全 文 ：化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
第 26 卷第 4 期
2014 年 4 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Ｒesearch and Application
Vol． 26，No． 4
Apr．，2014
文章编号:1004-1656(2014)04-0546-06
绳江蓠多糖的提取及抗氧化活性研究
田 华1，尹学琼1* ，陈 娟1，覃锦敏1，沈 琦2，杨冬云2
(1. 海南大学海南省精细化工工程技术研究中心，海南 海口 570228;
2. 海南惠普森医药生物技术有限公司，海南 海口 570216)
摘要:本文采用 NaOH水溶液对海南绳江蓠进行超声浸提制备绳江蓠粗多糖(GCP) ，通过单因素实验和正交
试验，考察得出 GCP 最佳提取工艺条件为 NaOH溶液质量浓度 1. 5%，提取温度 70℃，液料比 1 ∶40，提取时间
水浴 4h，超声 1h，提取率为 20. 01%，总糖含量为 26. 00%。对绳江蓠粗多糖进行乙醇沉降分级纯化，得到 3
种多糖组分 GCP20、GCP40、GCP50，凝胶渗透色谱结果表明三种组分数均分子量分别为 117kDa、116kDa 和
113kDa。电子自旋共振法测试 GCP20、GCP40、GCP50 对·OH 的清除活性，三种组分均有很好的自由基清除
能力，20mg·mL－1 GCP20 的羟基清除率达 81. 4%。紫外可见分光光度计在 734nm波长下测试 GCP20、GCP40、
GCP50对 ABTS+·的清除活性，浓度为 20mg·mL－1时，三种组分对 ABTS+·清除率均接近100%，表明这三种组
分均有很好的抗氧化活性。
关键词:绳江蓠;多糖提取;分级纯化;抗氧化活性
中图分类号:Ｒ 284 文献标志码:A
Extraction and antioxidant activity of polysaccharides from
Gracilaria chorda holmes
TIAN Hua1，YIN Xue-qiong1* ，CHEN Juan1，QIN Jin-ming1，SHEN Qi2，YANG Dong-yun2
(1. Hainan Provincial Fine Chemical Engineering Ｒesearch Center，Hainan University，Haikou 570228，China;
2. Hainan helpson medicine and biotechnique Co. Ltd.，Haikou 570216，China)
Abstract:Polysaccharides(GCP)were extracted from G. chorda holmes，through ultrasonic extraction in NaOH solution. The extrac-
tion conditions were optimized through single factor experiments and orthogonal experiments. The optimal extraction conditions were
NaOH solution concentration 1. 5%，the extraction temperature 70 °C，solid / liquid ratio 1 ∶40，liquid extraction 4h and subsequent
ultrasound extraction 1h，with a polysaccharide yield of 20. 01% and polysaccharide content 26. 00% . GCP was purified through
stepwise ethanol precipitation. Three components GCP20，GCP40，and GCP50 were obtained after precipitation. The molecular
weight of GCP20，GCP40，and GCP50 was 117kDa，116kDa and 113kDa，respectively. The hydroxyl radical scavenging ability of
GCP20，GCP40，and GCP50 was measured through electron spinning resonance. The scavenging ability of 20mg·mL－1 GCP20 was
81. 4% . All the three samples expressed good antioxidant activity against ABTS free radicals. The scavenging activities of 20mg·
mL－1 samples were all almost 100%.
Key words:G. chorda holmes;polysaccharide extraction;stepwiseethanol precipitation;antioxidant activity
收稿日期:2013-09-27;修回日期:2013-11-28
基金项目:海口市重点科技计划项目(2010-084)资助;海南大学青年基金项目(qnjj1221)资助
联系人简介:尹学琼(1975-) ，女，教授，主要从事生物资源开发与利用。E-mail:yxq@ hainu. edu. cn
第 4 期 田 华，等:绳江蓠多糖的提取及抗氧化活性研究
绳江蓠【Gracilaria chorda holmes】隶属红藻
门、真红藻纲、杉藻目、江蓠属，多生长在潮间带的
沙石上，或埋在沙土里，在我国的海南省乐东县一
带有分布［1］。江蓠属以“龙须菜”、“鹿角菜”、“凤
尾菜”等名称入药。古籍有记载:“味甘性寒，有软
坚化痰、清热利水的功效”［2］。江蓠中含有丰富的
硫酸酯多糖，具有抗病毒、抗凝血性、抗肿瘤性、诱
导细胞分化等多种良好的生理活性。随着人们对
多糖成分越来越深入的研究，多糖的活性也越来
越受到重视。因此，对于海藻多糖的提取及在药
物、食品、保健品方面的应用成为热点［3］。目前绳
江蓠主要作为渔业养殖饲料和食品胶原料，对其
多糖的提取分析、结构研究还比较少。本文运用
超声提取法与碱提法结合对绳江蓠多糖进行提
取，探索最佳提取工艺，进行初步结构分析以及抗
氧化活性研究，以期为绳江蓠多糖的进一步研究
及应用奠定基础。
1 实验方法
1. 1 仪器、试剂与仪器
材料:绳江蓠采自海南省万宁市南燕湾海滩，经
过洗净晒干后，剪成 1cm左右碎片，备用。鉴定为红
藻门真红藻纲杉藻目江蓠属绳江蓠【G. chorda
Holmes】。
试剂:NaOH、浓硫酸、苯酚、无水乙醇、硫酸亚
铁、氯仿、正丁醇、双氧水、5，5-二甲基-吡咯啉-N-
氧化物(DMPO，阿拉丁)均为分析纯。
仪器:HH-4恒温水浴锅(盛蓝仪器制造有限
公司) ;FD-1E 冷冻干燥机(北京德天佑科技发展
有限公司) ;T6 新锐可见分光光度计(北京普析通
用仪器有限责任公司) ;KQ3200B 超声波清洗仪
(昆山市超声仪器有限公司) ;Paragon 1000 傅里
叶红外光谱仪扫描(美国 PE 公司) ;1515GPC 凝
胶渗透色谱(美国 Waters公司) ;A320 电子自旋共
振仪(德国 Bruker公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 多糖提取［4-5］ 称取绳江蓠碎片 2g，分别
加入 80mL去离子水或 NaOH溶液，70℃恒温水浴
4h，再在 70℃超声提取 1h，抽滤。滤液浓缩至
30mL，加入 30mL Sevage 试剂(氯仿-正丁醇体积
比为 4 ∶1的混合液，现配现用)除去蛋白质。剧烈
振摇 15min，静置 30min，弃去有机溶剂层和蛋白
质层。再加入 30mL Sevage 试剂，重复以上操作，
直至其没有白色的蛋白质层为止。旋蒸分离氯仿
后，用截留分子量 3 500 的透析袋透析 3 天，旋蒸
浓缩至 20mL，冷冻干燥得绳江蓠粗多糖(GCP)。
1. 2. 2 绳江蓠粗多糖含量测定［6］ 以苯酚-硫酸
法检测多糖含量:精密称取 20mg 葡萄糖，定容至
500mL容量瓶中，配制成 0. 04mg·mL－1的葡萄糖
标准溶液。依次取标准溶液 0. 4mL、0. 6mL、
0. 8mL、1. 2mL、1. 4mL、1. 6mL、1. 8mL 加入到试管
中，用去离子水补充至 2mL，以去离子水为空白。
各试管中分别加入 6%苯酚溶液 1mL，摇匀，迅速
加入 5mL浓硫酸，振荡，使反应完全。室温下放置
30min后，在 490nm波长处测定吸光度，得线性回
归方程为:y = 13. 937x －0. 0071，Ｒ2 = 0. 9971。取
0. 025mg·mL－1多糖样品溶液 1mL，按照上述步骤
操作，测定吸光度，以标准曲线计算多糖含量。
多糖提取率(%)= 多糖质量 /原料质量 ×
100%
1. 2. 3 绳江蓠粗多糖分步醇沉纯化［7］ 称取 2g
绳江蓠粗多糖溶解于 80mL蒸馏水中，根据糖溶液
体积加入无水乙醇，使溶液中乙醇体积分数为
20%。4℃静置 1h，离心，收集沉淀。在上清液中
继续加入无水乙醇，依次类推，使乙醇的体积分数
分别为 30%、40%、50%、60%、70%。分别收集各
部分沉淀，干燥得精多糖，备用。准确称量各部分
沉淀质量，计算精多糖收率。
1. 2. 4 结构分析 取 1. 2. 3 中所得精多糖 2mg，
配制成 2mg·mL－1多糖溶液，以高效凝胶渗透色谱
(GPC)鉴定多糖纯度和测定分子量。仪器参数:
Waters 泵 1515，示差检测器 2414;色谱柱:Ultra-
hydrogelTM500，UltrahydrogelTM120，分子量范围
100 ～ 40 万双柱串联;柱子填料:羟基化的聚甲基
丙烯酸甲酯;柱温:45℃;检测器温度:40℃;流动
相:0. 05%迭氮化钠水溶液;流速:0. 6mL·min－1;
时间:40min;进样量:10μL，手动进样。
采用 KBr 压片法在 Paragon 1000 傅里叶红外
光谱仪(FTIＲ)上对多糖进行红外光谱测定，波长
范围在 4 000 ～ 400cm－1。
1. 2. 5 羟基自由基清除率测试［8］ 将 50μL 1%
多糖样品或者作为对照的等体积双蒸水，50μL
0. 05mol·L－1的 PBS 溶液(pH = 7. 4)加入到 50μL
0. 3mol·L－1 DMPO(5，5-二甲基-1-吡啶-N-氧化物)
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化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
溶液和 50μL 10mmol·L－1硫酸亚铁，再加入 50μL
10mmol·L－1过氧化氢溶液启动反应，将反应混合
液吸入毛细管中。2. 5min 后用 Brucker A320 ESＲ
光谱仪记录 ESＲ图谱。
测试条件为:中心磁场(CF) :3512. 3G;扫描
宽度(SW) :200G;扫描时间(ST) :15. 36S;调制幅
度(MA) :3. 0G;调制频率(MF) :100KHz;微波频
率:(MF)9. 863GHz;微波功率(MP) :20. 0mW;测
试温度(T) :室温。
精多糖溶液对羟基自由基的清除作用以清除
率(%)表示，计算公式为:
清除率(%)=
H0 － Hx
H0
× 100
式中:H0 和 HX 分别为样品不添加和添加多
糖时 ESＲ图谱第二峰信号强度(高度)。
1. 2. 6 ABTS+·清除率测试［9］ ABTS 是 2，2-连
氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸) ，经活性
氧氧 化 后 生 成 稳 定 的 蓝 绿 色 阳 离 子 自 由
基 ABTS+·，被测物质加入ABTS+·溶液后，所含抗氧
化成分能与 ABTS+·发生反应而使反应体系褪色，引
发特定波长段的吸光值的变化，从而测定 ABTS自由
基清除能力的大小。配制 ABTS+·储备液:用
2. 45mmol·L－1过硫酸钾溶解 ABTS，定容至 100mL，配
制成 7mmol·L－1ABTS+·储备液，室温下，避光静置 12
～16h。配制 ABTS+·测定液:用磷酸盐缓冲溶液
(10mmol·L－1，pH 7. 4)稀释 ABTS+·储备液，使其
吸光度在 734nm波长处达到 0. 700±0. 020。样品
测定:取 4mL ABTS+·测定液，加入 40μL样品待测
液，准确振荡 30s，测定反应一定时间后 734nm 波
长处的吸光度。
多糖溶液对 ABTS+·清除作用以清除率(%)
表示，计算公式为:
清除率(%)=(1 － Ax0. 700
)×100
其中 Ax 为样品待测液的吸光度。
2 结果与讨论
2. 1 单因素实验［10］
2. 1. 1 NaOH溶液质量浓度的影响 在料液比为
1 ∶40，温度 70℃，恒温水浴 3h，超声辅助提取 1h的
条件下。分别用质量分数为 1. 0%、1. 5%、2. 0%、
2. 5%的氢氧化钠溶液和去离子水提取绳江蓠粗
多糖(GCP) ，考察 NaOH 溶液质量浓度对多糖提
取率的影响，结果如图 1 所示。
图 1 碱浓度对绳江蓠多糖提取率的影响
Fig. 1 The effects of NaOH concentration on GCP yield
从图 1 中可以看出去离子水所提取的绳江蓠
粗多糖提取率最低，只有 2. 54%;而在同等条件
下，氢氧化钠水溶液质量浓度为 1%时，GCP 提取
率最高，为 17. 77%。这可能是因为绳江蓠粗多糖
大部分为酸性多糖，稀碱液有利于其溶出［10］。当
浓度从 1%增加到 1. 5%、2%、2. 5%时，产率不增
反减，这可能是因为碱液浓度增大，会导致绳江蓠
多糖降解［12］。
2. 1. 2 提取温度的影响 当料液比 1 ∶40，碱质量
浓度为 2. 0%，提取时间为恒温水浴 3h，超声辅助
提取 1h，提取温度分别为 50℃、60℃、70℃、80℃、
90℃时，对 GCP 提取率的影响如图 2 所示。
图 2 提取温度对绳江蓠多糖提取率的影响
Fig. 2 The effects of extraction temperature on GCP yield
从图 2 可以看出随着温度的升高多糖的提取
率逐渐增加，温度到 70℃时，GCP 提取率最大，达
9. 47%，之后温度升高，产率反而降低，可能是因
为在碱液条件下，过高温度导致多糖的降解，在后
续分离中多糖易丢失所致。
2. 1. 3 料液比的影响 在温度 70℃，恒温水浴
3h，超声辅助提取 1h，NaOH 质量浓度为 2. 0%条
件下，料液比分别为 1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50 时，料
液比对提取率的影响如图 3 所示。
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第 4 期 田 华，等:绳江蓠多糖的提取及抗氧化活性研究
图 3 液料比对绳江蓠多糖提取率的影响
Fig. 3 The effects of solid / liquid ratio on GCP yield
从图 3 中可以看出，当料液比为 1 ∶30 时，GCP
提取率最高，为 9. 47%，随料液比增大，提取率反
而降低，当料液比为 1 ∶ 50，GCP 提取率降至
7. 26%。过高的料液比导致后续分离纯化困难，
在透析除盐前需要长时间旋蒸脱水，此过程中可
能存在多糖降解，致使透析中糖流失，收率下降。
2. 1. 4 提取时间的影响 当料液比 1 ∶40，温度
70℃，NaOH浓度为 2. 0%，提取时间分别为 3+1h、
4+1h、5+1h、6+1h(提取时间为恒温水浴的时间加
超声辅助提取的时间)时，提取率结果如图 4 所
示。
图 4 提取时间对绳江蓠多糖提取率的影响
Fig. 4 The effects of extraction time on GCP yield
由图 4 可知，刚开始多糖提取率随时间增加
而增大，当提取时间为 4+1h 时，GCP 的提取率最
高，为 15. 85%，而在 5+1h 以后，提取率随时间增
加而减弱。因此，提取时间控制在 4 +1h 左右为
宜。
2. 2 正交实验［13］
在单因素实验的基础上，进行四因素三水平
正交实验，选取 NaOH 浓度、液料比、提取时间、提
取温度为考察因素，分别选择三个研究水平，采取
L9(3
4)正交实验，正交实验因素水平表如表 1，正
交实验结果如表 2 所示。
表 1 正交实验因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal test
水平
因素
NaOH浓度
/%(A)
液料
比(B)
时间
/h(C)
温度
/℃(D)
1 1. 0 1 ∶30 3+1 60
2 1. 5 1 ∶40 4+1 70
3 2. 0 1 ∶50 5+1 80
* :3+1 为碱提 3 小时，超声提取 1 小时，其余类同。
表 2 正交实验结果
Table 2 Ｒesults of the orthogonal test
组别
因素
A B C D 产率 /%
1 1 1 1 1 12. 19
2 1 2 2 2 19. 13
3 1 3 3 3 8. 20
4 2 1 2 3 12. 84
5 2 2 3 1 14. 81
6 2 3 1 2 15. 25
7 3 1 3 2 9. 05
8 3 2 1 3 9. 89
9 3 3 2 1 11. 72
K1 39. 52 34. 08 37. 33 38. 72
K2 42. 90 43. 83 43. 69 43. 43
K3 30. 66 35. 17 32. 06 30. 93
k1 13. 17 11. 36 12. 44 12. 91
k2 14. 30 14. 62 14. 56 14. 48
k3 10. 22 11. 72 10. 69 10. 31
Ｒ 4. 08 3. 26 3. 87 4. 17
影响主次
顺序
提取温度＞氢氧化钠浓度＞提取时间＞液料比
优水平 1. 5% 1 ∶40 4+1h 70℃
优组合 A2B2C2D2
由表 2 可知，NaOH溶液浓度和提取温度对绳
江蓠多糖提取的影响较大，各因素作用的主次顺
序依次为:提取温度＞氢氧化钠浓度＞提取时间＞液
料比。综合考虑绳江蓠多糖的最佳提取条件应
为:1. 5%的 NaOH溶液，液料比 1 ∶40，在 70℃恒温
水浴 4h再 70℃超声 1 h。以最佳提取条件提取绳
江蓠多糖，粗多糖提取率达 20. 01%，总糖含量为
26. 00%。
实验中用不同浓度的 NaOH 溶液和去离子水
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化 学 研 究 与 应 用 第 26 卷
作为溶剂，提取绳江蓠细胞中多糖，碱液对细胞壁
上的多糖起到了有效的溶出作用。但考虑到碱液
对多糖有一定降解作用，实验中，应对 NaOH 溶液
浓度、浸提时间和温度等因素进行综合考虑，按最
佳提取工艺操作，以获得最大的提取率;在提取结
束时，应尽快通过中和、醇沉或者透析等方法减少
碱液对多糖的降解作用。
2. 3 绳江蓠多糖的分级纯化
为了对绳江蓠多糖进行纯化，本文采用不同
浓度乙醇进行分步醇沉，以 20%、40%、50%乙醇
沉淀得绳江蓠多糖各组分 GCP20、GCP40、GCP50，
收率分别为 25%、20%、10%，剩余部分是色素等
杂质以及分子量更低、含量较少的多糖组分。图 5
为 GCP20、GCP40、GCP50 的 GPC 分布图，表 3 为
绳江蓠多糖各组分的分子量数据。
图 5 绳江蓠多糖的 GPC分布图
Fig. 5 The GPC distributions of GCP
表 3 绳江蓠多糖各组分 GPC测试结果
Table 3 GPC data of GCP20，GCP40 and GCP50
乙醇浓度 /% 组分命名 Mn Mw PI*
20 GCP20 117 094 179 699 1. 53
40 GCP40 115 829 170 317 1. 49
50 GCP50 113 519 167 192 1. 47
* :PI=Mw /Mn
由表 3 可知，GCP20 的数均分子量(Mn)约为
117 kDa，GCP40 的Mn约为 116 kDa，GCP50 的Mn
约为 113 kDa。由于大分子量的糖在低浓度的乙
醇中易沉淀出来，小分子量的糖在高浓度乙醇中
易沉淀出来，随着乙醇浓度增加，所沉淀的多糖分
子量逐渐降低。这三种多糖组分的多分散系数 PI
均小于 2，说明分子量分布较均匀［14］。
2. 4 红外光谱图
图 5 中 GCP 三种分级多糖的红外光谱图无明
显差异，均表现出了糖类物质的特征吸收
峰［15］:3 442cm－1 处出现的宽频强吸收谱带为糖分
子中的 O-H伸缩振动，表明多糖存在分子间和分
子内氢键。2 926cm－1 附近处的吸收峰，是多糖分子
C-H伸缩振动引起的。1 418cm－1 的吸收峰可认为
是分子中 CH2 剪切振动产生的。将 GCP 经酸化处
理后在 1 720cm－1 左右无吸收峰，说明该糖没有羧
基存在。1 260cm－1 处出现硫酸基(-O-SO3H)中 S =
O的伸缩振动峰，表明样品为硫酸多糖。1 032cm－1
处为吡喃环结构的 C-O伸缩振动峰，该吸收峰的存
在说明样品主要为吡喃多糖，819cm－1 左右的吸收
峰则可以判断存在 α-糖苷键，红外图分析得出 GCP
为含硫酸基团的酸性吡喃多糖。
图 6 GCP 红外光谱图( a: GCP20、b: GCP40、c: GCP50)
Fig. 6 Infrared spectra of GCP( a: GCP20、
b: GCP40、c: GCP50)
2. 5 羟基自由基清除率
本文采用电子自旋共振法(ESＲ 法)测量了
GCP20、GCP40、GCP50 对 FeSO4-H2O2 产生的·OH
的清除活性，以蒸馏水为参照，结果如表 4 所示。
表 4 绳江蓠多糖各组分羟基清除率
Fig. 4 The·OH Scavenging ability of different
polysaccharide fractions
浓度 /mg·mL－1 GCP20 /% GCP40 /% GCP50 /%
5 54. 20 53. 72 44. 07
10 64. 29 61. 42 61. 38
20 81. 37 76. 95 78. 11
由表 4 可知，GCP20、GCP40、GCP50 都有很明
显的抗氧化活性。结果显示绳江蓠多糖对·OH 清
除能力呈现剂量效应关系。在浓度为 5mg·mL－1和
10mg·mL－1时，随分子量降低，多糖对·OH 的清除
能力有所减弱，而浓度在 20mg·mL－1时，多糖对·
OH清除能力开始随着分子量的降低而减弱，之后
又有所升高。海藻多糖的分子量、硫酸根含量、硫
酸根取代位置和糖醛酸含量对多糖清除自由基活
性均有很大的影响，GCP 为含硫酸根海藻多糖，其
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第 4 期 田 华，等:绳江蓠多糖的提取及抗氧化活性研究
对自由基的清除机理需在对结构活性关系进行深
入研究基础上再进一步分析确定［16］。
2. 6 ABTS+·清除率
采用分光光度法测试了 GCP20、GCP40、
GCP50 对 ABTS+·清除活性，结果如图 7 所示。
图 7 不同分子量多糖清除 ABTS+·能力
Fig. 7 The ABTS+·scavenging activity of different
polysaccharide fractions
从上图中可以看出 GCP20、GCP40、GCP50 对
ABTS+·清除率均随浓度增加而增大，这 3 种组分均
有很明显的抗氧化活性。当多糖浓度从 1mg·mL－1
增加到 10mg·mL－1时，各样品对 GCP20、GCP40、
GCP50 的清除活性均有所增加，GCP20、GCP40、
GCP50 的清除率分别由 16. 86%，18. 71%，18. 86%
增大到 85. 14%，86. 14%，86. 86%，当三种组分的浓
度为 20mg·mL－1时，对 ABTS+·清除率均接近100%。
结果显示这三种组分对 ABTS+·清除率无很明显差
异，GPC20的抗氧化性略强于 GCP40、GCP50。GCP
对 ABTS+·的清除活性与对·OH 的清除活性2. 5 一
致，进一步表明 GCP 具有较好抗氧化活性。
3 结 论
本文采用超声波辅助碱提法提取绳江蓠多
糖，通过单因素实验和正交试验，确定了最佳工艺
条件，硫酸苯酚法测得总糖含量为 26. 00%。乙醇
分步醇沉得到 3 种纯度较高的多糖组分。该绳江
蓠多糖为含有硫酸基团的酸性吡喃糖。用两种方
法证实其具有良好的抗氧化活性，随多糖浓度升
高，对·OH 和 ABTS+·清除率明显上升，清除率呈
剂量效应关系。活性多糖的理化性质及结构是其
具有生物活性的基础，多糖的分子量、化学成分含
量以及单糖组成都可能导致绳江蓠多糖不同的生
物活性［17］。绳江蓠具有良好开发前景，未来还须
对绳江蓠多糖化学结构及其他生物活性进行深入
研究，从而为开发多糖产品提供更多理论依据。
参考文献:
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( 责任编辑 罗 娟)
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