全 文 ：第 wt卷 第 u期
u s s x年 v 月
林 业 科 学
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∂²¯1wt o‘²1u
¤µqou s s x
松材线虫µ⁄‘„ pŒ×≥u的 פ´ ¤±探针实时
荧光 °≤• 检测 3
王明旭t ou 朱水芳v 罗 宽t 周李华t 赵文军v
kt q湖南农业大学生物安全科技学院 长沙 wtstu{ ~ u1 湖南省森林病虫害防治检疫总站 长沙 wtsssz ~
v1 中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所 北京 tsssu|l
摘 要 } 以松材线虫µ⁄‘„ p Œ×≥u为靶区 o建立松材线虫的 פ´ ¤±探针实时荧光 °≤• 检测方法 ∀对松材线虫大量
⁄‘„和单条线虫的检测结果表明 o探针检测松材线虫和拟松材线虫时 o前者产生明显的荧光信号 o后者无荧光信
号 o表明探针具有高度的特异性 ~探针检测到最低模板浓度为 t ³ª#ˏpt o⁄‘„测序结果与实时荧光 °≤• 结果一致 ∀
关键词 } µ⁄‘„ p Œ×≥u ~פ´ ¤±探针 ~松材线虫 ~检测
中图分类号 }≥zyv1z 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsu p ss{u p sw
收稿日期 }ussw p ts p t{ ∀
基金项目 }国家林业局 ussv年松材线虫病工程治理实用技术短期研究项目 ∀
3 感谢硕士生易有金参加此项研究工作 ∀
tl张立海 qusss1 松材线虫µ⁄‘„的 °≤• 鉴定 q广州 }华南农业大学 o硕士论文
Στυδιεσ ον ΡεαλpΤιµε Φλυορεσχεντ ΠΧΡ Ωιτη Ταθ Μαν Προβεφορ ρ∆ΝΑp ΙΤΣu οφ
Πινε Ωοοδ Νεµατοδεk Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl
• ¤±ª ¬±ª¬∏tou «∏≥«∏¬©¤±ªv ∏²Ž∏¤±t «²∏¬«∏¤t «¤² • ±¨­∏±v
kt qΧολλεγε οφ Βιοpσαφετψ Σχιενχε ανδ Τεχηνολογψo Ηυναν Αγριχq Υνιϖq Χηανγσηα wtstu{ ~
u1 ΓενεραλΣτατιον οφ Φορεστ Πεστ Μαναγεµεντ ανδ Θυαραντινε o Ηυναν Προϖινχε Χηανγσηα wtsssz ~
v1 Ινστιτυτε οφ Ανιµαλανδ Πλαντ Θυαραντινε o ΧΑΙΘ Βειϕινγ tsssu|l
Αβστραχτ } „ µ¨¤¯ ·¬°¨ ©¯∏²µ¨¶¦¨±·°≤• k„׃ p °≤• l °¨ ·«²§º¬·«×¤´ ¤± ³µ²¥¨ ·«¤·º¤¶§¨¶¬ª±¨ §º¬·«¬±µ⁄‘„ p Œ×≥u º¤¶
¶¨·¤¥¯¬¶«¨§·² §¨·¨¦·°¬±¨ • ²²§‘¨ °¤·²§¨ o Βυρσαπηελενχηυσξψλοπηιλυσq׫¨ µ¨¶∏¯·¶²©§¨·¨¦·¬±ª°¤¶¶⁄‘„ ¤±§¶¬±ª¯¨±¨ °¤·²§¨
¶«²º¨ §·«¤·©¯∏²µ¨¶¦¨±·¶¬ª±¤¯ º¤¶§¨·¨¦·¨§©²µΒq ξψλοπηιλυ󤱧±²¶¬ª±¤¯ ©²µΒq µυχρονατυσq׫¨ …÷° ³µ²¥¨ º¤¶«¬ª«¶³¨¦¬©¬¦
©²µ°¬±¨ • ²²§‘¨ °¤·²§¨ q׫¨ ²¯º¨ ¶·¦²±¦¨±·µ¤·¬²± §¨·¨¦·¨§¥¼ פ´ ¤±³µ²¥¨ º¤¶t ³ª#ˏpt q׫¨ µ¨¶∏¯·¶²©⁄‘„ ¶¨ ∏´¨±¦¨ ¤±§
„׃ p °≤• §¨·¨¦·¬²± º¤¶¦²¬±¦¬§¨±¦¨ q׫¨ µ¨¶¨¤µ¦«³µ²√¬§¨§¤±¨ º §¨·¨¦·¬²± °¨ ·«²§©²µ°¬±¨ • ²²§‘¨ °¤·²§¨ q
Κεψ ωορδσ} µ⁄‘„ pŒ×≥u ~פ´ ¤± ³µ²¥¨ ~ Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσ~§¨·¨¦·¬²±
松材线虫病k Βυρσαπηελενχηυσ ξψλοπηιλυσl是当前严重危害和威胁我国松林安全的最主要入侵有害生物k祝
列克 oussul o世界四大林木病害之一k全国森林病虫兽害防除协会 oussul o也是世界重要检疫性有害生物 ~检
疫要求与措施的实施严重影响国际贸易 o对经济社会影响很大 ∀松材线虫 µ⁄‘„由保守的 t{≥ !x1{≥和 u{≥
基因编码区以及非编码的间隔区 Œ×≥组成 oŒ×≥高度变异 o所以作为松材线虫和拟松材线虫k Β q µυχρονατυσl
分子鉴定的理想区域 ∀近几年来 o以µ⁄‘„为基础的 °≤• p • ƒ°和 °≤• p ≥≥≤°技术k张立海等 oussu ~• ¤«²µ¬
ετ αλqot||{l检测松材线虫的方法提高了检测的准确性 o但这些方法过程繁杂 o操作步骤多 o同时需要 °≤• 后
处理 o不仅需要的仪器多 o时间长 o而且电泳时使用的溴化乙锭对人体有害 o实验过程容易受到污染和出现假
阳性结果 ∀在µ⁄‘„中 o松材线虫和拟松材线虫的 Œ×≥u种间差异最大ktz1x h ∗ t|1u h ltl ∀因此 o笔者以
µ⁄‘„ pŒ×≥u为靶区设计了 פ´ ¤±探针 o对松材线虫大量 ⁄‘„和单条松材线虫进行实时荧光 °≤• 检测技术
研究 o以期获得一种检测松材线虫的快速 !简单 !准确 !灵敏的新方法 ∀
t 材料与方法
111 材料
本试验所用的松材线虫株系采自我国松材线虫病发生区 o其中 szsv !szsw !s{st !s{su !s{sy !≤…¬!Š⁄…¬
采自广东 o„±©…¬!„…¬采自安徽 o‘sx !≤ …´¬采自江苏 o­ƒ¼采自浙江 o˜≥„…¬为我国出入境检疫检验机关截
获 ~拟松材线虫株系 ÷…° !÷tws采自湖南省张家界 ∀
本试验用 ƒ¤¶·¶·¤µ·×¤´ ⁄‘„聚合酶 !§„×° !§××° !§≤×° !§Š×° !°≤• 缓冲液 !ª≤¯ u购自 •²¦«¨ 公司 ∀
112 方法
t1u1t 线虫培养 将兰变菌k Χερατοχψστισ¶³ql移到 °⁄„培养基上 o培养 w ∗ x §当菌丝即将长满时接入分离
好的线虫 o在 ux ε 条件下培养 t周左右 o用漏斗法分离 o离心后收集线虫悬浮液贮存于 w ε 冰箱中备用 ∀
t1u1u 大量 ⁄‘„提取 参考 • ¤«²µ¬等kt||xl的方法 ∀将 uss ˏ线虫悬浮液与 uss ˏ抽提缓冲液kuss
°°²¯#pt ‘¤≤¯ ouss °°²¯#pt ×µ¬¶p ‹≤¯ otss °°²¯#pt ∞⁄ׄ ou h ≥⁄≥ ouss Λª#°pt °²µ®o³‹ {1sl混合 o用磨口
研棒研磨 oyx ε 孵育 t ∗ u «~加入苯酚Β氯仿Β异戊醇kuxΒuwΒtl o混匀 ow ε otv sssµ#°¬±pt离心 ts °¬±o回收上
相 o如此重复 v次 o加入 u倍体积的无水乙醇k p us ε 预冷l ~p us ε 放置 us °¬±后 otv sss µ#°¬±pt离心 ts
°¬±~用 zs h乙醇k p us ε 预冷l沉淀 o室温下晾干 ~加入 us ∗ xs ˏ×∞ kts °°²¯#pt ×µ¬¶p ‹≤¯ ot °°²¯#pt
∞⁄ׄ o³‹ {1sl 溶解 ⁄‘„ o置于 p us ε 冰箱保存待用 ∀
图 t …÷°探针实时荧光 °≤• 结果图
ƒ¬ªqt • ¶¨∏¯·¶²© • ׃ °≤• ª¨ ±¨ µ¤·¨§¥¼ …÷° ³µ²¥¨
t1u1v 单条线虫 ⁄‘„提取 单条线虫 ⁄‘„采取超低温极速冷冻法 o此方法是在贺水山kussul方法基础上
的改进 o即在解剖镜下 o用移液枪吸取 v ˏ含单条线虫的悬浮液至 °≤• 反应管中 o然后加入 ×∞kts °°²¯ ×µ¬¶
p ‹≤¯ ot °°²¯ ∞⁄ׄ o³‹{1sl缓冲液至总体积 tw1{ ˏ∀把 °≤• 反应管放置于 p zs ε 冰箱中冷冻 ts °¬±o取
出后在悬浮液融化前用移液枪头轻轻掏碎 o作为 °≤• 反应的 ⁄‘„模板 ∀
t1u1w פ´ ¤±探针与引物的设计与合成 从 Š¨ ±¥¤±®中调出松材线虫和拟松材线虫的 µ⁄‘„ 序列 o用
’°¬ª¤软件找出 Œ×≥u区域 o按照 פ´ ¤±探针设计原理 o用 ³µ¬°¨ µ ¬¨³µ¨¶¶软件在种间差异大的区域设计松材
线虫引物 …÷ƒ }xχ p ŠŠ≤Š„Š„ŠŠŠ≤××≤Š p vχ o…÷• }xχ p ≤Š≤≤Š×׊„„„≤„„≤„×≤„≤ p vχ和探针 …÷° }xχ p
„×׊×≤Š×Š≤Š≤ŠŠ≤ׄ„„≤≤Š× p vχ ∀引物和探针由上海博亚生物技术公司合成 o探针 xχ端标记报告荧光染
料 y p ≤¤µ¥²¬¼©¯∏²µ¨¶¦¨¬±kƒ„l ovχ端标记淬灭荧光染料 × ·¨µ¤°¨ ·«¼¦¤µ¥²¬¼µ«²§¤°¬±¨ kׄ • „l ∀
t1u1x 实时荧光 °≤• 反应体系 大量 ⁄‘„反应体系 }ts ≅ °≤• 反应缓冲液 u1x ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptlu
ˏo§‘×° ku1x °°²¯#ptlu ˏo…÷ƒ引物 kts Λ°²¯#ptl u ˏo…÷• 引物 kts Λ°²¯#ptl u ˏo…÷°探针kts
Λ°²¯#ptl t ˏoפ´ ¤±聚合酶 kx ˜#°ptl s1u ˏo模板 ⁄‘„w1s ˏo加灭菌 §§‹u ’至 ux ˏ∀单条线虫的反
应体系 }ts ≅ °≤• 反应缓冲液 u1x ˏoª≤¯ ukux °°²¯#ptlu ˏo§‘×° ku1x °°²¯#ptls1x ˏ o…÷ƒ引物 kts
Λ°²¯#ptl u ˏo…÷• 引物 kts Λ°²¯#ptl u ˏo…÷°探针kts Λ°²¯#ptl t ˏoפ´ ¤±聚合酶 kx ˜# °¯ p tl s1u
ˏo单条线虫 ×∞悬浮液 tw1{ ˏ∀
t1u1y 样品检测 将样品放入 „…Œ°•Œ≥zzss |y孔反应板上 o打开计算机 ∀点击 ≥⁄≥t1|t软件 o设置反应条
件 o第一个循环为 |x ε ts °¬±~后 ws个循环为 |x ε tx ¶oys ε t °¬±∀点击运行 o进行 °≤• 反应 ot «xw °¬±
反应结束 o保存文件 o打开软件 o分析 ∃ Ρν 值k第 ν循环时的荧光信号增加值l与循环数 ∀
t1u1z 松材线虫µ⁄‘„基因序列测定 以松材线虫µ⁄‘„为模板 o用引物 xχ p „≤≤××≤ŠŠ≤׊Š„×≤„×ׄ≤ p
vχ和 xχ p ××≤„„≤≤„„××≤≤Š„≤„„≤„ p vχ进行 °≤• 反应 o取 ws ˏ°≤• 产物交上海博亚生物技术公司纯化后 o
根据四色荧光末端终止法原理 o用 „…Œvzvs测序仪测定核苷酸序列 ∀
u 结果与分析
211 ΙΤΣ2 Ταθ Μαν探针检测松材线虫大量 ∆ΝΑ
用 …÷°探针检测 w种松材线虫株系和 t种拟
松材线虫株系 ow 种松材线虫株系表现为阳性扩
增 o≤·值为 tx1x ∗ tz1x o检测到荧光信号 ∃ Ρν 为
z sss ∗ | xss ∀而拟松材线虫和水对照未有荧光信
号 o表现为阴性k图 tl ∀说明 …÷°探针对松材线虫
的特异性 o可明显地区分松材线虫和拟松材线虫 o
对快速诊断松材线虫具有实用价值 ∀
v{ 第 u期 王明旭等 }松材线虫µ⁄‘„ p Œ×≥u的 פ´ ¤±探针实时荧光 °≤• 检测
图 u …÷°探针检测单条线虫实时荧光 °≤• 结果
ƒ¬ªqu • ¶¨∏¯·¶²©¶¬±ª¯¨±¨ °¤·²§¨ • ׃ °≤• ª¨ ±¨ µ¤·¨§¥¼ …÷° ³µ²¥¨
212 ΙΤΣ2 Ταθ Μαν探针检测单条松材线虫
用 …÷°探针检测单条松材线虫和拟松材线虫 o
v条松材线虫表现明显的阳性特征 ows个 °≤• 循环
时的荧光信号增加值最低达 v {ss o最高达 w |ss ∀
而拟松材线虫和对照没有荧光信号 o表现为明显的
阳性k图 ul ∀可见 o检测单条松材线虫时 o虽然样品
中特异性模板 ⁄‘„ 含量很低 o且有蛋白质和其他
⁄‘„存在的情况下 o…÷°探针仍然表现高度的特异
性 ∀
213 Œ×≥2 פ´ ¤±探针检测的灵敏度
将松材线虫的 ⁄‘„稀释为 ts !t ±ª#ˏpt otss !
ts !t ³ª#ˏpt otss !ts !t ©ª#ˏpt作为模板加入到引
物 …÷ƒΠ…÷• o…÷°探针的反应体系中 o其检测到的
稀释最低浓度为 t ³ª#ˏptk图 vl ∀
°≤• 循环数 °≤• ¦¼¦¯ ¶¨
图 v …÷°探针检测的灵敏度
ƒ¬ªqv ≥ ±¨¶¬·¬√¬·¼ ²© • ׃ °≤• ª¨ ±¨ µ¤·¨§¥¼ …÷° ³µ²¥¨
u1w ∆ΝΑ测序结果
以 szsv株系为代表的测序结果显示 o所克隆
的 µ⁄‘„ 序列长为 zyy ¥³k图 wl o与 Š¨ ±…¤±®中
ª¬vv|wvtuu ! ª¬vv|wvtuv ! ª¬wuw|vzt ! ª¬vyyttwt和
ª¬vzyyxxyt等松材线虫株系的同源性 tss h o表明
…÷° פ´ ¤±探针检测到的松材线虫株系的正确
性 ∀
215 ΙΤΣ2 Ταθ Μαν探针检测线虫样品
用 …÷°探针检测 tv个松材线虫株系 !t个拟
松材线虫株系和 t个空白对照 ows个循环结束时 o
tv个松材线虫株系产生强烈的荧光信号 o最低 ∃ Ρν
值为 v {ss o最高达到 ts sss o而拟松材线虫和对照
则无荧光信号 o进一步证实了 …÷°可以作为特异性
探针用于松材线虫的实时荧光 °≤• 检测 ∀
表示引物 °µ¬° µ¨ 表示探针 פ´ ¤± ³µ²¥¨
图 w 松材线虫 szsv株系µ⁄‘„序列
ƒ¬ªqw ׫¨ µ⁄‘„ ¶¨ ∏´¨ ±¦¨ ²©szsv ¶·µ¤¬± ²© Β q ξψλοπηιλυσ
v 结论与讨论
本试验利用松材线虫和拟松材线虫的µ⁄‘„ p Œ×≥u种间差异显著特性 o设计 פ´ ¤±探针 o用实时荧光
°≤• 的检测方法能准确地区别 u种线虫 o并结合简单 !快速处理单条线虫的方法 o无需进行 ⁄‘„的提取 o提
高了检测的速度 o整个过程不到 v «o适用于松材线虫的快速检测 ∀
松材线虫是一种重要的国内外检疫性有害生物 o对松科植物的致病性强 o与其相似的拟松材线虫的致病
w{ 林 业 科 学 wt卷
性弱 o在实际检测工作中容易对二者产生混淆 ∀而对松材线虫的检测正确与否是决定采取检疫监管措施的
重要依据 o因此建立快速 !简单 !准确 !灵敏的检测是及时发现 !封锁和扑灭疫情的关键 o具有重要的实践意
义 ∀目前 o松材线虫的检测方法有流胶检测法 !形态学检测法 !化学检测法和分子生物学检测法 ∀流胶检测
法主要根据松材线虫危害后松树树脂分泌停止而进行检测 o由于影响松树流胶的因素很多 o该方法对于非疫
情发生区的早期诊断有局限性 ∀从形态学上正确地鉴定松材线虫对一些非专业从事植物线虫的人员来说有
一定的困难 ∀³‹值检测法k王玉 等 ousstl !纤维素酶扩散检测法k蒋丽雅等 ot||xl和显色法k王明旭等 o
usswl等化学检测方法虽然检测的时间短 o但不稳定 o需要进一步完善 ∀ °≤• p • „°⁄k汪来发等 ot||| ~Œµ§¤±¬
ετ αλqot||xl !°≤• p • ƒ°和 °≤• p ≥≥≤°等基于常规 °≤• 的分子生物学检测技术有助于提高检测的准确性 o
但这些方法均需 °≤• 后处理 o检测的时间需要一天甚至几天才能完成 o而且在后处理过程中常因出现污染
而影响检测结果的准确性和可靠性 ∀实时 °≤• 技术在同一密闭试管中 o实现 °≤• 扩增与靶核苷酸探针杂交
同时进行 o与传统的 °≤• 相比 o其污染可能是最低的 o检测需要的时间更短 o灵敏度高k朱水芳 oussvl ∀用实
时荧光 °≤• 方法检测松材线虫 o符合有害生物检疫检验工作中所要求的简单 !快速 !准确 !灵敏的标准 o在实
践中具有重要的推广应用价值 ∀
参 考 文 献
贺水山 o闻伟刚 o杨兰英 o等 qussu1 松材线虫 °≤• 快速检测方法研究 q植物检疫 otykyl }vut p vuw
蒋丽雅 o王晓芸 qt||x1 松材线虫虫体提取液和分泌液中纤维素酶的定性检测 q见 }杨宝君 q中国松材线虫病的流行与治理 q北京 }中国林业出
版社 oys p yt
王明旭 o张志飞 o罗 宽 o等 qussw1 松材线虫快速检测技术方法比较研究 q湖南农业大学学报 ovskvl }uv| p uwu
王玉 o李海燕 qusst1 几种松树松材线虫病木和健康木 ³‹值差异的研究 q植物病理学报 ovtkwl }vwu p vw{
汪来发 o王 杨 o杨宝君 qt|||1 运用 • „°⁄研究松材线虫与拟松材线虫的亲缘关系 q云南农业大学学报 qtwk增刊l }tt|
张立海 o廖金铃 o冯志新 qusst q松材线虫µ⁄‘„的测序和 °≤• p ≥≥≤°分析 q植物病理学报 ovuktl }{w p {|
朱水芳 qussv1实时荧光聚合酶链反应k°≤• l检测技术 q北京 }中国计量出版社
祝列克 qussu q要重视和防范外来有害生物的入侵危害 q中国森林病虫 outkyl }vy p v|
全国森林病虫兽害防除协会 qussu q森林 ρ ⊥ β κ ∃森林防疫研究 xs年成果 Η今後 Ν展望 q东京 }松尾印刷株式会社 ouwv
…µ¤¤¶¦«‹ o…∏µª¨µ  • o °¤¶·µ¬® Ž‹ qt||x1 ⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²©·«µ¨¨ Βυρσαπηελενχηυσ ¶³¨¦¬¨¶¥¼ °¨ ¤±¶²© °„°⁄ p °≤• q ‘¤¦«µ¬¦«·¨±¥¯¤· §¨¶ ⁄¨ ∏·¶¦«¨ ±
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Œµ§¤±¬× o≤¤µ²³³² ≥ o „°¥µ²ª¬²±¬qt||x1 ²¯ ¦¨∏¯¤µ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©³¬±¨ º²²§ Βυρσαπηελενχηυ󶳨¦¬¨¶q ‘¨ °¤·²¯²ª¬¤  §¨¬·¨µµ¤±¨ ¤ouvk≥∏³³¯ ql }|| p tsy
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ƒ∏±§¤° „³³¯ ‘¨ °¤·²¯ out kyl }yxx p yyy
x{ 第 u期 王明旭等 }松材线虫µ⁄‘„ p Œ×≥u的 פ´ ¤±探针实时荧光 °≤• 检测