全 文 ：广西科学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　　　　　　 2010, 26( 3): 239～ 241
Journal of Guangxi Academ y of Sciences　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Vol. 26, No. 3　 August 2010
收稿日期: 2010-05-11
作者简介:徐　慧 ( 1982-) ,女 ,助理工程师 ,主要从事生化分析研究。
高效液相色谱法测定蓝耳草中 β-蜕皮激素含量
Determination of β-Ecdysone inCyanot is vaga ( Lour. )
Roem. et Schul t by HPLC
徐　慧
XU Hui
(广西分析测试研究中心 ,广西南宁　 530022)
( Guangxi Research Center of Analysis and Testing, Nanning, Guangxi , 530022, China)
摘要: 以甲醇为溶剂 ,用索式提取法提取蓝耳草 [Cyanotis vaga ( Lour. ) Roem. et Schult ]中 β -蜕皮激素 ,用高
效液相色谱法 ( HPLC)测定其含量。结果 ,β-蜕皮激素在 0. 4～ 8. 0μg范围内线性关系良好 , r2 = 0. 9992,平均
回收率为 99. 31% , RSD值均小于 3%。
关键词:高效液相色谱法　β -蜕皮激素　蓝耳草　提取工艺
中图法分类号: O657. 72, R282. 71　　文献标识码: A　　文章编号: 1002-7378( 2010) 03-0239-03
Abstract: Using methanol as the solv ent ex t raction rate, theβ-Ecdysone inCyanot is vaga ( Lour. )
Roemet Schult is ex t racted by the soxhlet ex t raction method. The content of β -Ecdysone is
determined by HPLC. A linear curv e of β-Ecdysone w as obtained in the range of 0. 4～ 0. 8μg
with r
2
equalling to 0. 9992. The average recovery w as 99. 31% w ith RSD being less than 3% .
Key words: HPLC,β -Ecdysone, Cyanotis vaga ( Lour. ) Roem. et Schult , ex t raction process
　 　 蓝 耳草 [ Cyanotis vaga ( Lour. ) Roem. et
Schult ] ,鸭趾草科植物 ,多年生披散草本 ,主要分布
在广东、广西、云南等地。蓝耳草成分复杂 ,活性成分
较多 ,β -蜕皮激素为其活性成分之一。其主要作用是
促进核酸和蛋白质的合成 ,影响糖代谢和脂类代谢 ,
免疫调节机体。高剂量的蜕皮激素能扰乱昆虫体内
的正常代谢过程 ,可用于防治害虫 ;另外蜕皮激素能
提高蟹虾的产量 ,已广泛用于养殖业。蜕皮激素又名
蜕皮甾酮 ,化学名 cholest -7-n-6-one, 2, 3, 14, 20,
22, 25-hex-ahydroxy-( 2β , 3β , 22R) [1 ]。自然界存在着
大量含蜕皮激素的植物 ,尚待人们对其进行开发利
用。关于含蜕皮激素的报道不断涌现 ,陈莉莉等 [2 ]从
漏芦中提取蜕皮甾酮 ,朱向东等 [ 3]从露水草中提取
纯化 β -蜕皮激素 ,谭梅等 [4 ]研究露水草提取物质量
标准。本文用高效液相色谱法 ( HPLC)测定蓝耳草
中 β -蜕皮激素的含量。
1　实验部分
1. 1　仪器、试剂和样品
　　电子天平 ,索式提取器 ,粉碎机 ;旋转蒸发器 ,数
显恒温水浴锅 ,超声波清洗器 ,高效液相色谱系统
( Waters ALLIAN CE 2695)配二极管阵列检测器
( Waters 2996)。
　　β -蜕皮激素标准品 ( Sigma公司出品 ) ;甲醇 (分
析纯 ,色谱纯 ) ,无水乙醇 (分析纯 ) ,超纯水 ;蓝耳草
样品。
1. 2　提取方案
1. 2. 1　不同溶剂提取
　　将蓝耳草药材于 60℃干燥 4h ,粉碎后过 40目
筛。 称取蓝耳草粉末 2份 ,每份 1g,加入甲醇、乙醇
溶剂各 100ml,超声提取 40min,提取液待用。
1. 2. 2　不同提取方法提取
　　称取干燥后的蓝耳草粉末 1g ,加入 100ml甲
醇 ,分别采用超声提取 ( 40min)、振荡提取 ( 40min)
和索式提取器加热回流至回流液无色 , 3种方法各
自所得提取液待用。
DOI : 10. 13657 /j . cnki . gxkxyxb. 2010. 03. 051
1. 2. 3　不同提取时间提取
　　称取 5份干燥后的蓝耳草粉末 ,每份 1g ,加入
100ml甲醇 ,用索式提取器回流 30min、 1h、 2h、 4h,
8h, 10h,提取液待用。
　　将上述方案中所得提取液进行抽滤后经旋转蒸
发仪减压浓缩至干 ,残渣用甲醇溶解并定容至
10ml。 经 0. 45μm微孔滤膜过滤上机测定。
1. 3　标准溶液配制
　　精密称取 0. 0200gβ -蜕皮激素标准品 ,加入甲
醇制成每 1ml含 β-蜕皮激素 0. 80mg的标准储备
液。使用时用甲醇稀释成不同浓度的标准工作液。
1. 4　色谱条件
　　 GRACE ODS C18色谱柱 ( 250mm× 4. 6mm
i. d. ) ;柱温: 26℃ ;流动相: 甲醇∶水= 40∶ 60( V /
V ,% ) ;流速: 1. 0ml /min;检测波长: 248nm。
2　结果与分析
2. 1　提取方案的确定
　　以甲醇和乙醇为溶剂提取得到 β -蜕皮激素的含
量分别为 0. 031% , 0. 035% ,用甲醇提取量比用乙
醇的高。用振荡提取法、超声提取法、索式提取法提
取得 到 β-蜕 皮激 素的 含量 分别 为 0. 029% ,
0. 034% , 0. 041% ,索式提取法提取 β -蜕皮激素最完
全。在提取时间分别为 0. 5 h、 1 h、 2 h、 3 h、 4 h、 8 h、
10 h时 ,用索式提取法提取得到 β-蜕皮激素的含量
分 别 为 0. 021% , 0. 025% , 0. 035% , 0. 041% ,
0. 041% , 0. 041% ,样品回流提取到 4h后含量基本
稳定 ,β-蜕皮激素提取比较完全。因此 ,最佳提取方
案是以甲醇为溶剂 ,用索式提取法提取 4h。
2. 2　检测波长的选择
　　在 200～ 400nm波长范围用紫外吸收光谱检测
其最大吸收波长 ,吸收曲线如图 1和图 2所示。结果
表明 ,两种流出物的紫外吸收光谱具有良好的一致
性 ,蜕皮激素对照品在 248nm处有最大吸收波长。
图 1　标准品吸收曲线
2. 3　流动相的选择
　　用不同比例的甲醇-水作为流动相进行分离 ,发
现随着流动相中甲醇用量的不断减少 ,从 70至 30
( V /V ,% )变化 ,β-蜕皮激素的保留时间不断增加 ,
相应的容量因子由 0. 46增加到 7. 4。实验选择的流
动相为甲醇∶水 = 40∶ 60( V /V ,% ) ,此时 β -蜕皮
激素的保留时间为 13. 78,峰形良好 (如图 3)。
图 2　样品吸收曲线
图 3　β-蜕皮激素标准品 ( A )与样品 ( B)的 HPLC色谱
2. 4　线性关系
　　精密吸取配制的 β-蜕皮激素标准储备液
0. 5ml, 1. 0 ml, 2. 0 ml, 5. 0 ml, 10. 0 m l至 10ml容
量瓶中 ,甲醇稀释定容至刻度。 得浓度分别为
0. 04mg /ml、 0. 08mg /ml、 0. 16mg /ml、 0. 40mg /m l、
0. 80mg /ml的系列标准工作液 ,在高效液相色谱系
统上依次进样 10μl,以 β -蜕皮激素峰面积为纵坐标 ,
进样量为横坐标 ,计算出线性方程为 y = 1002. 7x
+ 250. 22, r2 = 0. 9992。结果表明 ,β-蜕皮激素在 0. 4
～ 8. 0μg范围内与其峰面积积分值呈现出良好线性
关系。
2. 5　精密度
　　平行称取 100405号样品共 5份 ,经 60℃干燥
后碎成细粉 ,过 40目筛 ,平行称样后按 2. 1中最佳
方案提取、抽滤、减压蒸馏 ,浓缩至干 ,甲醇定容
10m l, 0. 45μm微孔滤膜过滤 ,按 1. 4中色谱条件 ,
各进样 10μl,分别测量峰面积积分值 ,计算得出蓝耳
240 广西科学院学报　 2010年 8月　第 26卷 第 3期
草 中 β-蜕 皮 激 素 的 含 量 分 别 为 0. 0369% ,
0. 0401% , 0. 0395% , 0. 0410% , 0. 0395% , RSD为
1. 61% 。
2. 6　加标回收率
　　取已知含量的样品粉末 ,加入适量 β-蜕皮激素
标准溶液 ,按索氏提取法进行操作 ,再按 1. 4中色谱
条件测定 β -蜕皮激素含量并计算得到平均回收率为
99. 31% 。
2. 7　重现性
　　精密吸取 0. 80mg /ml标准溶液 10μl,按 1. 4中
色谱条件 ,重复进样 5次 ,计算得出 RSD = 2. 0%。
2. 8　样品测定
　　将 100401、 100402、 100403、 100404、 100405、
100406、 100407、 100408这 8个不同批次的蓝耳草
粉末按精密度试验方法 ,结合标准曲线分别计算蓝
耳草中 β -蜕皮激素的含量 ,结果 (表 1)比较理想。
表 1　样品的测定结果
样品批号 含量 (% ) 样品批号 含量 (% )
100401 0. 039 100405 0. 036
100402 0. 040 100406 0. 041
100403 0. 040 100407 0. 038
100404 0. 039 100408 0. 041
3　结束语
　　本文采用振荡提取法和超声提取法提取 β-蜕皮
激素。该方法操作简单 ,提取时间短 ,但激素提取不
是很完全。由于蓝耳草成分较复杂 ,我们选用中等浓
度有机相 (如 40%甲醇水溶液 )作流动相得到了较
好的分离效果 ,以甲醇为溶剂 ,索式提取法提取蓝耳
草中 β-蜕皮激素 ,用高效液相色谱法测定其含量 ,所
得线性关系、回收率、精密度、重现性都比较满意 ,对
样品含量的测定 ,也取得了较好的结果。该结果为蓝
耳草的进一步开发利用提供了依据。
参考文献:
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[3 ]　朱向东 ,安银岭 .从露水草中提取纯化 β-蜕皮激素工艺
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[4 ]　谭梅 ,李良 ,杨建鸣 ,等 .露水草提取物质量标准的研究
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(责任编辑: 尹　闯 )　　
(上接第 238页 )
酯提取率较乙醇高 ,甲醇与乙酸乙酯提取率相当。与
甲醇相比 ,乙酸乙酯低毒、沸点低易回收 ,提取液色
素含量低 ,色谱杂质峰少 ,故本实验采用乙酸乙酯为
提取试剂。通过对提取方式 (加热回流、超声、振摇 )、
提取时间、提取温度、料液比、提取次数分别做单因
素实验 ,确定出实验方案为: 每次用乙酸乙酯 50ml
在 40℃恒温下振摇提取 30min,分别提取 3次。特别
的是白藜芦醇对光不稳定 ,其反式异构体见光后发
生异构化而形成顺式 ,因此所有操作应严格避光。
3. 3　色谱条件的选择
　　本次试验通过对色谱条件的多次筛选 ,确定选
用 Symmetry shielyTMRP18 ( 4. 6 mm× 250mm ,
5μm )作为色谱柱 ,选用乙腈-0. 2%醋酸溶液 ( 25∶
75)作为流动相。优于其他的溶液系统磷酸盐 -乙腈 ,
乙腈 -水等 ,达到更好的分离效果 ,而且能够明显改
善色谱峰脱尾现象。
参考文献:
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(责任编辑: 邓大玉 )　　
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