全 文 :位提供一个重要的有意义的定位线索。
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(收稿日期:2010 - 11 - 29 编辑:罗劲娜)
石花菜提取物对宫颈癌细胞凋亡及 Caspase - 3
活性的影响
蔡海莹
广东省潮州市潮安县人民医院妇科(515638)
【摘要】 目的 探讨石花菜提取物对宫颈癌 HeLa细胞凋亡及 Caspase - 3 活性的影响。方法 不同浓度石
花菜乙酸乙酯提取物与 HeLa细胞孵育后,MTT法检测细胞活性,Hoechst 检测细胞凋亡,以及比色法检测细胞内
Caspase - 3 活性。结果 石花菜提取物以时间及剂量依赖性的方式抑制 HeLa 细胞的生长增殖,降低细胞活性。
Hoechst33258 染色可见石花菜提取物作用后细胞核出现固缩、边集等凋亡现象。经石花菜提取物孵育,细胞内
Caspase - 3 活性也比对照组显著升高(P < 0. 05)。结论 石花菜乙酸乙酯提取物可抑制宫颈癌 HeLa细胞生长增
殖,其机制可能是增强 Caspase - 3 活性启动细胞凋亡,从而发挥其抗瘤作用。
【关键词】 石花菜;HeLa细胞;细胞凋亡;Caspase - 3
在妇科恶性肿瘤中,宫颈癌较为常见,其发病率有
升高迹象,并且有年轻化的特征,腺癌病例较以往有少
量增加。石花菜(Gelidium amansii)是红藻门石花菜科
石花菜属植物,古药典记载,其味甘咸,性寒,具有缓
泻、滋阴降火、润肺化痰、消热解毒等功效,可用于治疗
多种疾病,还具有抗病毒、防肿瘤等作用[1 - 4]。目前有
关石花菜的生物活性的研究报道不多,2009 年 9 月至
2010 年 12 月本研究采用乙酸乙酯对石花菜进行提取,
研究其产物对宫颈癌细胞(HeLa)抑制和促进凋亡的
作用,讨论石花菜的抗瘤作用。
1 材料与方法
1. 1 细胞与试剂 HeLa细胞株由汕头大学医学院分
析测试实验室馈赠。新鲜石花菜采集于汕头市南澳岛
海域;RPMI 1640 培养基及小牛血清购自 Invitrogen 公
司;噻唑蓝(MTT)为 Sigma进口分装;Caspase - 3 Color-
imetric Assay Kit(R&D 公司) ;琼脂糖及 EB 染料购自
上海生工。
1. 2 制备提取物 将石花菜洗去泥沙及附着物(用
PBS) ,先阴干然后进行粉碎,在室温下,95%乙醇浸
泡,72 h后取浸泡液,共 3 次。浸泡液合并后,用旋转
蒸发仪减压浓缩(温度 < 50℃)以去除溶剂。用蒸馏
水混悬浓缩物,乙酸乙酯萃取 3 次后合并,减压浓缩后
得提取物。
1. 3 MTT法测定药物对 HeLa细胞增殖的影响 取对
数生长期 HeLa细胞以 1 × 104·mL -1的密度接种于 96
孔板,在含 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养液条件下,
培养过夜。后分别含不同浓度石花菜乙酸乙酯提取物
(0、2. 5、5、10 mg /mL)的 RPMI 1640 培养基(含 2%小
牛血清) ,分别培养 12、24、48 h。培养终止时,每孔加
入 20 μL 5 mg /mL MTT溶液,继续培养 4 h 后,吸弃培
养基,每孔加入 200 μL DMSO溶解,混匀后酶标仪 492
nm测各孔吸光度,根据测得的 OD 值按下式计算对肿
瘤细胞活性:细胞活性(%)= 实验组 OD 值 /对照组
OD值 × 100%。
·8832· 广东医学 2011 年 9 月 第 32 卷第 18 期 Guangdong Medical Journal Sep. 2011,Vol. 32,No. 18
DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.2011.18.003
1. 4 Hoechst 检测细胞凋亡 细胞爬片后,分别含不
同浓度石花菜乙酸乙酯提取物(0、2. 5、5、10 mg /mL)
的 RPMI 1640 培养基(含 2%小牛血清) ,培养 24 h后,
4%多聚甲醛固定,0. 2% Titon X - 100 渗透 10 min,Ho-
echst33258 染色液,染色 5 mim后,PBS 洗 3 次后,60%
缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察并拍照。
1. 5 半胱天冬酶 -3(Caspase -3)活性测定 Caspase -3
活性检测采用比色法。收集各组 HeLa细胞,裂解液冰
上裂解 10 min,4℃ 15 000 × g离心 10 min,取上清按试
剂盒操作进行测定,最后在 405 nm 波长下测 OD 值。
另外取一部分上清用 BCA 法进行蛋白定量测 562 nm
波长下 OD 值。再计算 Caspase - 3 相对活性:活性 =
OD405 /OD562。
1. 6 统计学方法 采用 SPSS 17. 0 统计软件,组间比
较采用单因素方差分析。
2 结果
2. 1 石花菜提取物对 HeLa细胞增殖的影响 石花菜
提取物以时间及剂量依赖性的方式抑制 HeLa 细胞的
生长增殖,降低细胞活性。见图 1。
* 与 0 mg /mL比较 P < 0. 05
图 1 不同剂量石花菜提取物对 HeLa细胞活性的影响
2. 2 石花菜提取物对 HeLa细胞凋亡的影响 未处理
组的 HeLa细胞细胞核呈卵圆形,染色均匀(图 2A)。
2. 5 mg /mL提取物作用后可见部分细胞核荧光增强,
胞核缩小呈浓缩现象(图 2B) ;5、10 mg /mL 提取作用
后,细胞核的染色质高度凝聚、荧光显著增强,并有部
分细胞核边缘化,甚至裂解为碎块,产生凋亡小体(图
2C、D)。
A:阴性对照;B:2. 5 mg /mL 石花菜提取物作用组;C:5 mg /mL 石
花菜提取物作用组;D:10 mg /mL 石花菜提取物作用组
图 2 石花菜提取物对 HeLa细胞凋亡的影响(× 400)
2. 3 石花菜提取物对 HeLa 细胞 Caspase - 3 活性的影
响 未处理组 HeLe细胞 Caspase -3相对活性为 1. 07 ±
0. 10,2. 5、10 mg /mL 石花菜提取物作用 24 h 后,细胞
Caspase - 3 活性分别为 1. 39 ± 0. 16、1. 89 ± 0. 33 和
2. 41 ± 0. 30。处理组 Caspase - 3 活性均显著高于对照
组(P < 0. 05)。
3 讨论
目前对宫颈癌的治疗仍以手术及术后放化疗为主。
由于化疗或放疗可引起严重不良反应,不能靠大幅度增
大剂量获得理想的疗效。因此,寻找疗效好且不良反应
小的制剂成为当今医学界的主要研究课题之一。
广东属沿海省份,具有许多海产资源包括海洋植
物,石花菜就是其中之一。药典记载,其味甘咸,性寒,
具有滋阴降火、润肺化痰、消热解毒等功效,可用于治
疗多种疾病[1]。本实验表明,石花菜乙酸乙酯提取物
在体外实验中呈剂量及时间依赖性地抑制癌细胞增
殖,并可引起肿瘤细胞凋亡。其机制可能是通过增强
细胞 Caspase - 3 活性从而促进细胞凋亡。Caspase 是
一类天冬氨酸残基特异性的半胱氨酸蛋白酶,Caspase
家族被认为是与凋亡最为密切相关的一类蛋白酶,是
引起细胞凋亡的直接效应物,凋亡的大多数形态变化
是在凋亡细胞中 Caspase 特异性活化的结果[5]。目前
已发现的属于该家庭的成员有十余种,包括 Caspase -
1 ~ 10 等,而 Caspase - 3 是此家庭的重要成员,在多种
细胞凋亡时活化,是细胞凋亡中的关键蛋白酶[6]。本
实验结果显示石花菜乙酸乙酯提取物可能通过活化
Caspase - 3 启动细胞凋亡。此外,由于 Caspase对癌基
因 Bcl - 2 家族的蛋白质具有重要的酶解修饰作用[7],
因此,石花菜提取物的抗癌作用还可能是通过影响
Bcl - 2 相关的 Stat3 信号转导通路有关,但具体作用机
制需进一步实验验证。由于对石花菜提取物的相关研
究表明[8],其所含的甾体皂甙具有免疫调节及抗肿瘤
作用。本实验结果与之相符,但乙酸乙酯粗提物中成
分仍较复杂,需要进一步分离纯化其抗癌有效成分,以
期为宫颈癌治疗提供新的辅助药物。
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