全 文 ： 1

蛹虫草发酵苦荞菌质的成分分析及抗氧化活性研究
陈雪巧. 林俊芳. 彭志妮. 郭丽琼*
(华南农业大学生物质能研究所,华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

摘 要：以苦荞为培养基质，对蛹虫草固体发酵前后的营养和功能成分及抗氧化活性进行测定，分析各种物质含量及抗氧化
活性变化。结果表明，发酵苦荞菌质总氮、总糖、可溶性总糖、还原糖含量显著(总氮、总糖 p<0.01，可溶性总糖、还原糖
p<0.05)低于未发酵基质，游离氨基酸含量有极显著性增加(p<0.01)，粗多糖、总黄酮、总酚、花色苷、维生素 C、GSH（谷
胱甘肽）、SOD（超氧化歧化酶）等功能成分均显著（粗多糖 p<0.05，其余均 p<0.01）高于未发酵基质。苦荞 ABTS[2,2′-联
氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]体外抗氧化实验表明各萃取（石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取部及水部）均具有一定的抗氧化
作用，当浓度为 10mg/mL 时，乙酸乙酯萃取部和水部与 TBHQ（叔丁基对苯二酚）、BHT（2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）及
Vc（维生素 C）清除率相当，达 100%。对抗氧化活性最高的水部和乙酸乙酯萃取部进行 HPLC-MS/MS 分析，结果显示乙酸
乙酯萃取部含有芦丁、槲皮素及含有槲皮素结构碎片、儿茶素结构碎片的物质；水部含有槲皮素、芦丁、山奈酚-3-芸香糖苷
及含有槲皮素结构碎片、山奈酚结构碎片的物质。
关键词：蛹虫草，苦荞发酵菌质，营养成分，抗氧化，HPLC-MS/MS
Compositions and antioxidant activities of tartary buckwheat substrate
during solid-substrate fermentation by Cordyceps militaris
CHEN Xue-qiao. LIN Jun-fang. PENG Zhi-ni. GUO Li-qiong
*
(Institute of Biomass Energy, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,
China)
Abstract: The solid-substate fermentation of Cordyceps militaris using tartary buckwheat substrate was performed. The difference
between the contents of nutritional and functional components and antioxidant activity of before and after fermentation were analyzed.
The results showed that the contents of total nitrogen, reducing sugar, soluble sugar and total sugar were much more lower than
non-fermentation, and free amino acids were higher than non-fermentation significantly. Similarly, functional components like crude
polysaccharide, flavonoids, total phenol, anthocyanins, vitamin C, GSH(glutathione), SOD(superoxide dismutase) of fermented
substrate had significant changes compared with non-fermentation, higher than that.
ABTS[2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)] of different extracts of tartary buckwheat fermented substrate including
petroleum ether, chloroform, ethyl acetate and water part had Antioxidant activities, respectively. The scavenging abilities of ethyl
acetate and water part are 100％, equal to TBHQ(Tertiary butylhydroquinone)、BHT（butylated hydroxytoluene）and Vc(vitamin C)
网络出版时间：2014-03-20 09:55
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1759.TS.20140320.0955.009.html
2
when concentration is 10mg/mL. Analysis of HPLC-MS/MS indicated that ethyl acetate and water part which had the highest
antioxidative activity contain rutin, quercetin, substance with quercetin structure fragment, substance with catechin structure fragment
and quercetin, rutin, kaempferol- 3- rutinose, substance with quercetin structure fragment, substance with kaempferol structure
fragment, respectively.
Key words: Cordyceps militaris, tartary buckwheat fermented substrate, nutritional compositions, antioxidant, HPLC-MS/MS
中图分类号：TS201 文献标识码：B
蛹虫草[Cordyceps militaris]，别名北冬虫夏草，化学成分、营养成分和药用功能与冬虫夏草两者非常相
似，比冬虫夏草更易于人工栽培，常用来代替冬虫夏草进行人工培育[1]。其发酵后可产生包括虫草素等核苷
类、麦角固醇、多糖类、多肽类、虫草酸、超氧化物歧化酶（SOD）和硒等生物活性物质[2]，具有很高的营
养保健价值。苦荞属蓼科荞麦属，除必须氨基酸、微量元素外还富含生物类黄酮、多肽、糖醇和 D-手性肌
醇等高活性功能成分，同样具有独特的保健与生理功能[3]。传统的苦荞食品口感粗糙，略具苦涩味，且营养
物质消化吸收率低，限制了苦荞食品的食用，苦荞淀粉中含的缓慢消化淀粉(SDS)和耐消化淀粉(RS)使苦荞
中营养物质消化率降低，肠胃功能不好的人则不能食用[4]。故如何开发人们愿意接受的苦荞制品以及深入广
泛研究苦荞的营养价值和保健功能是开发和利用苦荞的重要方向。
固态发酵是一种传统的发酵方式，是指微生物在几乎没有游离水的固态基质上生长代谢的过程。蛹虫草固
体发酵大多以虫草素、虫草多糖、虫草酸等为目标产物，只是考虑菌丝对基质的利用情况，并未考虑菌丝
对基质的转化作用[5-6]。本文以苦荞为培养基质，接入蛹虫草液体菌种，研究蛹虫草发酵菌质的成分和抗氧
化活性的变化，为蛹虫草发酵产品的开发提供理论依据；同时研究蛹虫草对苦荞基质的转化作用，也为科
学开发利用苦荞这种基质提供依据。
收稿日期：
作者简介: 陈雪巧( 1988－) ，女，在读硕士研究生，研究方向：微生物资源与利用
基金项目：广东省科技计划项目（2012A020100010, 2012B020316004）
*通讯作者：郭丽琼(1963－ )，女，教授，博士生导师，研究方向: 食品药品生物技术研究与产品开发。


1 材料与方法
1.1 材料与仪器
苦荞 市售；蛹虫草菌株 实验室保存；VE标准品、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、叔丁基对苯二
酚（TBHQ）、2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS) 均为Sigma-Aldrich公司产品；还原型谷胱甘
肽（GSH）试剂盒 南京建成生物工程研究所；其他常用试剂均为分析纯。
3
分光光度计UV-1100 北京天美公司；低温高速离心机 Eppendorf公司；精密pH计PHS-3C 上海精密
科学仪器有限公司；液相色谱质谱联用仪 Agilent 1100 series LC-MSD-Trap-XCT 色谱柱：C18 4μm
（150mm×3.9mm） 安捷伦公司。
1.2 蛹虫草液体培养基及种子液的制备
马铃薯200g，MgSO4 1.5g，葡萄糖20g，1000mL，水pH 6.8，121℃，KH2PO4 3g，灭菌30min，备用；
将活化的蛹虫草菌块接种于液体培养基，培养温度25℃，摇床转速200r/min培养2d。
1.3 固体发酵培养基与接种
苦荞粉碎过60目筛，装入培养瓶中，加入定量的水，调整水分含量为70%，pH 6.5，121℃，灭菌30min，
备用；每瓶固体发酵培养基按每10g培养基料接入1mL种子液，于25℃黑暗培养28d。
1.4 样品预处理
将培养基料充分混匀后于60℃下烘干，粉碎过60目筛，备用。
1.5 营养和功能成分测定
水分含量的测定采用常压烘箱干燥法测定；总氮采用凯氏定氮法测定；还原糖测定采用3,5-二硝基水杨
酸（DNS）法；可溶性总糖采用苯酚-硫酸法测定；总糖按硫酸－苯酚法测定；游离氨基酸含量采用茚三酮
法测定[7]；粗多糖含量用硫酸-苯酚法测定[8]；多肽含量的测定以酸溶蛋白计[9]；总黄酮的含量测定采用
NaNO2- Al(NO3)3比色法测定
[10-11]；总酚的测定采用Folin-Ciocalteu法[12]；皂苷的测定参照魏静等方法[13]；
花色苷含量测定参照Tibor等方法[14]；超氧化歧化酶（SOD）测定参照李永利，王琦等方法[15-16]；还原型维
生素C测定采用姆蓝比色法[17]；维生素E测定用标准曲线法[18]；谷胱甘肽（GSH）采用还原型谷胱甘肽（GSH）
试剂盒；MDA（丙二醛）含量测定采用TBA—MDA显色法测定MDA含量[19]；虫草素采用液相色谱法[20-22]：
Hypersil ODS（C18，250×4.6mm，5μm，thermo）。
1.6 抗氧化活性测定
1.6.1 分离提取
取100g样品加入具塞三角瓶中，用2000mL75%乙醇提取，提取液在50℃旋转蒸干有机溶剂后，分别用
石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取部分别旋转至干，以甲醇溶解稀释至一定浓度（0.1、0.5、1、5、10mg/mL），
剩余水部冷冻干燥后同样用甲醇定量溶解至上述不同浓度。即成含有不同有效物质浓度的石油醚、氯仿、
乙酸乙酯及水部萃取部。
1.6.2 ABTS 清除率的测定
参照 Roberta 等[23]的方法。样品自由基清除率= (1-At/A0)×100；式中：At—反应 4min 后，测定反应混
合液的吸光度；A0—ABTS+自由基工作液的吸光度值。
1.7 数据处理
所有试验均重复 3 次，数据以平均值±标准差表示，采用 SAS9.2 进行数据处理，数据先进行 T 检验，
然后以单因素方差分析进行统计，采用 Duncan 方法进行组间比较，以 p＜0.05 为统计学差异。
4
2 结果与分析
2.1 蛹虫草苦荞发酵菌质营养成份分析
以苦荞为培养基质，通过接种蛹虫草进行充分发酵后，测定发酵菌质的营养成份，同时以苦荞基质发
酵前的成份为对照，测定结果如表 1 所示。
表 1 苦荞未发酵基质和发酵菌质的营养成份分析
Table1 Nutritional ingredient analysis on fermented and non-fermentation substrate of tartary buckwheat
指标 未发酵基质 发酵菌质
水分（%） 4.15±0.29 4.21±0.56
总氮（g/100g） 2.51±0.11 2.08±0.05A
还原糖（mg/g） 27.370.36 14.70±0.41a
可溶性总糖（mg/g） 108.64±1.02 71.64±0.43a
总糖（mg/g） 827.40±2.92 653.76±1.42A
游离氨基酸（mg/g） 26.93±0.30 45.65±0.59A
注：―a‖表示有显著性差异，即p<0.05，与未发酵基质相比； ―A‖表示有极显著差异，即p<0.01，与未发酵
基质相比。
表1中数据表明，苦荞基质含有很高的总糖。发酵苦荞菌质总氮、还原糖、可溶性总糖和总糖含量均低
于未发酵基质，且总氮和总糖有极显著差异。游离氨基酸含量增加，与未发酵基质相比有极显著差异，是
未发酵的1.7倍。说明经过固体发酵后总氮、还原糖等大分子物质被降解，而游离氨基酸等小分子物质增加，
提高了消化吸收性。
2.2 功能性成分分析
以苦荞为培养基质，通过接种蛹虫草进行充分发酵后，测定发酵菌质的功能成份，同时以苦荞基质发
酵前的成份为对照，测定结果如表 2 所示。
表 2 苦荞发酵未发酵基质和发酵菌质的功能成份分析
Table2 Functional components analysis on fermented and non-fermentation substrate of tartary buckwheat
指标 未发酵基质 发酵菌质
粗多糖（mg/g） 19.73±0.21 40.52±0.44a
多肽（mg/g） 0.24±0.03 -
总黄酮（mg/g） 7.06±0.35 9.09±0.31A
总酚（mg/g） 11.74±0.17 16.11±0.22A
皂苷（mg/g） 23.14±0.60 25.74±0.48
花色苷（μg/g） 6.52±0.23 33.80±0.49A
SOD（U/g） 45.88±0.91 185.68±1.21A
维生素 C（mg/g） 0.86±0.08 1.78±0.14A
维生素 E（mg/g） 0.11±0.04 0.15±0.05
GSH（mg/g） 0.031±0.003 0.082±0.003A
丙二醛（μmol/g） 0.0014±0.0004 0.0023±0.0003a
虫草素（μg/g） - 53.89±0.07
5
注：―a‖表示有显著性差异，即p<0.05，与未发酵基质相比； ―A‖表示有极显著差异，即p<0.01，与未发酵
基质相比。
表 2 中数据表明，发酵苦荞菌质粗多糖、总黄酮、总酚、花色苷、维生素 C、GSH、SOD 与未发酵基
质相比发生显著性变化，均高于未发酵基质，且总黄酮、总酚、花色苷、SOD、维生素 C 和 GSH 有极显
著差异。皂苷、维生素 E 变化不明显，多肽发酵含量较低，本实验方法未见响应。
以上数据可以看出发酵后菌质的功能性成分明显增加。这是因为苦荞发酵后苦荞中复杂的成分(淀粉、
蛋白质、脂肪和糖)在微生物的作用下分解成简单物质(有机酸类、氨基酸类、醇类、核酸类、生物活性物质
等)。苦荞的皂苷和维生素 E 的变化不明显，这可能与蛹虫草代谢过程对皂苷及维生素 E 的利用及转化途径
相似有关。
2.3 苦荞发酵菌质的抗氧化活性
对系统分离的各萃取部进行 ABTS 体外抗氧化实验，研究菌质提取液石油醚萃取部、氯仿萃取部、乙
酸乙酯萃取部和水部的抗氧化活性。结果各萃取部均具有一定的抗氧化作用，但各部分之间也存在一定差
异。表 3 为提取液不同极性萃取部对 ABTS 的清除率的变化。
表 3 不同极性萃取部对 ABTS 的清除率的变化
Table3 Functional components analysis on fermented and non-fermentation substrate of tartary buckwheat
ABTS清除率
浓度（mg/mL） 10 5 1 0.5 0.1
石油醚 14.24±1.5a 8.5±0.6a 2.84±1.2a 1.2±0.7a 1.42±0.8a
氯仿 69.57±1.88b 32.67±1.78b 7.6±1b 6.25±0.9b 1.2±1.1a
乙酸乙酯 100±1.5c 90.86±2.45d 39.69±1.3d 27.63±1.4c 6.16±0.5b
水 99.71±2c 68.62±1.88c 11.89±0.88c 6.57±1b 2.28±1.6a
TBHQ 100±1.3c 92.75±1.3de 84.98±1.3e 68.8±0.9d 15±1.2d
BHT 100±1.4c 95.78±1ef 92.82±0.9f 84.82±0.7e 10±0.1c
Vc 100±1.5c 97.3±1.2f 97.3±0.9g 97.13±0.8f 21.8±1e
注：a、b、c、d、e、f、g指5％显著水平上，同个浓度下数据间的显著性差异。
表 3 中浓度是指各萃取部及抗氧化剂对照 TBHQ、BHT 及 Vc 的浓度。数据表明，各萃取部随着浓度
的升高清除率增加，呈现良好的量效关系。同浓度下，各萃取部的清除率存在差异，当浓度为 10mg/mL 时，
乙酸乙酯萃取部和水部与 TBHQ、BHT 及 Vc 清除率相当，达 100%；而石油醚、氯仿与 TBHQ、BHT 及
Vc 清除率有显著性差异，分别为 14.24％和 69.57％。总体来看，各萃取部之间，乙酸乙酯萃取部最高，水
部次之，石油醚萃取部最低，推测抗氧化活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取部和水部。
2.4 苦荞发酵菌质的抗氧化活性成分分析
对抗氧化活性较高的乙酸乙酯萃取部和水部进行液质联用分析，结果如下。图 2 为苦荞提取液乙酸乙
酯部的色谱图。
6
2
3
4
5
6
7
9 11
13 14
15
12
10
1
8
10 15 20 25 30 35 40 45 Time [min]
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
7x10
Intens.

图 2 苦荞菌质提取液乙酸乙酯萃取部色谱图
Fig.2 Chromatogram of ethyl acetate part of tartary buckwheat fermented substrate extraction
图 2 中色谱峰 2 的质谱图中 m/z471 的二级基峰为 m/z289，m/z289 的二级基峰是 m/z245[M－H－CO2]
－，符合儿茶素的裂解规律[24]，推测该物质含有儿茶素结构碎片；色谱峰 3 的 m/z609 有芦丁二级质谱特征
碎片峰[25]，确定为芦丁；色谱峰 5 与峰 2 相似，有儿茶素特征峰，确定含有儿茶素结构碎片；色谱峰 6 的
m/z301 有槲皮素二级质谱特征碎片峰[25]，确定为槲皮素；色谱峰 7、峰 8 和峰 9 一级碎片离子峰相似，但
相对丰度不同，二级碎片离子相似，三者出峰时间存在差异，推断为含有槲皮素结构碎片的物质[25]，而且
结构上可能存在差异性（以上质谱图略）。
因此苦荞发酵菌质提取液乙酸乙酯萃取部含有芦丁、槲皮素及含有槲皮素结构碎片的物质，含有儿茶
素结构碎片的物质。还有一些物质文献没有报道，难以确定。芦丁、槲皮素、儿茶素为苦荞本身含有的物
质[26-28]，推测槲皮素结构碎片物质及含有儿茶素结构碎片的物质可能是苦荞经蛹虫草发酵后，对槲皮素儿
茶素等物质的转化作用生成的。
图 3 为苦荞菌质提取液水部的液相色谱图。
12 3
4
5 6 7
8
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5 10 15 20 25 30 35 Time [min]
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
7x10
Intens.

图 3 苦荞菌质提取液水部色谱图
Fig.3 Chromatogram of water part of tartary buckwheat fermented substrate extraction
图 3 中色谱峰 7 的质谱图准分子峰 m/z771 二级碎片显示它含有槲皮素和芦丁，与 Qing 等[26]的结果符
合，确定其为槲皮素 3-芸香葡萄糖苷；色谱峰 83 的 m/z609 有芦丁二级质谱特征碎片峰[25]，确定为芦丁；
色谱峰 9 的 m /z609 二级碎片离子芦丁特征峰相符，确定 m/z609 为芦丁，而 m/z593 的二级碎片 m/z285 为
7
山奈酚，确定为山奈酚-3-芸香糖苷[26]，因此色谱峰 9 为芦丁与山奈酚-3-芸香糖苷混合物；色谱峰 10 和峰
11 一级碎片离子峰相似，含有 m/z609 碎片，二级含有 m/z301 槲皮素碎片，可能是含有芦丁的混合物；色
谱峰 12 一级碎片离子含有槲皮素碎片，推断其含有槲皮素结构碎片；色谱峰 13 一级碎片离子含有 m/z285，
为山奈酚，推测含有山奈酚结构碎片（以上质谱图略）。
因此，苦荞菌质提取液水部含有槲皮素、芦丁、山奈酚-3-芸香糖苷及含有槲皮素结构碎片的物质、含
有山奈酚结构碎片的物质。槲皮素、芦丁为苦荞本身含有的物质[26,28]，山奈酚-3-芸香糖苷是否为芦丁的转
化产物还为确定[26-39]，但是含有槲皮素结构碎片的物质、含有山奈酚结构碎片的物质可以推测是发酵过程
中生物转化的结果。
3 结论
蛹虫草发酵苦荞基质使苦荞中复杂的成分(淀粉、蛋白质、脂肪和糖)分解成简单物质(有机酸类、氨基
酸类、醇类、核酸类、生物活性物质等)，极大地提高了苦荞营养物质的消化吸收和营养价值，改变了苦荞
食品适口性。体外抗氧化性实验表明发酵后抗氧化活性提高，抗氧化活性物质在发酵过程中进行了微生物
生物转化，增加了天然化合物的多样性。

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