全 文 ：王跃华，段茂华，任三军，等． 山葵愈伤组织诱导与增殖研究［J］． 江苏农业科学，2015，43(1):53 － 54．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2015． 01． 016
山葵愈伤组织诱导与增殖研究
王跃华1，段茂华1，任三军2，陈传凤1，彭 双1，严幸林1，孙燕霞1
(1．成都大学生物产业学院，四川成都 610016;2．广元市玺府开发有限公司，四川广元 648017)
摘要:为了获得山葵愈伤组织诱导和增殖的最佳培养条件，选择山葵真叶片、真叶柄和胚轴为外植体，以 MS为基
本培养基，配以不同浓度的 2，4 － D和 6 － BA植物激素进行愈伤组织诱导，并将诱导的愈伤组织接种于增殖培养基中
进行培养。结果表明:诱导山葵愈伤组织的最佳培养基配方为 MS + 4 mg /L 2，4 － D + 0． 5 mg /L 6 － BA，培养 25 d后真
叶片、真叶柄、胚轴的愈伤组织诱导率分别为(100． 0 ± 0． 00)%、(60． 5 ± 3． 29)%、(62． 5 ± 3． 74 )%;山葵胚轴外植体
产生的愈伤组织增殖倍数最高，培养 35 d后的愈伤组织增殖倍数可达(2． 48 ± 0． 93)倍。
关键词:山葵;愈伤组织;配方;外植体;诱导率;增殖倍数
中图分类号:S567． 23 + 9． 043 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2015)01 － 0053 － 02
收稿日期:2014 － 03 － 04
基金项目:四川省广元市科技支撑计划(编号:2013 － 25)。
作者简介:王跃华(1963—)，女，山东青岛人，硕士，教授，主要从事药
用植物栽培与生药学研究。E － mail:1961689636 @ qq． com。
山葵(Wasabia japonica)别称山嵛菜，为十字花科山嵛菜
属多年生草本半阴生植物，原产中国和日本，被誉为“绿色黄
金”［1 － 2］。山葵具有强烈的辛辣味及特殊的芳香，不仅具有很
强的杀菌和助消化功能［3］，而且能促进淀粉性食物的消化，
稳定胃肠中的维生素 C和消灭消化道中的寄生虫，具有很好
的防病治病作用［4 － 5］。目前山葵多采用分株繁殖和种子繁
殖，分株繁殖存在品种退化、繁殖系数低和种苗带菌等问题，
极易导致病害大面积发生［6］。种子繁殖具有速度快、数量多
和能部分减少病害发生的特点，但是由于山葵种子属顽拗性
种子，失水过多极易导致种子活力丧失，因此常采用低温高湿
保存;同时，山葵种子存在休眠，需有效破除休眠才能促使种
子尽快萌发［7 － 9］。本研究采用植物组培快繁技术，通过筛选
培养基配方和外植体种类，以获得山葵愈伤组织诱导的最佳
条件，为山葵后续的生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
山葵种子采自四川省广元市;试验材料山葵植物的真叶
片、真叶柄、胚轴外植体均取自山葵种子萌发所得的幼苗。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 外植体消毒和培养 选取山葵种子萌发 25 d 的幼
苗，取其真叶片、真叶柄和胚轴外植体，将其放在超净工作台
上用浓度为 0． 1 g /L的氯化汞消毒处理 3 min后，用无菌水清
洗 5 次，再用无菌滤纸吸干材料表面的水分，将其接入愈伤组
织诱导培养基中。
1． 2． 2 培养基和培养条件 愈伤组织诱导培养基以 MS 为
基本培养基，激素 6 － BA 的浓度均为 0． 5 mg /L，2，4 － D 的浓
度设定为 0、2、4、6、8 mg /L，分别记作 A1、A2、A3、A4、A5 处理;
在 20 ℃、12 h /d的光照时长、2 000 lx的光照强度条件下培养
25 d后统计各外植体的愈伤组织诱导率。
1． 2． 3 不同外植体诱导的愈伤组织增殖 选取由山葵真叶
片、真叶柄、胚轴外植体诱导产生的愈伤组织，接种于 MS +
2 mg /L NAA +0． 3 mg /L 6 － BA培养基中，分别记作 B1、B2、
B3 处理，在 20 ℃、10 h /d光照时长、1 800 lx的光照强度条件
下增殖培养 35 d后统计其愈伤组织的增殖倍数。
1． 3 数据统计及计算公式
上述试验均重复 3 次，数据用 SPSS 13． 0 统计学软件进
行方差分析，并采用新复极差(Duncans)法进行多重比较，
P ＜ 0． 05 为显著性差异，P ＜ 0． 01 为极显著性差异，数据统计
结果以“x ± s”表示。愈伤组织的诱导率、增殖倍数的计算公
式如下:愈伤组织诱导率 =(诱导出愈伤组织的外植体数 /接
种的外植体数)× 100%;愈伤组织的增殖倍数 = 收获时质
量 /接种时质量。
2 结果与分析
2． 1 山葵不同部位外植体的愈伤组织诱导
由表 1 可知，随着 2，4 － D 浓度增高，山葵真叶片、真叶
柄、胚轴的愈伤组织诱导率均呈现先提高后降低的趋势;其中
未添加 2，4 － D 激素的 A1 处理，即培养基配方为 MS +
0 mg /L 2，4 － D + 0． 5 mg /L 6 － BA，均不适宜山葵各外植体的
愈伤组织诱导，3 种外植体的愈伤组织诱导率均为最低，真叶
片的愈伤组织诱导率为(37． 5 ± 2． 73)%，真叶柄为(0． 0 ±
0. 00)%，胚轴为(0． 0 ± 0． 00)%。由此说明，在培养基中添
加生长素 2，4 － D对山葵愈伤组织的诱导非常重要。培养基
配方为 MS +4 mg /L 2，4 － D + 0． 5 mg /L 6 － BA的 A3 处理，
最适宜 3 种外植体的愈伤组织诱导，愈伤组织的诱导率均为
最高，真叶片的愈伤组织诱导率为(100 ± 0． 00)%，真叶柄为
(60． 5 ±3． 29)%，胚轴为(62． 5 ±3． 74)%。然而，随着 2，4 － D
浓度进一步升高到 6 mg /L 以上时，山葵各外植体的愈伤组织
诱导率均呈现出下降趋势，以 2，4 － D 浓度升高到 8 mg /L 时
的各外植体愈伤组织诱导率下降最为显著，其中真叶柄外植
体的愈伤组织诱导率降低了 35． 5 百分点，表明针对不同的植
物，选择适宜的 2，4 － D浓度显得尤为重要。
—35—江苏农业科学 2015 年第 43 卷第 1 期
表 1 山葵不同部位外植体的愈伤组织诱导
处理编号
激素浓度配比(mg /L) 愈伤组织诱导率(%)
2，4 － D 6 － BA 胚轴 真叶片 真叶柄
A1 0 0． 5 0． 0 ± 0． 00 37． 5 ± 2． 73 0． 0 ± 0． 00
A2 2 0． 5 25． 0 ± 2． 34 87． 5 ± 2． 16 12． 5 ± 1． 78
A3 4 0． 5 62． 5 ± 3． 74 100． 0 ± 0． 00 60． 5 ± 3． 29
A4 6 0． 5 50． 2 ± 1． 57 87． 5 ± 1． 75 37． 5 ± 2． 13
A5 8 0． 5 37． 5 ± 1． 63 62． 5 ± 1． 26 25． 0 ± 1． 46
在试验中观察各外植体产生愈伤组织的情况，发现真叶
片外植体在接种 3 d后叶片开始卷曲，并且真叶片切口处开
始变为嫩绿色且增厚，随后在切口和叶脉处都开始产生黄绿
色的愈伤组织;试验中无论是将真叶片正接或反接到培养基
上，愈伤组织最先在叶片的切口和与培养基接触的一面长出
浅绿色颗粒状愈伤组织，而叶片的游离面产生愈伤组织的时
间较晚，并且产生的愈伤组织颜色也多为绿色。真叶柄外植
体在插入培养基中培养 4 d后，其游离端出现膨大，随后膨大
明显并胀裂表皮，接着从表皮的内层细胞长出浅黄色愈伤组
织;而将真叶柄直接平放在培养基上的处理，其真叶柄是从中
间开始产生膨大，最后整个叶柄膨大后也发生胀裂表皮的情
况，随后也从表皮里面产生出愈伤组织。胚轴外植体正接和
反接的情况一样，均是先从培养基上部的游离端长出黄绿色
和浅黄色颗粒状愈伤组织;而直接将胚轴平接于培养基中则
是从胚轴两端长出黄绿色愈伤组织，随后整个胚轴愈伤化，长
出愈伤组织。
2． 2 山葵不同部位愈伤组织的增殖
将培养生长 25 d的上述各愈伤组织接种于 MS + 2 mg /L
NAA +0． 3 mg /L 6 － BA 培养基中，在 20 ℃、10 h /d 光照时
长、1 800 lx光照强度条件下增殖培养 35 d 后统计其愈伤组
织的增殖倍数(表 2)。
表 2 不同外植体愈伤组织的增殖
处理
编号
愈伤组
织来源
增殖倍数 生长状况
B1 真叶片 0． 86 ± 1． 24 质地紧密;深绿色和褐色，褐变严重
B2 真叶柄 1． 57 ± 1． 15 质地较疏松;黄绿色和黄褐色，少量褐变
B3 胚轴 2． 48 ± 0． 93 质地较紧密;黄绿色和浅绿色，无褐变
由表 2 愈伤组织的增殖倍数和生长状况可知，由胚轴外
植体产生的愈伤组织的继代增殖效果最好，在增殖培养 35 d
后，其愈伤组织的增殖倍数可达(2． 48 ± 0． 93)倍，并且增殖
产生的愈伤组织多为浅绿色和黄绿色，未出现有愈伤组织褐
变的情况。真叶柄外植体产生的愈伤组织增殖倍数为
(1． 57 ± 1． 15)倍，增殖培养的愈伤组织多为黄绿色，但也有
少量的愈伤组织产生了褐变并呈现为黄褐色。真叶片外植体
产生的愈伤组织在继代增殖生长过程中，不仅生长速度慢，愈
伤组织的增殖倍数低，仅为(0． 86 ± 1． 24 )倍，而且愈伤组织
在增殖生长过程中易产生褐化，非常不利于愈伤组织的快速
增殖生长。
3 结论与讨论
本试验采用山葵的真叶片、真叶柄、胚轴为外植体，在添
加了不同浓度的 2，4 － D生长激素的 MS培养基中诱导愈伤，
获得了适宜山葵 3 种外植体的愈伤组织诱导的最佳培养基配
方，即 MS +4 mg /L 2，4 － D + 0． 5 mg /L 6 － BA;通过增殖培养
研究，表明由胚轴外植体产生的愈伤组织继代生长速度最快，
增殖倍数最高。通过对不同外植体的诱导比较，发现真叶片
外植体的愈伤组织诱导率明显地高于真叶柄、胚轴的外植体，
然而在后续愈伤组织增殖生长过程中，真叶片愈伤组织的生
长速度却最慢，增殖倍数也最低。组成真叶片外植体的细胞
组织在适宜的激素配比条件下，易成功脱分化进而产生愈伤
组织，但又由于其产生的愈伤组织细胞中含有较高的多酚类
物质，造成在后续愈伤组织的增殖过程中极易发生氧化。因
而在山葵真叶片诱导的愈伤组织增殖培养过程中，常出现增
殖材料的严重褐变，使得山葵愈伤组织在大量增殖过程中由
于严重褐变而造成增殖材料的增殖倍数明显降低。
防止培养的细胞产生褐变可从外植体的选择、在培养基
中添加抗褐化物质以及改变培养条件等多个途径实现。笔者
针对山葵真叶片愈伤组织易产生褐变的问题，采用了低培养
温度的方法(另一篇论文报道)，收到了很好的试验效果。这
主要是因为低温可有效地降低愈伤组织细胞中多酚氧化酶的
活性并抑制酚类化合物被氧化［10 － 11］，从而很好地解决了山葵
愈伤组织产生褐变的问题。
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