全 文 ：中国医院用药评价与分析　２０１６年第１６卷第０１期　　　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｒｕｇ－ｕｓｅ　ｉｎ　ｈｏｓｐｉｔａｌｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　２０１６Ｖｏｌ．１６Ｎｏ．０１　 ·９９　 ·
ＨＰＬＣ法同时测定佛耳草中黄酮类和酚酸
类成分的含量
毛颐晴，王贞媛（南京市食品药品检验所，江苏 南京　２１００００）
中图分类号　Ｒ４５３　　　　文献标识码Ａ　　　　文章编号　１６７２－２１２４（２０１６）０１－００９９－０２
ＤＯＩ　
摘　要　目的：建立同时测定佛耳草中酚酸类和黄酮类成分含量的高效液相色谱分析法。方法：采用高效液相色谱双波长切换法，色谱柱为Ｄｉａ－
ｍｏｎｓｉｌ　Ｃ１８柱（４．６ｍｍ×２００ｍｍ，５μｍ）；流动相：甲醇（Ａ）－０．４％磷酸溶液（Ｂ），梯度洗脱；检测波长为３２７ｎｍ和３６０ｎｍ；流速为１．０ｍＬ·ｍｉｎ
－１。
结果：绿原酸在４．１０４～８２．０７μｇ、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸在１２．７４～２５４．９０μｇ、槲皮素在２．０５５～４１．１１μｇ、木犀草素在４．０３２～８０．６４μｇ范围内与
峰面积呈良好的线性关系；平均加样回收率分别为９８．３１％、９７．５１％、９８．２９％、９８．７３％，ＲＳＤ分别为１．１９％、１．５２％、１．２２％、１．４７％。结论：该法简便，
重复性好，各成分分离良好，可用于佛耳草的质量评价。
关键词　高效液相色谱法；佛耳草；绿原酸；３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸；槲皮素；木犀草素
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ａｎｄ　Ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｈｅｒｂａ　Ｌａｐｈａｎｇｉｕｍ　Ａｆｆｉｎｉｓ　ｂｙ　ＨＰＬＣ
Ｍａｏ　ｙｉｑｉｎｇ，Ｗａｎｇ　ｚｈｅｎｙｕａｎ（Ｎａｎｊｉｎｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｊｉａｎｇｓｕ　Ｎａｎｊｉｎｇ　２１００００）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ　 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａｎ　ＨＰＬＣ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｓｉｍｕｔａｎｅｏｕｓ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｈｅｒｂａ　Ｌａｐｈａｎｇｉｕｍ　Ａｆｆｉｎｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｏｎ　ａ　Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ　Ｃ１８ｃｏｌｕｍｎ（４．６ｍｍ×２００ｍｍ，５μｍ）ｗｉｔｈ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｅｌｕｔｉｏｎ　ｕｓｉｎｇ　ｍｅｔｈａｒｏｌ－０．２％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ａｓ　ｍｏｂｉｌｅ　ｆｈａｓｅ．
Ｔｈｅ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ　ｗａｓ　１．０ｍＬ．ｍｉｎ－１　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ　ｗａｓ　ａｔ　３２７ｎｍ　ａｎｄ　３６０ｎｍ．Ｒｅｓｕｌｔ：ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｌｉｎｅａｒ　ｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　４．
１０４～８２．０７μｇ　ｆｏｒ　ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄｒｕｔｉｎ、１２．７４～２５４．９０μｇ　ｆｏｒ　３．５－Ｏ－ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ　ｑｕｉｎｉｃ　ａｃｉｄ、２．０５５～４１．１１μｇ　ｆｏｒ　ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ　ａｎｄ　４．０３２～８０．６４μｇ　ｆｏｒ　ｌｕｔｅ－
ｏｌｉｎ．Ｔｈｅ　ａｖｅｒａｇｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｗｅｒｅ　９８．３１％、９７．５１％、９８．２９％、９８．７３％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ　ＲＳＤ　ｗｅｒｅ　１．１９％、１．５２％、１．２２％、１．４７％．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：
Ｔｈｅ　ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｎｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｈｅｒｂａ　Ｌａｐｈａｎｇｉｕｍ　Ａｆｆｉｎｉｓ
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　ＨＰＬＣ；Ｈｅｒｂａ　Ｌａｐｈａｎｇｉｕｍ　Ａｆｆｉｎｉｓ；ｃｈｌｏｒｏｇｅｎｉｃ　ａｃｉｄｒｕｔｉｎ；３．５－Ｏ－ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ　ｑｕｉｎｉｃ　ａｃｉｄ；ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ；ｌｕｔｅｏｌｉｎ
　　佛耳草　Ｌａｐｈａｎｇｉｕｍ　ａｆｆｉｎｅ（Ｄ．Ｄｏｎ）Ｔｚｖｅｌｅｖ为菊科鼠曲草属植
物，全草入药，又名鼠曲草、黄花菊草等，主产于江苏、浙江、上海等地，
性味甘、平，具有祛痰，止咳，平喘，祛风湿之功效。现代研究表明佛耳
草全草含５％黄酮苷，０．０５％挥发油，微量生物碱和甾醇等成分，花含木
犀草素－４－β－葡萄糖苷
［１］［２］。佛耳草药材标准收载于《中国药典》
１９７７年版（称鼠曲草）、《江苏省中药材标准》１９８９年版，其药材标准中
仅有性状、理化鉴别项［３］［４］，对佛耳草定量测定的报道有：用 ＨＰＬＣ法
对鼠曲草中槲皮素进行测定［５］。佛耳草中槲皮素等黄酮类化合物具有
抗氧化、抗炎、抑菌作用，［３］［４］绿原酸等咖啡酰奎宁酸类化合物具有抗
呼吸道病毒活性，［５］为佛耳草的活性成分，可作为控制质量的指标。
本文采用ＨＰＬＣ法同时对佛耳草中的黄酮类成分槲皮素、木犀草素及
酚酸类成分绿原酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸进行测定，为佛耳草药
材的质量评价提供一定的科学依据。
１　仪器与试药
Ｗａｔｅｒｓ　２６９５高效液相色谱仪，２９９８二极管阵列检测器，Ｅｍｐｏｗｅｒ３
化学工作站；Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ，Ｃ１８（２００ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）色谱柱；ＫＱ－２５０Ｂ
超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；ＸＳ２０５型天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ　ＴｏｌｅＤｏ
公司）；
槲皮素对照品（批号１０００８１－２００９０７，含量９６．５％，使用前不需干
燥）、木犀草素对照品（批号１１１５２０－２００５０４，使用前置五氧化二磷干燥
器减压干燥１２小时以上）、绿原酸对照品（批号１１０７５３－２０１３１４，含量
９６．６％，使用前不需干燥）、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸对照品（批号
１１１７８２－２０１２０３，含量９６．７％，冷藏保存，使用前不需干燥）均购自中国
食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，购于美国Ｆｉｓｈｅｒ公司，水为超纯
水，其他试剂均为分析纯。
佛耳草药材购自安徽亳州永刚中药饮片厂，南京中药饮片有限公
司，另一批为自采，采自江苏南京。药材经性状和显微鉴定为佛耳草。
２　方法与结果
２．１　色谱条件　Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ　Ｃ１８柱（４．６ｍｍ×２００ｍｍ，５μｍ）；流动相为
甲醇（Ａ）－０．４％磷酸溶液（Ｂ），梯度洗脱：０～１０ｍｉｎ，２５％Ａ；１０～２５ｍｉｎ，
３５％Ａ；２５～４０ｍｉｎ，３５％Ａ～５５％Ａ；４０～６０ｍｉｎ，５５％Ａ～５０％Ａ；绿原
酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸的检测波长为３２７ｎｍ，槲皮素、木犀草
素的检测波长为３６０ｎｍ；流速为１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１。进样量为１０μＬ。柱
温：３０℃。对照品和样品色谱图见图１。
１．绿原酸　２．３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸　３．槲皮素　４．木犀草素
图１　高效液相色谱图
Ａ对照品３２７ｎｍ　Ｂ对照品３６０ｎｍ　Ｃ样品３２７ｎｍ　Ｄ样品３６０ｎｍ
２．２　溶液的制备
２．２．１　对照品溶液的制备：分别精密称取对照品绿原酸（１０．６２ｍｇ）、３，５
10.14009/j.issn.1672-2124.2016.s1.077
·１００　 · 中国医院用药评价与分析　２０１６年第１６卷第０１期　　　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｒｕｇ－ｕｓｅ　ｉｎ　ｈｏｓｐｉｔａｌｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　２０１６Ｖｏｌ．１６Ｎｏ．０１
－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸（１３．１８ｍｇ）、槲皮素（１０．６５ｍｇ）和经五氧化二磷
减压干燥１２ｈ后的对照品木犀草素（１０．０８ｍｇ），至不同的５０ｍＬ棕色量
瓶中，分别加甲醇溶解定容，作为对照品储备液。置４℃冰箱，备用。
精密吸取绿原酸对照品储备液２ｍＬ、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸
对照品储备液５ｍＬ、槲皮素对照品储备液１ｍＬ及木犀草素对照品储备
液２ｍＬ，混匀，作为混合对照品溶液。
２．２．２　供试品溶液的制备：称取佛耳草药材粉末２ｇ，精密称定，精密加
入甲醇５０ｍｌ，称定重量，超声处理（２５０Ｗ，４０ｋＨｚ）３０ｍｉｎ，放冷，再称重，
以甲醇补足减失的重量。摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
２．３　线性关系的考察　分别精密吸取“２．２．１”项下的对照品溶液１，２，
５，１０，１５，２０μｌ注入高效液相色谱仪。以进样量（Ｘ，μｇ）对峰面积（Ｙ）进
行回归，绿原酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸、槲皮素及木犀草素的回
归方程分别为Ｙ＝３．１４５×１０５　Ｘ－５．４５０×１０４（ｒ＝０．９９９９）、Ｙ＝３．６６６×
１０５　Ｘ＋２．０７７×１０６（ｒ＝０．９９９６）、Ｙ＝４．２２３×１０５　Ｘ－９．６９８×１０４（ｒ＝０．
９９９９）、Ｙ＝３．９９９×１０５　Ｘ－１．７４１×１０５（ｒ＝０．９９９９），线性范围分别为４．
１０４～８２．０７μｇ、１２．７４～２５４．９０μｇ、２．０５５～４１．１１μｇ、４．０３２～８０．６４μｇ。
２．４　精密度试验　日内精密度：以上述混合对照品溶液每３ｈｒ　１次连
续进样６次，每次５μｌ，绿原酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、木犀
草素峰面积积分值的ＲＳＤ分别为０．５４％，０．９１％，０．６２％，０．８０％。
日间精密度：每天１次，以混合对照品溶液连续进样５ｄ，每次５μｌ，
绿原酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰奎宁酸、槲皮素、木犀草素峰面积积分值分
别为０．９２％，１．０３％，０．８８％，０．８９％。
２．５　重复性试验　精密称取同批佛耳草药材粉末５份，每份２ｇ，按２．２．
２　项下方法制备供试品溶液，进样１０μＬ，测定。样品中绿原酸、３，５－
Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸、槲皮素和木犀草素含量平均值分别为０．５２９、１．
３００、０．２７４、０．３４２ｍｇ·ｇ－１。ＲＳＤ分别为１．６５％，１．２１％，０．７０％，１．３１％。
表明本方法重复性好。
２．６　稳定性试验　取“重复性试验”项下同一供试品溶液，０，６，１２，２４，
３６，４８ｈ连续进样６次，进样１０μＬ，测定４８ｈ内的峰面积，计算ＲＳＤ分别
为０．５０％，０．８２％，０．４７％，０．７６％。表明溶液在４８ｈ内稳定。
２．７　加样回收率试验　取已知含量的同一批样品１ｇ，共９份，每３份
为一组，分别按低、中、高质量浓度精密加入４个对照品储备液适量，按
“２．２．２”项下制得供试品溶液，进样１０μＬ，测定含量，计算加样回收率，
结果绿原酸的平均回收率９８．３１％，ＲＳＤ＝１．１９％（ｎ＝９）、３，５－Ｏ－二咖
啡酰基奎宁酸的平均回收率９７．５１％，ＲＳＤ＝１．５２％（ｎ＝９）、槲皮素的平
均回收率９８．２９％，ＲＳＤ＝１．２２％（ｎ＝９）、木犀草素的的平均回收率９８．
７３％，ＲＳＤ＝１．４７％（ｎ＝９）。
２．８　样品测定　分别取不同批次的佛耳草药材，按“２．２．２”项下方法制
备供试品溶液，在上述色谱条件下进样１０μＬ，采用外标法计算４个成
分的含量，测定结果见表２．
３　讨论
３．１　流动相的选择　文献查找表明，黄酮类成分多用甲醇－磷酸－水
系统，酚酸类成分多用乙腈－磷酸－水系统，分别比较了甲醇－磷酸－
水系统和乙腈－磷酸－水系统，结果表明使用甲醇－磷酸－水系统时，
各目标峰达到基线分离，因此选择该系统作为流动相。
３．２　检测波长的选择　由于黄酮类成分和酚酸类成分的紫外吸收差
别较大，在同一波长检测会损失某些成分的灵敏度，本实验采用ＤＡＤ
检测器，实验结果表明，绿原酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸在３２７ｎｍ
处有最大吸收，槲皮素在３６０ｎｍ处有最大吸收，木犀草素在３５０ｎｍ处
有最大吸收，但与其在３６０ｎｍ处响应值差别不大。因此选择３２７ｎｍ波
长为绿原酸、３，５－Ｏ－二咖啡酰基奎宁酸的测定波长，３６０ｎｍ波长为槲
皮素和木犀草素的测定波长。
３．３　样品处理方法的优化　考察了不同溶剂（甲醇、７０％甲醇、５０％甲
醇、甲醇－２５％盐酸（４∶１）），不同提取方法（超声处理、加热回流），不
同提取时间（２０、３０、６０分钟）对各指标成分的影响，结果显示，采用酸化
水解的方法，黄酮类成分的提取效率较高，但酚酸类成分的提取效率
低；采用不同浓度的甲醇为溶剂，以甲醇对各指标成分的提取效率最
高；超声处理３０ｍｉｎ和加热回流３０ｍｉｎ的提取效率接近，考虑到酚酸类
成分遇热不稳定的因素，选择超声处理的方法；超声处理３０分钟、６０分
钟，各指标成分的提取效率接近，高于超声处理２０分钟。
３．４　小结　本实验方法简便、高效、快捷，重复性好，同时测定了佛耳
草黄酮类和酚酸类活性成分的含量，为佛耳草药材的质量评价提供一
定的科学依据。
表２　不同批次佛耳草药材中４个成分的含量（ｍｇ·ｇ－１，ｎ＝３）
药材来源
含量
绿原酸
３，５－Ｏ－二咖啡
酰基奎宁酸
槲皮素 木犀草素
亳州永刚中
药饮片厂
０．５２９　 １．３００　 ０．２７４　 ０．３４２
南京中药饮片
股份有限公司
０．２４５　 ０．９０５　 ０．２５７　 ０．３５８
采自江苏南京 １．１９６　 ２．９３３　 ０．３１４　 ０．３９２
参考文献
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学技术出版社，１９９９，８４８．
［２］　南京中医药大学．中药大辞典［Ｍ］．第二版．（下册）．上海：上海科学技
术出版社，２００６，３５１２．
［３］　中国药典［Ｓ］．１９７７年版一部
［４］　江苏省卫生厅．江苏省中药材标准［Ｍ］．（１９８９年版），江苏科学技术出
版社，１９８９，１２０－１２１．
［５］　潘明．鼠曲草提取物抑菌作用初步研究［Ｊ］．四川食品与发酵．２００６．４２
（６）：５３－５６．
［６］　徐玉婷 吴丹慧．鼠曲草的研究进展［Ｊ］．医药导报．２０１２年３１（２）：１９２．
［７］　马双成，毕培曦，黄荣春．等．金银花药材中抗呼吸道病毒感染的咖啡
酰奎宁酸类成分的定量研究［Ｊ］．药物分析杂志．２００５．２５（７）：７５１－７５５．
［８］　韦少宣，夏爱军，廖厚知．ＨＰＬＣ测定鼠曲草中槲皮素的含量 ［Ｊ］．药
学实践杂志．２０１２．３０（６）：４５１－４５４．
（上接第９８页）可有效缓解患者的临床症状、改善预后［２］。
表３　两组患者治疗前后肺部功能改善情况对比
组别
ＦＶＣ
治疗前
ＦＶＣ
治疗后
ＦＥＶ
治疗前
ＦＥＶ
治疗前
ＦＥＶ１／ＦＶＣ
治疗前
ＦＥＶ１／ＦＶＣ
治疗后
对照组
１．４５±
０．２５
１．７５±
０．１９
１．７５±
０．１９
０．９５±
０．０９
０．５５±
０．０８
０．６５±
０．０８
联合治
疗组
１．４６±
０．２５
１．９１±
０．１３
１．７６±
０．１７
１．０９±
０．１０
０．５５±
０．０９
０．７２±
０．０５
Ｐ ＞０．０５ ＜０．０５ ＞０．０５ ＜０．０５ ＞０．０５ ＜０．０５
　　沙美特罗／氟替卡松商品名为舒利迭，是吸入性糖皮质激素的一
种，与吸入性长效β受体激动剂联合治疗慢性阻塞性肺疾病疗效显
著。从国外大型研究来看单独使用抗胆碱能药物、长效β受体激动剂
或吸入型糖皮质激素均不能够有效改善患者肺部功能，得到满意的
临床治疗效果，需根据患者病情联合用药［３］。
本组研究结果显示，治疗后，两组患者４、８、１２周６分钟步行距
离、呼吸困难评分情况及肺功能指标等均有所改善，联合治疗组患者
改善更为明显，与对照组患者相比，差异具有显著性（Ｐ＜０．０５），与其
他相关研究结果一致。由此提示，噻托溴铵联合沙美特罗／氟替卡松
联合治疗慢性阻塞性肺疾病的临床疗效明显优于沙美特罗／氟替卡
松治疗，安全、有效，值得推广。
参考文献
［１］　吴健卫，徐方林，冯立娅，等．噻托溴铵和沙美特罗！丙酸氟替卡松
联合治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的疗效［Ｊ］．实用临床医学，
２０１１，１２（８）：３１－３３．
［２］　戴沛军，冀雪娟，王恒辉，等．噻托溴铵联合沙美特罗／丙酸氟替卡松
治疗稳定期重度慢性阻塞性肺疾病疗效观察［Ｊ］．中华实用诊断与治
疗杂志，２０１３，２７（１）：６８－７０．
［３］　夏大珍，张美蓉，张秀伟．噻托溴铵与沙美特罗／氟替卡松联合治疗
慢性阻塞性肺疾病的疗效观察与护理［Ｊ］．实用临床医药杂志，２０１１，
１５（８）：２６－２８．
［４］　余昌平．噻托溴铵联合沙美特罗／氟替卡松对重度慢性阻塞性肺病
的疗效分析［Ｊ］．中国医药导报，２０１２，９（２６）：７６－７８．
［５］　周甲东，赵芝焕，万崇华，等．慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者的
生存质量、客观指标及其关系的研究［Ｊ］．实用医学杂志，２０１２，２８
（２０）：３３６２－３３６４．