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山竹壳中原花青素提取 分级及抗氧化活性的研究



全 文 :作者简介:于立梅(1973-), 女 , 华南理工大学轻工与食品学院博士
生。 E-mail:biyingwang2003@163.com
通讯作者:赵谋明
收稿日期:2007-04-25
第 23卷第 4期
2 0 0 7年 7月
FOOD& MACHINERY
食 品 与 机 械 Vol.23, No.4July, 2 00 7
山竹壳中原花青素提取 分级及抗氧化活性的研究
Extractionpurificationandantioxidationactivityofproanthocyaidins
frompercarpofgarciniamangostana
于立梅
YULi-mei 
赵谋明
ZHAOMou-ming 
崔 春
CUIChun 
刘晓丽
LIUXiao-li
(华南理工大学轻工与食品学院 , 广东 广州 510640)
(LightIndustryandFoodColege, SouthChinaUniversityofTechnology, Guangzhou, Guangdong510640, China)
摘要:从提取溶剂及提取条件等方面对山竹壳中原花青素提
取工艺进行优化研究。通过提取溶剂 、提取温度 、提取时间 、
料液比 、乙醇溶液酸碱度 5个单因素试验 , 采用响应面分析
法 , 分析乙醇溶液酸碱度 、浸提时间 、浸提温度和料液比之
间的交互作用以及对原花青素提取率的影响 , 建立数学模
型 , 得出最佳工艺条件为乙醇浓度的体积分数为 60%, 浸提
温度 60℃, 浸提时间 66 min, 料液比 1∶19,乙醇溶液的酸碱
度为 3.7, 原花青素提取率质量分数为 5.94%。同时采用不
同有机溶剂分级山竹壳提取液 ,测定不同溶剂相自由基的清
除率。
关键词:山竹壳;提取;原花青素 ;抗氧化性
Abstract:ExtractionofProanthocyaidinsfromGarciniamangostanaLwas
optimizedfromextractingsolventsandotherextractingcondition, Onthe
baseofthesinglefactorexperiments.Thispaperemployedresponsesur-
facemethodologytoanalysetheinteractionamongalcoholPH, extraction
time, extractiontemperatureandmaterial-solventratio, andtheirefects
onproanthocyanidinsproductivity.Mathemeticmodelwasestablished.
Theoptimalconditionswere60%(volumefraction)alcoholsolution, al-
coholsolutionpH 3.7, extractiontemperature60 ℃, extractiontime
66minandmaterial-solventratio1∶19(g/mL).Underthisconditions,
Theproanthocyanidinsproductivitywas5.94%(massfraction).Thean-
tioxidantactivitiesinvitroandcompositionsofvariousfractionsofGarcinia
mangostanaLextractwerestudied.
Keywords:GarciniamangostanaLpericarp;Extraction;Proanthocyani-
dins;Antioxidant
原花青素(procyanidins, 简称 PC)是广泛存在于植物界
的一大类多酚类化合物。这类化合物由不同数目的黄烷醇
聚合而成 , 在酸性溶液中加热均可生成花青素 , 故将此类多
酚类化合物命名为原花青素 , 由于其聚合体表现出的单宁特
性 , 也称缩合单宁 [ 1] 。 原花青素因其具有较强的抗氧化能
力 、清除自由基能力和多方面的药理活性 , 如抗癌 、抗诱变 、
抗炎症 、抗 HIV病毒等 [ 2 ~ 7] , 在临床医学 、化妆品等领域得到
广泛应用 [ 8~ 10] 。因此 , 人们对原花青素的研究也越来越重
视 , 寻找新的富含原花青素的资源和适合于工业化提取 、纯
化原花青素的方法是当前研究热点。
山竹(GarciniamangostanaL)又称山竹子 ,原名莽吉柿 、
凤果。为藤黄科藤黄属的一种种间杂交的异源多倍体果
树 [ 11] ,原产马来西亚 , 现分布于菲律宾 、泰国 、缅甸 、印度等
热带地区。 我国海南 、广西 、广东 、福建 、云南等地也有种
植 [ 12] 。山竹果实可食部分占 29% ~ 45%,果皮紫褐色 , 占单
果鲜重的 52% ~ 68%。山竹果皮切片晒干后可作药用 , 可治
疗痢疾 、慢性腹泻 、膀胱炎 [ 13, 14 ] 。果皮和果实还可治烧伤 、
烫伤 、口腔炎 、痈疮溃烂 , 具有消炎止痛的功效 [ 15~ 17] 。 山竹
作为一种具有发展潜力的热带水果 ,目前已受到多个国家的
重视。但目前山竹果壳作为一种富含原花青素的资源在国
内外均未见报道。 本研究在优化山竹壳原花青素提取物制
备条件的基础上 , 采用不同有机溶剂分级山竹壳提取物 , 并
比较不同部分的抗氧化性。
1 材料与方法
1.1 试验材料
乙醇 、甲醇 、丙酮 、香草醛 、正丁醇和盐酸等:均为国产分
析纯试剂;
对照品儿茶素:含量 98%, 购自中国药品生物制品检定
所;
山竹:购于广州市场。
1.2 试验方法
1.2.1 浸提法 称取 4 g(干基)山竹壳 ,加入一定体积的提
取溶剂 , 在一定温度 、pH值水浴一定时间 ,过滤 , 40℃真空浓
缩 , 用甲醇溶液定容至 100mL,待测。
60
1.2.2 原花青素含量测定方法 [ 18] 采用香草醛-盐酸比色
法 , 以儿茶素为标准品绘制标准曲线。儿茶素标准曲线为:
Y=0.368 2X+0.009 3
原花青素提取率(%)=(0.368 2X+0.009 3)×100/山
竹壳干基质量
式中:
X——— 吸光度。
1.2.3 原花青素最佳提取条件的确定 通过单因素试验结
果分析 , 选择提取温度 、提取时间 、料液比 、乙醇溶液 pH4个
因素 , 应用 DesignExpert6.0软件设计四因素三水平共 30个
试验点(6个中心点)的响应面分析试验 , 建立数学回归模
型 , 对工艺参数进行最佳化分析 , 同时反映不同因素间的交
互影响。采用 OriginPro7.0软件分析数据显著性。表 1为响
应面试验因素水平表 。
表 1 响应面试验因素水平表


A浸提温度
/℃
B提取时间
/min
C料液比
/(mL· g-1)
D乙醇溶液
pH
1 40 30 10 3
2 50 60 15 4
3 60 90 20 5
1.2.4 山竹壳乙醇提取物的不同溶剂分级萃取试验 称取
一定量山竹壳提取物冻干品溶入蒸馏水中 , 混合均匀转入分
液漏斗中 , 加入一定量的乙酸乙酯 ,振摇 , 静置 , 待溶液完全
分层后放出下层的水溶液 , 收集乙酸乙酯部分 , 将萃取 3次
的上层乙酸乙酯萃取液合并 , 在 40 ℃减压真空浓缩回收乙
酸乙酯 , 得到浅黄色的浓缩物为乙酸乙酯分级的部分。乙酸
乙酯萃取后剩余的水溶液继续按上述方法用正丁醇萃取 3
次 , 将萃取 3次的上层正丁醇萃取液合并 , 在 60 ℃减压真空
浓缩回收正丁醇 , 得到深红色的物质为正丁醇萃取物。正丁
醇萃取后剩余的水溶液继续直接在 50 ℃减压真空浓缩 , 得
到深红色的物质即为水相萃取物。
1.2.5 羟基自由基清除能力测定 先取 5 mM邻二氮菲溶
液 0.6 mL, 加入 pH7.4磷酸盐缓冲液 0.4 mL混匀 , 加 5 mM
硫酸亚铁溶液 0.6 mL, 15 mMEDTA溶液 0.6 mL, 蒸馏水
0.6 mL,样品 1 mL, 0.1%的双氧水 0.8 mL,混匀 , 37 ℃保温
1 h, 于 536 nm处测定吸光值。 未损伤管不加检测样品及
0.1%的双氧水 ,损伤管用水代替样品 [ 20] 。
抑制率 =(A样品 -A损伤 )/(A未损伤 -A损伤)×100%
1.2.6 超氧阴离子清除能力测定 采用 VB2-Met-NBT系
统。样品管:取 pH 5.5 的磷酸盐缓冲液 0.5 mL, 加入
5×10-5 M核黄素 0.3 mL, 2 ×10-2 M甲硫氨酸 0.25 mL,
5.1×10-4 M氮蓝四唑和 1.0 mL不同浓度的样品溶液 , 再加
去离子水定容至 5.0mL, 40W日光灯照射 20min, 于 560nm
处比色;空白管用样品溶剂代替样品溶液 , 调零管用 0.5 mL
无水乙醇 , 加 1.0mL样品溶剂 , 加去离子水定容至 5.0 mL,
40 W日光灯照射 20 min, 于 560 nm处比色 [ 21] 。
抑制率 =(A空白 -A样品 )/A空白 ×100%
1.2.7 DPPH自由基的清除试验 按文献 [ 12]方法 , 吸取
不同浓度的待测溶液 2.0 mL, 加入 0.2 mMDPPH溶液
2.0mL,摇匀 , 放置 30 min。以乙醇调零 , 测定 517 nm处的
吸光值 A样品。同时 ,测定样品溶液 2.0 mL与乙醇 2.0 mL混
合液在 517 nm处的吸光度 A对照 , 再测定 2.0 mLDPPH溶
液与 2.0mL乙醇在 517 nm处的吸光值 A空白。同一测定重复
3次 [ 21~ 23]。
抑制率 =[ 1 -(A样品 -A对照)/A空白 ] ×100%
2 结果与分析
2.1 提取剂的选择和浓度的影响
由图 1可知 , 不同的提取剂对山竹壳中原花青素生物提
取率有很大的影响。相同条件下 , 水的提取率最低 , 丙酮溶
液的浸提效果明显优于醇 , 70% 丙酮提取原花青素效果最
佳 , 低于或高于此浓度 , 原花青素提取率都降低 , 其中 100%
丙酮提取率最低。原因是原花青素含有多羟基 ,丙酮含有酮
基易于与原花青素中的羟基以氢键形式缔合 , 在水溶液中两
者的氢键缔合作用较强 , 因此含水丙酮提取原花青素比甲
醇 、乙醇强。而甲醇和乙醇水溶液的提取率相当 , 试验过程
中也发现低浓度的乙醇提取液很难过滤 , 而在分级时溶剂界
面上出现悬浮的絮状物 , 这可能是因为原花青素在植物体
内 、分子间通常与蛋白质 、多糖等通过氢键和疏水键形成稳
定的复合物。考虑到有机物残留 、成本和安全问题 , 本研究
选用乙醇 /水(V∶V)体系作为提取剂。
图 1 不同溶剂和浓度对提取率的影响
2.2 提取温度对提取率的影响
温度增加可增大可溶性成分的溶解度 、扩散系数。扩散
速度加快有利于提取率的提高 ,并且温度适当升高 , 可使原
料中的蛋白质凝固 、酶破坏而增加提取液的稳定性。但温度
过高 , 会破坏不耐热的成分 , 使有效成分失活。由图 2可知 ,
30 ~ 60 ℃范围内随着温度的提高提取率增加 , 当提取温度
达到 60℃以上时 , 继续升高温度 ,产率上升平缓。有研究报
道 , 温度超过 60 ℃长时间受热原花青素容易聚合 ,提取的杂
质含量增高 , 给后道精制工作带来困难 。故相应面分析温度
水平选用 40 ~ 60 ℃比较合适。
61
提取与活性   2007年第 4期
图 2 温度对提取率的影响
2.3 提取时间对提取率的影响
原料中的原花青素随着提取时间的延长 , 提取率也相应
地增加。由图 3可知 , 1h和 1.5h提取率相当 ,可溶出 90%
的原花青素;而后随着时间的延长 ,原花青素的提取率增加
缓慢。提取时间较短时 , 原花青素来不及溶出 , 时间过长 , 原
花青素又会因长时间受热发生结构的变化 , 杂质成分溶解也
随之增加。故时间因素选用在 30 ~ 90min之间。
图 3 提取时间对提取率的影响
2.4 料液比对提取率的影响
一般来说 , 料液比越大 , 提取效果越好 , 但由图 4可知 ,
溶剂用量达到一定程度 , 山竹壳中的原花青素已基本溶出 ,
增加溶剂的用量 , 提取率基本趋于稳定。而且过大的料液比
会造成能耗和溶剂的浪费 ,故料液比选用 1∶10 ~ 1∶20。
图 4 料液比对提取率的影响
2.5 pH值对提取率的影响
酸性介质有利于防止原花青素在提取过程中被氧化 , 在
提取过程中加入适量的乙酸主要是为了破坏蛋白质 、多糖 、
纤维素与原花青素的结合 , 提高原花青素的提取率和提取速
度。但过低 pH值又可能导致原花青素在提取过程中水
解 [ 21] 。图 5表明:酸性条件有利于原花青素的提取。故 pH
值因素的水平选定在 3 ~ 5之间。
图 5 pH对提取率的影响
2.6 二次方程数学模型的建立和最优化分析
由单因素试验结果可知 ,提取温度 、提取时间 、乙醇溶液
的酸碱度以及料液比等对山竹壳原花青素的提取影响较大 ,
使用设计软件 6.0 (DesignExpertSoftware6.0)做四因素三
水平共 30个试验点(6个中心点)的响应面分析试验。表 1
为响应面试验因素水平表 , 表 2为响应面试验的设计和结
果 , 表 3为试验的方差分析结果。
由表 3方差分析可知:提取温度 、提取时间 、料液比 、乙
醇溶液的酸碱度以及提取时间和乙醇溶液的酸碱度的二次
项对原花青素的提取在 0.000 1水平达极显著;提取温度的
二次项对原花青素的提取在 0.001水平达极显著;料液比的
二次项及提取温度和料液比的交互作用对原花青素的提取
在 0.01水平达极显著;提取时间和料液比交互作用 、提取时
间和乙醇溶液的酸碱度交互作用及料液比和乙醇溶液的酸
碱度交互作用对原花青素的提取在 0.05水平达极显著。用
该回归方程描述各因子与响应值之间的关系时 ,其应变量与
全体自变量之间的回归关系达极显著水平(P<0.01), 表明
该方程对试验拟合度好 , 可对不同提取条件下的原花青素提
取率进行预测。通过 DesignExpert软件优化功能 ,得出山竹
壳原花青素提取最佳工艺条件为:乙醇浓度为 60%,浸提温
度 60℃, 浸提时间 66 min, 料液比 1∶19 (g/mL), 乙醇溶液
的 pH3.7, 原花青素提取率质量分数为 5.94%。由于各因
素对提取液中原花青素提取率的影响不是简单的线性关系 ,
为了进一步明确各因子对响应值 Y的影响 , 通过 DesignEx-
pert软件分析对表 2中原花青素提取率进行处理 , 可以得出
四因素与原花青素提取率之间的回归方程式。
原花青素提取率 (%) = 5.48 +0.25A+ 0.47B+
0.38C-0.33D-0.23A2 -0.32B2 -0.096C2 -0.38D2 +
(6.25 ×10-3)AB + 0.058AC + (3.125 × 10-3)AD +
0.052BC+0.049AD+0.034CD
62
第 23卷第 4期 于立梅等:山竹壳中原花青素提取 分级及抗氧化活性的研究  
表 2 山竹壳原花青素提取条件响应面试验的设计和结果

号 A温度 B时间 C液料比
D乙醇溶液
pH
原花青素
提取率 /%
1 1 3 3 3 4.83
2 2 2 2 2 5.45
3 2 2 3 2 5.88
4 2 2 2 2 5.45
5 3 3 3 3 5.4
6 2 1 2 2 4.67
7 2 3 2 2 5.66
8 1 3 1 1 4.67
9 3 2 2 2 5.42
10 2 2 2 3 4.76
11 2 2 2 2 5.47
12 3 1 3 3 4.24
13 1 2 2 2 5.09
14 2 2 2 2 5.57
15 2 2 2 1 5.47
16 1 1 1 1 3.86
17 1 3 1 3 3.91
18 3 3 3 1 5.88
19 3 1 1 1 4.24
20 1 1 1 3 3.09
21 3 1 1 3 3.49
22 1 1 3 3 3.63
23 2 2 2 2 5.47
24 1 1 3 1 4.34
25 3 3 1 3 4.4
26 2 2 2 2 5.4
27 3 1 3 1 4.99
28 2 2 1 2 4.9
29 1 3 3 1 5.2
30 3 3 1 1 4.98
2.7 溶剂萃取物对羟自由基清除作用的量效关系
由图 6可知 , 3种不同极性溶剂相对自由基的清除效果
不同 , 在浓度较低时(0.01 ~ 0.2 mg/mL), 乙酸乙酯相对
· OH自由基的产生具有激发作用 , 当浓度超过 0.2 mg/mL,
乙酸乙酯相对体系中 · OH自由基的产生开始表现出明显的
抑制作用 , 且在 0.2~ 0.4mg/mL浓度范围内 ,随着浓度的增
大 , 乙酸乙酯相对体系中· OH自由基的清除率急剧上升 ,同
时 , 在此浓度范围内有较好的线性增大关系。在 0.4 ~
0.8 mg/mL浓度范围内 ,随着浓度的增大 , 乙酸乙酯相对体系
清除率清除效果变化不大 , 当浓度超过 0.8 mg/mL后 , 乙酸
乙酯相对体系中· OH自由基的清除又开始表现出显著的增
大趋势 , 浓度为 1 mg/mL时其清除率可达 96.4%。正丁醇
清除· OH自由基的效果较好 ,且对自由基没有激发作用 , 最
高清除率达 87.1%。在相同条件下 , 水相清除· OH自由基
的效果最差。
图 6 溶剂相对羟自由基清除作用的量效关系
2.8 溶剂相对超氧阴离子清除作用的量效关系
超氧自由基是机体代谢过程中产生的 , 试验发现山竹提
取物不同溶剂相对超氧阴离子自由基生成均具有一定的抑
制生成活性 , 其清除作用的试验结果见图 7。 在样品浓度为
1 mg/mL时 , 乙酸乙酯相 、正丁醇相和水相对超氧阴离子自
由基的清除率分别为 63.1%、82.87%、94.32%,并呈现良好
的量效关系。
2.9 溶剂相对 DPPH自由基清除作用的量效关系
由图 8可知 , 不同溶剂萃取物对 DPPH自由基的清除效
果不同。在 0 ~ 1mg/mL的浓度范围内 ,乙酸乙酯相表现出
良好的清除DPPH自由基的活性 , 其清除率随着浓度的增大
而提高 , 在样品浓度为 0.7mg/mL时 ,最高清除率达 97.1%。
随着浓度的继续增加 , 乙酸乙酯相的抑制率反而下降 , 原因
63
提取与活性   2007年第 4期
可能是样品本身对吸光值有影响。从图 8还可看出在低浓
度条件下(0.01 ~ 0.4 mg/mL), 正丁醇相和水相清除 DPPH
自由基率相当 , 随着浓度的增加 , 正丁醇相清除 DPPH自由
基的效果呈现良好的量效关系 , 最高清除率达 85.7%, 水相
对体系清除率清除效果变化不大 ,浓度为 1 mg/mL时其清除
率达 63.54%。
图 7 溶剂相对超氧自由基清除作用的量效关系
图 8 溶剂萃取物对 DPPH清除作用的量效关系
3 结论
不同溶剂分级产物的抗氧化作用结果表明:在浓度较低
时(0.01~ 0.2 mg/mL), 乙酸乙酯相对· OH自由基的产生
具有激发作用 , 正丁醇清除· OH自由基的效果较好 , 最高清
除率达 87.1%。 当浓度超过 0.2 mg/mL后 , 乙酸乙酯相对
体系中· OH自由基的产生开始表现出明显的抑制作用 , 当
浓度为 1 mg/mL时其清除率可达 96.4%。在样品浓度为
1 mg/mL时 ,乙酸乙酯相 、正丁醇相和水相对超氧阴离子自由
基的清除率分别为 63.1%、 82.87%、 94.32%。 在 0 ~
1 mg/mL的浓度范围内 ,乙酸乙酯相表现出良好的清除DPPH
自由基的活性 , 其清除率随着浓度的增大而提高(在样品浓
度为 0.7 mg/mL时 , 最高清除率达 97.1%), 正丁醇相最高
清除率为 85.7%, 水相对体系清除率清除效果变化不大 , 最
大清除率为 63.54%。上面的结果表明不同溶剂萃取液的抗
氧化活性有一定的差异 , 原因可能是通过溶剂分级 , 不同极
性的物质分别溶于 4种溶剂相 , 不同溶剂中含有的活性成分
种类不同。考虑到原花青素类化合物超剂量时 , 其清除自
由基能力下降 , 毒副作用加强 , 因此对山竹壳提取物的抗氧
化功效和应用还需要更深入的研究。
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