 I n l l l 左右 ; 取 , 一 10 lu D N A 样品和 l lu 澳酚蓝混匀
后点样 ; 用 , V c/ m 的电压恒压电泳 , 到指示剂离开加样
孔 4 一 6 cm 时终止电泳 ; 将凝胶移出置于紫外成像系统
的紫外透射玻璃板上检测或照相 。
1
.
2
.
4 ND A浓度与纯度检测 取 10 ul D N A 样品于比色
皿中 , 加人 3 0 0 ul 水混匀后在分光光度计下测 O D 值 ;
当 O D 2 6。 / O D 28亡 1 . 8 一 1 . 9 时 , 表示 D N A 纯度较高 , 并
可根据 A 26 。计算 D N A 的浓度 。
计算公式 : C (n g / ul )一 A 2 6。 / 0 . 02 x 30 10 / 10
1
.
2
.
5 RA DP 扩增 ( l) 引物的准备 。 将引物离心后 , 加人
刃 ul 水混匀后取 l ul 加人 19 ul 水 , 其余的放人冰箱保存 。
此时引物的浓度为 , U恻 。 具体计算如下 :
近似分子量 一 10 x 324 . ,一 32 4 ,
质量数 一 O D 26。 “ 33一 0 . 2 “ 33一 6 . 6 u g
摩尔数 一 6 . 6 u g /犯 4 ,一 2 . 03 3 8 n m o l
2
.
0 33 8 n m o l / 4 00 lu 一 j l !恻
(2) P C R 反应体系优化 。 T ag 酶的活性及用量是关系到
扩增成功与否的关键因子 ; M g Z十 是影响扩增特异性的主要
因子之一 , 同时它对 T a g 酶的活性 、 扩增的真实性 、 引物
和模板双链杂交体的解链和退火温度都不得产生重要的影
响 ; d N T P s 的浓度对扩增产物的量存在较大影响 。 本试验
在 10 ul 反应体系中进行 , 具体如下 ( 见表 1 ) 。
表 1 PA DP 反应体系浓度梯度
浓度梯度 1 2 3 4 5 6 7 8
循环延伸 : 72 ℃ l m山 3 0 S e C
循环次数 : 39 次
最后延伸 : 72 ℃ 6 m山
(4 )琼脂糖凝胶电泳检测 。 用 0 . , x T B E 配制 1 . , %琼
脂糖凝胶 , P C R 反应结束后 , 在每个样品中加人 Z ul 澳
酚蓝 , 每个泳道点样 10 ul , 同时取 2 ul M a k er 点样 。 用
, V / c m 的电压恒压电泳 , 到澳酚蓝到达胶的末端 。 最后
在紫外凝胶成像系统上进行观察和拍照 。
2 结果与分析
2
.
1 试验结果
( 1 )D N A 提取结果 : 图 1 为 S D S 法提取的 D N A 结果 ,
其琼脂糖凝胶电泳图上可看出 D N A 产量较低 , 且有很明
显的降解现象产生 。 加样孔有大量残留的粘滞性物质 , 泳
道前端的 R N A 弥散带很强 , 表明所提 D N A 中可能含大量
多糖等物质且残留的 R N A 较多 。 图 2 、 图 3 为 C T A B 所
提取的竹芋 D N A 结果 , 其琼脂糖凝胶 电泳图上有少量残
留在加样孔中的粘滞性物质 , 泳道前端的 R N A 弥散带很
强 , 这说明提取所得 D N A 样品可能含有少量多糖等杂质 ,
但残留的 R N A 较多 , 纯度较高 。 可根据以后 的试验需要
将所提 D N A 加人 R N as e 酶溶液 , 37 ℃ 保温 l h , 便可去
除 R N A 。 如需纯度非常高 , 则须在 D N A 粗样中加人适量
的 P V (P 聚乙烯毗咯烷酮 ) 用于去除多酚类化合物以减少色
素物质 。
(2 )R A P D 扩增结果 : R A P D 反应 8 个体系 , 20 个引物
都没有得出扩增的带 。
0861归M g z + (ilt )
d N T P s (u l )
T a g E (ul )
弓【物 ( ul )
D N A 模板 ( ul )
0
.
6 0
.
8
0
.
4 0
.
6
0
.
6 1
.
0
.
:
.
:
1
.
0
0
.
8
1
.
2
1
.
0
1
.
0
.
2 1
.
4 2
.
0 1
.
2
.
0 1
.
2 0
.
6 1
.
0
.
5 1
.
8 1
.
2 5 0
.
75
.
0 1
.
0 0
.
8 1
.
0
.
0 1
.
0 0
.
5 0
.
5
注 : M g z + (2 . 5 〕比 ) d N T P s (2 . 5 〕比 ) T a g E ( I U / ul ) 引物 (5 〕比 )
(3 )P c R 反应参数 。
起始变性 : 94 ℃ 4 m i n
循环变性 : 94 ℃ 30 S ec
循环退火 : 3 , ℃ 30 S e C
退火与延伸之间的变温速率 : 0 . 4℃ / s
图 2 C TAB 法干样
一 1 1一
CI H N ES H EO I RTU CLTU A R B ES A T R CTS
表 2S DS 法
样品名称 O D/ 2 6 0 2 8 0产量 (ng /u l) 产率 (ng /g )
天鹅绒竹芋
双线竹芋
肖竹芋
豹斑竹芋
银影竹芋
波叶竹芋
白斑竹芋
箭纹竹芋
银羽竹芋
玫瑰竹芋
孔雀竹芋
黄绿单体竹芋
格叶竹芋
七彩竹芋
黄斑竹芋
斑马竹芋
美丽竹芋
彩虹竹芋
灰纹竹芋
紫背竹芋
圆叶竹芋
方角竹芋
:;;
.
:
9 46
只月
:
.
{
。
:::
9 5 3 1 6
.
67
7 7 7 66
.
67
9 3 0 00
85 2 83
.
3
7 2 0
.
9 5 415 0
图 3 CTA B法鲜样
2
.
2O A N提取结果分析
2
.
2
.
1 2种方法的 比较 2种 方法所提的 D NA产量 、 纯
度及产率分别见表 2、 表 3。 从 O D 26/ 0 28。 的检测值可以看
出 T CA B法提取的 D NA纯度较高 , 且 C T A B 法的产量较
S D S 法也要略高一些 。 两种方法提取的 D N A 琼脂糖凝胶
电泳图上 , 各提取物均呈现一条清晰条带 , 2 种方法都有
轻微降解现象 , S D S 法降解相对 C T A B 法要明显 , 但均不
会影响到以后的试验 。
2
.
2
.
2 干样与鲜样的对比 用 C T A B 法对其干样和鲜样
进行了对比试验 ( 见表 3) , 发现干样提取的 D N A 纯度和鲜
样的相差不大 , 但产量明显高于鲜样 。 且经过琼脂糖凝胶
电泳检测发现干样的带更清晰 , 没有降解现象产生 。
2
.
00
70
:
.
{:
4 8 1
.
6
34 6
.
2
2 5 5
.
9
5 4 1
.
8
5 4 1
.
8
80 2 66
.
7
5 7 7 00
4 2 6 5 0
90 3 00
90 3 00
1
.
24
1
.
90
2
.
11
84 2
.
8
1 11 3
.
7
6 02
.
0
14 0 4 6 6
.
7
18 5 6 16
.
7
10 0 3 33
.
3
2
.
00 5 7 1
.
9 95 3 16
.
7
4 06
.
3 5 67 7 2 5
月0气0只4
表 3 CT BA 法
O D : 5 0 / : 8 0 产量 (n g / ul ) 产率 (n g / g )
样品名称 鲜样 干样 鲜样 干样 鲜样 干样
天鹅绒竹芋
双线竹芋
肖竹芋
豹斑竹芋
银影竹芋
波叶竹芋
白斑竹芋
箭纹竹芋
银羽竹芋
玫瑰竹芋
孔雀竹芋
黄绿单体竹芋
格叶竹芋
七彩竹芋
黄斑竹芋
斑马竹芋
美丽竹芋
彩虹竹芋
灰纹竹芋
紫背竹芋
圆叶竹芋
方角竹芋
5 2 6
.
8
99 3
.
3
5 3 5
.
1
29 4
.
3
5 4 1
.
8
63 2
.
1
73 7
.
5
75 2
.
5
72 2
.
4
24 9
.
2
5 8 7
.
0
1 13
.
7
26 4
.
2
05 3
.
5
66 2
.
2
66 2
.
2
14 5 9
.
9
36 27
.
0
87 8 00
165 5 5 0
2 5 5 8 5 0
2 15 7 16
.
7
90 3 00
105 3 5 0
122 9 16
.
7
125 4 16
.
7
120 4 00
2 08 2 00
97 8 33
.
3
185 6 16
.
7
2 10 7 00
175 5 83
.
3
110 3 66
.
7
110 3 66
.
7
1 4 5 9 90 0
3 62 7 00 0
2041
4,JOQq只6
;
.
:{
1
.
81
1
.
7 9
2
.
2 9
2
.
0 2
2
.
10
1
.
7 6
1
.
7 1
1
.
9 4
2
.
0 0
2
.
0 0
1
.
9 1
2
.
14
1
.
97
1
.
8 3
2
.
1 8
1
.
4 0
29 64
.
9
4 5 1
.
5
85 7
.
9
9 9 3
.
3
5 5 6
.
9
10 5
.
4
2 96 4 90 0
4 5 1 5 0 0
8 5 7 90 0
99 3 30 0
5 5 6 90 0
10 5 4 0 0
20 92
.
0 2 09 2 00 0
27 84
.
3 2 7 84 30 0
1
.
9 4
2
.
0 9
1
.
88
;
.
;;
5 2 6
.
8
72 2
.
4
67 7
.
3
84 2
.
8
1 324
.
4
87 8 00
120 4 00
112 8 83
.
3
84 2 80 0
32 4 4 0 0
2
.
17 :
.
;; 39 1 . 3
4 2 1
.
4
7 6 7
.
6 65 2 16
.
7
4 2 1 4 0 0
76 7 60 0
一 1 2 一
中国园艺文摘2 0 13年第 6期
2
.
2
.
3保存时间对其质量的影响 从图 4可以看出 , 提取
的 D N A 放置 3 周以后有明显的降解现象 ( 大部分已经完全
降解 ) , 可能是由于保存不当 , 以及时间太长等多方面的因
素所置 。 因此建议提取的 D N A 不要放置太久 , 以免影响
以后的试验 。
图 4 放置 3周 以后的 ND A
2
.
3 RA 尸O 反应结果分析
经过不同体系和引物扩增后都没有扩增带出现 , 可能
是 由于酶或者 d N T sP 失活所置 , 也有可能是所提 D N A 中
还含有太多杂质 , 尤其是残留的 C T A B 络合了体系中的镁
离子以致试验不能正常进行 。
3 结论与计论
(l) 试验结果初步证实 , 对不同植物的 D N A 提取应采
用不同的方法 , C T A B 法更适合于竹芋科植物的 D N A 提取 。
(2) 采取干样提取可明显提高 D N A 的产量及质量 , 而且在
提取操作要求上相对简单 。 (3) R A P D 扩增还有待进一步改
进 。 需要确保药品的活性 , 所提 D N A 在进行扩增前需要
进一步提纯 , 尤其是要去除 C T A B 以保证镁离子在反应中
能够起到其作用 。
参考文献 :
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Y A O M in
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: V a ir o u s m e th
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o n ,
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s y s t e m o p t i m i z a t io n n e e d t o b e d e t e r m i n e d fu rt h e r
.
K e y w o r d s
:
M ar
n tac
e a e : D N A
e x t r ac t i
o n : R A P D
s y s t e m
一 1 3 一