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苦荞叶黄酮的提取及精制



全 文 :※工艺技术 食品科学 2008, Vol.29, No.09 181
苦荞叶黄酮的提取及精制
白宝兰 1,曹柏营 1,郑鸿雁 2,昌友权 1 , *
(1.吉林工程技术示范学院生物与食品工程学院,吉林 长春 130052;
2.吉林农业大学食品工程学院,吉林 长春 130118)
摘 要:对苦荞麦叶、茎、壳和籽粒粉碎物中的生物类黄酮进行了定性定量分析,选用总黄酮含量最高的苦荞叶
为原料制备苦荞黄酮精粉,确定最佳的提取工艺为:料液比为 1:20、pH8.15 的 60% 乙醇、75℃、浸提 180min。
最佳的纯化工艺为:DA-201 树脂,处理量为 5ml/g 树脂,洗脱溶剂 60%乙醇溶液,洗脱流速 2ml/min,洗脱剂用
量为 180ml。经此工艺制备的苦荞酮精粉中芦丁和总黄酮含量达到 85.34% 和 91.36%。
关键词:苦荞黄酮;提取;精制;大孔树脂
Extraction and Purification of Flavonoids from Tartary Buckwheat Leaves
BAI Bao-lan1, CAO Bai-ying1, ZHANG Hong-yan2, CHANG You-quan1,*
(1. College of Biological and Food Engineer, Jilin Teachers Institute of Engineer and Techology, Changchun 130052,
China;2. College of Food Engineer, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)
Abstract: The quantitative and qualitative analyses of flavonids in tartary buckweat leaves, stems, seeds and crushed shell were
carried out respectively. The leaves which contain the hightest flavonoids among the materials were selected to produce tartary
buckweat flavonoids powder, and extraction and purification conditions of tartary buckwheat flavonoids were optimized
respectively. The optimal extraction conditions are determined as follows: 60% ethanol at pH 8.15 as extraction solution, leaves
to the extraction solution 1:20 (g/ml), extraction temperature 75 ℃ and time 180 minutes, and the optimal purification conditions
are determined as follows: selecting DA-201 macroporous resin with the capacity of 5 ml/g for the purification, 60% ehtanol as
elution solvent with the amount of 180 ml and elution flow rate 2 ml/min. By the processes, the contents of rutin and total flavonoids
in tartary buchwheat falvonoids powder are 85.34% and 91.36%, respectively.
Key words:tartary buchwheat flavonoids;extraction;purification;macroporous resin
中图分类号:O658;O653.54 文献标识码:A 文章编号:1002-6630(2008)09-0181-05
苦荞麦[Fagopyrum tataricum(L.) Gaertn],属
双子叶蓼科(Polygonaceae)荞麦属(Fagopyrum),又名勒
靶荞麦(tartary buckwheat),是我国特有的荞麦品种,在
西南地区有大量种植,是一种药食两用植物[1]。现代科
学研究证明,苦荞麦具有很高的营养价值[2],并含有其
他谷物所不含有的生物类黄酮物质[3]。苦荞黄酮具有降
血脂、降血糖、抗氧化、抗癌等多种功效,其中以
芦丁的含量最多 [ 4 ]。
一直以来,苦荞麦的利用方式以苦荞粉为主,苦
荞壳、苦荞麸皮、苦荞叶和苦荞茎被用作饲料或被废
弃。而这些副产物中含有较苦荞粉更为丰富的生物类黄
酮,主要成分是芦丁。本实验以苦荞叶为原料提取纯
化生物类黄酮,为充分利用苦荞资源开发其潜在经济价
值提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 苦荞叶
于 2007 年 4 月 6 日播种,分别于播种后第 23d(4 月
29 日)、第 30d(5 月 6 日)、第 37d(5 月 13 日)、第 44d
(5 月 20 日)、第 51d(5 月 27 日)、第 58d(6 月 3 日)、
收稿日期:2008-04-25
基金项目:吉林省教育厅项目(2007421)
作者简介:白宝兰(1968-),女,副教授,硕士,主要从事保健食品开发研究。E-mail:bbl6908061@163.com
* 通讯作者:昌友权(1966-),男,副教授,博士,主要主要从事保健食品开发研究。E-mail:changyouquan2008@163.com
182 2008, Vol.29, No.09 食品科学 ※工艺技术
第 65d(6 月 10 日)、第 72d(6 月 17 日)、第 79d(6 月 24 日)、
第 86d(7 月 1 日)、第 93d(7 月 8 日)采摘苦荞叶,将
鲜叶在 60℃温度下鼓风干燥 15h 至水分含量为 12.0% ±
1%,用小型粉碎机粉碎制得干燥苦荞叶粉,用塑料袋
密封保存于低温暗箱内,及时检测分析。
1.1.2 苦荞茎
于 6 月 3 日采摘苦荞茎,将鲜茎在 60℃下鼓风干燥
15h 至水分含量为 12.0% ± 1%,用小型粉碎机粉碎制得
干燥的苦荞茎粉,用塑料袋密封保存于低温暗箱内,及
时检测分析。
1.1.3 苦荞壳及麦粒粉
苦荞麦粒经淘洗、润麦后,用锤片式粉碎机粉
碎,先用 10 目的样品筛筛分得到苦荞壳,再将筛下物
(苦荞麦粒去壳粉)粉碎一次,用 80 目样品筛筛分得苦荞
麦粒粉,用塑料袋密封保存于低温暗箱内,及时检测
分 析 。
1.2 仪器与设备
锤片式粉碎机;SHIMADZU LC-2010 高效液相色谱
仪;RE-86 旋转蒸发器;SHZ- 型循环水式多用真空泵;
752 紫外光栅分光光度计;ZK-82A 型真空干燥箱等。
1.3 方法
1.3.1 苦荞黄酮的颜色反应鉴别试验[5]
1.3.1.1 与浓硫酸的反应
取样品液 5ml 放入试管中,加入 1ml 浓硫酸,轻
摇混匀,观察颜色变化。
1.3.1.2 盐酸- 锌粉显色反应
取样品液 5 m l 放入试管中,加入少许锌粉,轻摇
混匀,加入 1 m l 浓盐酸后继续摇动,观察颜色变化。
1.3.1.3 与硼酸的反应
取样品液 5ml 放入试管中,加入 10% 硼酸水溶液
5 m l ,轻摇混匀,观察颜色变化。
1.3.1.4 与 4% NaOH 水溶液的反应
取样品液 5ml 放入试管中,加入 1ml 4%NaOH 水溶
液,轻摇混匀,观察颜色变化。
1.3.1.5 三氯化铝显色反应
取样品液 5ml 放入试管中,加入 1%AlCl 3 水溶液
2 m l ,轻摇混匀,观察颜色变化。
1.3.2 总黄酮含量的测定[6]
1.3.2.1 标准曲线的绘制
准确称取以五氧化二磷为干燥剂减压干燥( 6 0℃,
0.09MPa)至恒重的芦丁标准品 0.077g,用 60% 乙醇溶
解,定容至 250ml,摇匀,得浓度为 0.2926mg/ml 的标
准应用液。分别吸取标准应用液 1.0、2.0、3.0、4.0、
5.0、6.0ml 于 25ml 容量瓶中,用 60% 乙醇添至 10ml,
加入 5% 亚硝酸钠溶液 1.0ml,摇匀,放置 6min,再加
入 10% 硝酸铝溶液 l.0ml,6min 后加入 4% NaOH10ml,
混匀,再用 30% 的乙醇定容至刻度,摇匀,放置 15min
后在波长 510 nm 处测定吸光度,与空白对照。
1.3.2.2 样品总黄酮含量的测定
准确称取 5.00g 干燥样品,用滤纸包好,放入索氏
抽提器中,用乙醇 95℃条件下抽提直至回流液无色,用
乙醇洗涤接收瓶三次。合并抽提液与洗涤液,定容至
50ml。准确吸取 1ml 样品液置于 25ml 容量瓶中,用 60%
乙醇添至 10ml,其他操作同 1.3.2.1 测得吸光度。
1.3.3 芦丁含量 HPLC 测定[7]
1.3.3.1 HPLC 检测条件
色谱柱:Shim-pack VP-ODS C18,(4.6 × 150mm,
5mm);流动相:甲醇:水:冰乙酸(40:60:1),流速:1.0ml/
m i n;检测波长:3 3 0 n m,柱温:室温 2 0℃。
1.3.3.2 样品制备
准确称取干燥样品 4.00g,用滤纸包好,放入索氏
抽提器中,用甲醇 7 0℃条件下抽提至回流液无色,用
甲醇洗涤接收瓶 3 次,合并抽提液与洗涤液,定容至
5 0 ml,保存于低温暗箱内待测。
1.3.3.3 标准品的制备
精密称取以五氧化二磷为干燥剂,减压干燥( 6 0
℃、0.09MPa)至恒重的芦丁标准品 0.0250g,用甲醇配
制成 0.25mg/ml 的标准溶液,放入暗箱内保存备用。
1.3.4 苦荞叶黄酮的提取工艺
通过单因素试验确定影响苦荞叶黄酮浸出率的主要
因素,以乙醇浓度、浸提温度、浸提时间、料液比
(m/V)、浸提溶剂 pH 值为因素水平进行正交试验,如表
1 所示,以黄酮浸出率为指标,优化浸提工艺条件。
1.3.5 苦荞叶黄酮浸提液萃取工艺研究
将苦荞叶黄酮浸提液真空浓缩至水浆状,分别量取
含总黄酮质量为 175.0mg 的水浆液于三支分液漏斗中,
用石油醚萃取除去油性杂质,各自用 200ml 乙酸乙脂、
丙酮和无水乙醇萃取水相 8 h,真空抽滤,得萃取液,
测定黄酮萃取率和萃取液干燥物的总黄酮纯度。
表1 正交试验因素水平表
Table1 Factors and levels of orthogonal test
A时间(min) B乙醇浓度(%) C料液比 D温度(℃) E溶液pH值
1 90 50 1:10 75 7.8
2 120 55 1:15 80 8.15
3 150 60 1:20 85 8.5
4 180 65 1:25 90 8.85
因素
水平
※工艺技术 食品科学 2008, Vol.29, No.09 183
1.3.6 苦荞叶黄酮的大孔树脂纯化工艺[8]
1.3.6.1 样品液的静态吸附
分别称取六种型号的大孔树脂 20g 放入三角瓶中,
向各瓶中加入浓度为 0.75mg/ml 的丙酮萃取液 100ml 浸泡
4 8 h,使大孔树脂充分吸附苦荞叶黄酮,过滤,先用
50ml 蒸馏水洗涤大孔树脂,再用 100ml60% 乙醇浸泡
2 4 h,解吸苦荞叶黄酮,过滤得解吸液,测定吸附率、
解吸率和静态解吸液干燥物的总黄酮含量。
1.3.6.2 动态吸附曲线
量取 200ml 总黄酮浓度为 0.75mg/ml 的样品液,在
流速为 2.0ml/min 的条件下通过装好的 DA-201 树脂柱,
用试管接收滤液,每支试管接收 10ml,按顺序测定每
根试管中总黄酮浓度,以试管号为横坐标,总黄酮浓
度为纵坐标作图即得动态吸附曲线。
1.3.6.3 洗脱溶剂的选择
分别量取 200ml 总黄酮浓度为 0.75mg/ml 的丙酮溶
液,在流速为 2.0ml/min 的条件下通过装填好的 DA-201
树脂柱,将流速调为 3.0ml/min,先用 50ml 蒸馏水通柱
除去杂质,再用 180ml 不同浓度的乙醇洗脱,收集洗脱
液,测定黄酮洗脱率及洗脱液干燥物的总黄酮纯度,确
定最佳洗脱溶剂。
1.3.6.4 洗脱溶剂流速的选择
分别量取 200ml 总黄酮浓度为 0.75mg/ml 的丙酮溶
液,在流速为 2.0ml/min 的条件下通过装填好的 DA-201
树脂柱,在不同流速下,先用 50ml 蒸馏水通柱除去杂
质,再用 180ml 60% 乙醇洗脱,收集洗脱液,测定黄
酮洗脱率及洗脱液干燥物的总黄酮纯度,确定最佳洗脱
溶 剂 。
1.3.6.5 洗脱溶剂用量的选择
分别量取 200ml 总黄酮浓度为 0.75mg/ml 的丙酮溶
液,在流速为 2.0ml/min 的条件下通过装填好的 DA-201
树脂柱,在流速为 3.0ml/min 的条件下,先用 50ml 蒸馏
水通柱除去杂质,再用不同体积的 6 0 % 乙醇洗脱,收
集洗脱液,测定黄酮洗脱率及洗脱液干燥物的总黄酮纯
度,确定最佳洗脱溶剂量。
2 结果与分析
2.1 苦荞黄酮的颜色反应鉴定
表 2 为不同苦荞原料的甲醇浸提液的颜色反应结
果。由表 2 可知,各部位浸提液的颜色反应结果相近,
由结果可确定各种苦荞原料中的生物类黄酮都以黄酮醇
为 主 。
2.2 不同生长时期的苦荞叶总黄酮含量变化
不同时期采摘的苦荞叶中的总黄酮含量之间差异极
显著(F=35.43>F (10,22,0.01)=3.26)。在测定的 11 次
总黄酮含量中,播种后第 58d 采摘的苦荞叶的总黄酮含
量最高为 9.33%,第 65d 采摘的苦荞叶中的总黄酮含量
和第 58d 的差异性不显著,二者比其他九次采摘的苦荞
叶的总黄酮含量高,差异极显著。第 79d 以后苦荞叶总
黄酮含量降低幅度大,其主要原因是这一阶段苦荞植株
衰老,抗氧化能力降低,生物类黄酮光敏性强,见光
易分解,总黄酮含量急剧降低。生产上以收购播种后
第 51~65d 之间的苦荞叶用于提取苦荞叶黄酮为佳。结
果见表 3 。
2.3 苦荞叶、苦荞茎、苦荞壳和苦荞麦粒粉中芦丁含
量和总黄酮含量
由表 4 可知,芦丁是苦荞麦黄酮的主要组成成分,
各种物料中芦丁在总黄酮中的百分率在 60 %~87 % 之
间。苦荞叶、苦荞茎中芦丁在总黄酮中的百分率分别
表4 不同原料的总黄酮的含量
Table 4 Contents of total flavonoids in different materials
表2 不同原料甲醇提取液的颜色反应
Table 2 Phenomena of color reaction of methanol extracts of
different materials
原料 提取液颜色 浓硫酸 硼酸 Zn-HCl NaOH(4%) 三氯化铝
苦荞叶 黄绿色 土黄色 黄绿色 紫红色 深黄色 黄色
苦荞茎 黄绿色 土黄色 黄绿色 深红色 深黄色 黄色
苦荞壳 黄红色 橙色 黄色 深红色 黄色 黄色
苦荞粒粉 黄色 黄色 亮黄色 深红色 深黄色 亮黄色
表3 不同生长时期苦荞叶总黄酮含量的变化
Table 3 Contents of total flavonoids in tartary buckwheat leaves
in different growth periods
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均 0.05 0.01
58 9.56 9.33 9.12 9.34 a A
65 9.24 8.84 9.01 9.03 ab A
51 8.69 8.91 8.76 8.79 b AB
72 8.71 8.51 8.9 8.71 b B
44 8.27 8.42 8.12 8.27 bc B
79 8.11 8.21 8.29 8.2 c BC
37 7.53 7.68 7.81 7.67 d C
30 7.12 7.23 7.41 7.25 d C
86 8.42 7.23 7.01 7.22 d C
20 6.54 6.72 6.91 6.72 e D
93 6.58 6.42 6.29 6.43 e D
差异显著性总黄酮含量(%)播种后天
数(d)
原料 芦丁峰所占比率(%)
芦丁含量
(%)
总黄酮含量
(%)
芦丁/总黄酮
(%)
苦荞壳 85.87 1.87 3.05 61.31
苦荞麦粒粉 92.95 0.8 0.97 82.25
苦荞茎(第58d) 66.28 1.82 2.53 71.94
苦荞叶(第58d) 95.15 7.03 9.33 75.35
184 2008, Vol.29, No.09 食品科学 ※工艺技术
为 71.94% 和 75.35%。苦荞壳中芦丁在总黄酮中百分率较
其他原料低。苦荞叶中芦丁含量及总黄酮含量最高,因
此从苦荞叶中提取总黄酮及芦丁可获得较高的提取率。
2.4 苦荞叶黄酮提取工艺的优化
苦荞叶黄酮浸提正交试验结果见表 5。对试验结果
直观分析可知,极差 Rc>Ra=Rb>Rd>Re,料液比对黄酮浸
出率的影响最大,pH 值对黄酮浸出率的影响最小,最
佳浸提条件为 C3A4B3D1E2,即以料液比为 1:20、pH8.15
的 60% 乙醇,75℃浸提 180min。试验证明,此条件下
的黄酮浸出率为 89.89%,与表 5 中各提取试验的黄酮浸
出率有显著性差异(0.01苦荞叶黄酮提取的最佳工艺条件。
2.5 苦荞叶黄酮浸提液萃取工艺研究
不同溶剂的黄酮萃取率和萃取液干燥物的总黄酮纯
度如图 1 所示。
图1 不同溶剂的萃取效果
Fig. 1 Results of extraction by different solvents
由图 1 可知,有机溶剂萃取后干燥物中总黄酮含量
有极显著升高(p<0.01)。由于苦荞叶黄酮在乙酸乙酯中
的溶解性较小,所以乙酸乙酯作萃取剂时萃取率和干燥
物的总黄酮纯度比另两种有机溶剂低。丙酮和无水乙醇
的萃取率差异不显著(p>0.05)。因为乙醇的极性较强,
萃取过程中溶解的杂质较多,萃取液干燥物的总黄酮含
量比丙酮低(极显著,p<0.01),所以选择丙酮为最佳萃
取溶剂。
2.6 苦荞叶黄酮的大孔树脂纯化工艺优化
2.6.1 不同树脂静态吸附效果的比较
不同树脂静态吸附的吸附率、解吸率和解吸液干燥
物的总黄酮含量如图 2 所示。DA-201 的吸附率、解吸
率和干燥物的总黄酮含量高于其他五种树脂(差异极显
著,p < 0 . 0 1 ),适合于苦荞黄酮的纯化。
乙酸乙酯 丙酮 乙醇
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0



(%
)
47.35 50.71
80.25
55.23
82.64
48.41
黄酮萃取率(%)
总黄酮含量(%)

图3 DA-201树脂动态吸附曲线
Fig.3 Dynamic adsorption curve of DA-201 resin
2.6.2 DA-201 树脂动态吸附曲线
Φ 20mm× 300mm装填 40g DA-201 树脂的树脂柱动
态吸附曲线如图 3 所示。随着萃取液处理量的增大,大
孔树脂吸附苦荞黄酮能力减弱,滤液总黄酮浓度逐渐增
大,当处理量在 200ml 以上时滤液总黄酮含量增大很快,
当样品液处理量为 270ml 时滤液总黄酮浓度为 0.692mg/
ml,滤液总黄酮浓度接近于进样液总黄酮浓度,大孔树
脂吸附能力接近饱和。为提高工作效率并充分利用树脂
柱,每次 40g DA-201 树脂柱的处理量以 200ml 为宜。
图2 不同树脂静态纯化效果
Fig.2 Results of static purification by different kinds of resins
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
HPD-600 HPD-100 DA-201 DM-130 NKA-9 AB-8
树脂名称



(%
)



(%
)





(%
)
系列 2 系列 4
77.8
70.47 67.57
82..34
65.2
72.34
89.34
82.61
76.67
60.56
71.85
78.65
84.52
68.4967.05 67.6
76.45 78.7
吸附率(%) 解吸率(%) 总黄酮含量(%)
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
试管序号





(m
g/
m
l)
0 5 10 15 20 25 30
表5 正交实验结果
Table 5 Results of orthogonal test
K1
K2
K3
K4
R
实验

A 时间
(min)
B 乙醇
(%)
C 料液

D 温度
(℃)
E 溶剂
pH值
黄酮浸出
质量(mg)
黄酮浸
出率(%)
1 90 55 1:20 80 8.5 401.68 86.11
2 150 65 1:10 80 8.15 380.89 81.65
3 120 65 1:20 95 8.85 402.72 86.33
4 180 55 1:10 95 7.8 387.13 82.99
5 90 60 1:10 90 8.85 376.13 80.76
6 150 50 1:20 90 7.8 410 87.89
7 120 50 1:10 75 8.5 399.6 85.66
8 180 60 1:20 75 8.15 419.36 89.89
9 90 50 1:25 85 8.15 392.32 84.1
10 150 60 1:15 85 8.5 401.68 86.11
11 120 60 1:25 80 7.8 415.2 89
12 180 50 1:15 80 8.85 407.92 87.44
13 90 65 1:15 75 7.8 370.49 79.42
14 150 55 1:25 75 8.85 392.38 84.4
15 120 55 1:15 90 8.15 407.92 87.44
16 180 65 1:25 90 8.5 369.45 79.2
82.6 85.27 82.76 84.77 84.82
87.11 86.16 85.1 86.05 85.77
84.94 85.44 87.55 84.88 84.97
84.88 81.65 84.1 83.82 84.66
4.51 4.51 4.79 2.23 1.5
※工艺技术 食品科学 2008, Vol.29, No.09 185
2.6.3 洗脱溶剂的选择
不同浓度的乙醇洗脱时的黄酮洗脱率及解吸液干燥
物的总黄酮纯度如 4 所示。40%、70% 乙醇水溶液的洗
脱百分率很低,5 0 %、5 5 %、6 0 % 三个浓度乙醇水溶
液的洗脱百分率相差不显著(p>0.05)。由于 60% 乙醇洗
脱干燥物的总黄酮含量比另外两种高 8% 以上,差异极
显著,所以选择 6 0 % 乙醇为洗脱溶剂。
2.6.4 洗脱溶剂流速的确定
在不同流速洗脱的洗脱率见图 5。随着洗脱流速增
大,黄酮洗脱百分率降低,3.5ml/min 与 2ml/min 有显著
差异性(p<0.05),3ml/min 与 2ml/min 差异不显著(p>0.05),
所以选择 2ml/min 的洗脱液流速。
2.6.5 洗脱溶剂用量的选择
不同体积 60% 乙醇洗脱的洗脱率如图 6 所示。随着
洗脱溶剂用量的增加,洗脱率逐渐增加,洗脱剂用量
在 180ml 以下时,增幅较大,200ml 与 180ml 的洗脱率
差异不显著(p>0.05),选择 180ml 为最佳洗脱剂用量。
2.7 苦荞叶黄酮精粉含量的测定
通过以上提取纯化工艺所得到的洗脱液经过真空干
燥(60℃,0.09MPa)后制得苦荞黄酮精粉,经测定苦荞
黄酮精粉中的芦丁和总黄酮含量达到 85.34% 和 91.36%。
3 结 论
本实验对苦荞麦叶、茎、壳和籽粒粉碎物中的生
物类黄酮进行了定性定量分析,选用总黄酮含量最高的
苦荞叶为原料制备苦荞黄酮精粉,并确定了苦荞叶黄酮
提取的最佳工艺为:料液比为 1:20、pH8.15 的 60% 乙
醇,75℃浸提 180min。苦荞叶黄酮纯化的工艺为:DA-
201 树脂,处理量为 5ml/g 树脂,洗脱溶剂 60%乙醇溶
液,洗脱流速 2ml/min,洗脱剂用量为 180ml。通过本
工艺制得的苦荞精粉的芦丁和总黄酮含量达到 85.34% 和
91.36%。
参考文献:
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图4 不同浓度乙醇的洗脱效果
Fig. 4 Elution effects of different contents of ethanol
40 50 55 60 65 70
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0





(%
)





(%
)
黄酮洗脱率 黄酮百分率
乙醇浓度(%)
66.81
77.34 75.01 76.01
81.32
85.61
93.46
76.64
93.31
71.31
58.35
85.58
图5 洗脱液流速对洗脱效果的影响
Fig. 5 Effects of elution flow rate on elution





(%
)
洗脱液流速(ml/min)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
83.34 79.65
72.46
62.36
77.43 76.61
2 2.5 3 3.5 4 4.5
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
1 2 3 4 5 6
53.76
62.05
71.64
77.64
81.28
82.39



(%
)
图6 洗脱剂用量对洗脱效果的影响
Fig. 6 Effects of elution solvent amount on elution
洗脱剂用量(ml)