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孔石莼水相提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用研究



全 文 : 
第45卷 第1期 
2015年1月
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERSITY OF CHINA
45(1):030~034
Jan.,2015
孔石莼水相提取物对黄嘌呤氧化酶活性
的抑制作用研究

焉翠蔚,常 宝,李 晶,田友昊
(中国海洋大学海洋生命学院,山东 青岛266003)
摘 要: 孔石莼新鲜藻体经低温干燥、乙醇浸提、旋转蒸发得到浸提物,再依次用乙酸乙酯、乙醚萃取,得到孔石莼水相提
取物。在25℃,pH=7.5的K2HPO4-KH2PO4 缓冲体系中,研究孔石莼水相提取物对黄嘌呤氧化酶活力的抑制作用。结
果表明,孔石莼水相提取物对黄嘌呤氧化酶有明显的抑制作用,其IC50为0.58mg/mL。进一步动力学分析表明,孔石莼水
相提取物对黄嘌呤氧化酶为反竞争性可逆抑制作用,抑制常数KIS为0.40mg/mL。联合抑制作用研究发现,孔石莼水相提
取物和别嘌呤醇为弱协同作用。
关键词: 孔石莼水相提取物;黄嘌呤氧化酶;抑制作用;弱协同作用
中图法分类号: Q533     文献标志码: A     文章编号: 1672-5174(2015)01-030-05
   基金项目:青岛市科技计划基础研究项目(11-2-4-1-(9)-gch);国家海洋局海洋活性物质与现代分析技术重点实验室开放基金项目(MBSMAT-
2012-05)资助
收稿日期:2013-10-11;修订日期:2013-11-28
作者简介:焉翠蔚(1963-),女,教授。E-mail:cuiweiyan@ouc.edu.cn
  黄嘌呤氧化酶(XO,EC 1.1.3.22)广泛存在于动
物、细菌及人体中,是核酸代谢的关键酶[1]。XO能催
化黄嘌呤和次黄嘌呤氧化生成尿酸,同时产生过氧化
物自由基,尿酸浓度过高将导致高尿酸血症,可进一步
引起痛风发作[2]。尿酸盐在关节和肾脏处的过度积
累,将导致痛风性关节炎和肾结石。同时,研究表明,
持续性的高尿酸血症会导致高血压、糖尿病和心脏病
的发生[3]。XO抑制剂可通过抑制XO的活性,减少黄
嘌呤及次黄嘌呤向尿酸盐的转化,从根本上减少尿酸
的生成,从而达到治疗痛风的目的。
别嘌呤醇是一种人工合成的XO抑制剂,是目前国
内外治疗慢性痛风的首选药物[4],它作为一种嘌呤类
似物,对XO具有竞争性抑制作用。但别嘌呤醇具有耐
受性低及易引发过敏反应等副作用,严重者可引发肾
衰竭[5],其临床应用的安全性问题引起了人们的高度
重视。因此,近年来从生物材料中寻找新型、安全、无
毒副作用的XO抑制剂成为人们的研究热点。目前,对
生物来源的抑制剂研究主要集中在植物提取物方面,
特别是对中药复方成分的研究[6-9]。然而,对于海洋生
物提取物的研究却非常少[10]。
孔石莼(Uiva pertusa)是一种大型绿藻,含有丰富
的蛋白质、多糖、脂肪酸和无机微量元素,具有降血脂、
抗病毒、抗氧化以及克生作用[11]。近年来,有关孔石莼
水相提取物在医药、水产养殖和功能食品方面的研究
较多[12-14],但对XO抑制作用的研究却未见报道,本实
验研究了孔石莼水相提取物对XO的抑制作用和动力
学特征,为开发安全、新型的XO抑制剂提供理论指导。
1 材料与方法
1.1材料
孔石莼新鲜藻体采集于青岛市太平角,用蒸馏水
冲洗多次,洗去附带的海水和杂质,用恒温干燥箱低温
烘干至恒重,然后用料理机粉碎,过80目筛,放入密封
袋内备用。
1.2试剂和仪器
试剂 黄嘌呤(Sigma公司);黄嘌呤氧化酶(Sigma
X1875);别嘌呤醇(Alopurinol,上海宝曼生物科技有
限公司);其它实验试剂均采用国产分析纯,实验用水
为重蒸水。
仪器 DF-101S集热式磁力搅拌器;HC-3018R高速冷
冻离心机;FA1004型电子天平;UV2800型紫外可见
分光光度计;E5220型旋转蒸发仪。
1.3方法
1.3.1孔石莼水相提取物的制备  称取孔石莼藻粉
10g,以1∶8的料液比,加入90%乙醇,经超声波破碎
仪破碎10min,于65℃磁力搅拌4.5h,重复浸提2次,
合并浸提液,旋转蒸发除去乙醇,然后依次用乙酸乙
酯、乙醚分液萃取,去除乙酸乙酯和乙醚萃取液,得下
层水相部分,再经减压浓缩、冷冻干燥,得到0.948g浸
膏,用蒸馏水配成100mg/mL溶液备用,再根据所需浓
度进行稀释。
1.3.2孔石莼水相提取物对XO活力的影响  酶活
1期 焉翠蔚,等:孔石莼水相提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用研究
力的测定是依据XO催化底物黄嘌呤氧化产生尿酸,尿
酸在294nm波长处有最大的吸收峰。参照文献[15]
的方法,实验分为4个处理,按表1顺序加入药品。
表1 酶测活体系的组成
Table 1 The composition of enzyme reaction system/mL
处理Treatment  1  2  3  4
0.2mol/L PBS  2.6 2.8 2.8 3.0
孔石莼提取物
Extracts fromUiva Pertusa
0.2  0  0.2  0
4μg/mL XO  0.2 0.2  0  0
0.6mmol/L黄嘌呤(25℃预保温)
0.6mmol/L xanthine
(Pre-incubation at 25℃)
2.0 2.0 2.0 2.0
注:PBS,孔石莼提取物,XO混合均匀,25℃恒温水溶15 min。PBS,Ex-
tracts from Uiva pertusa,XO,uniform mixing,in 25℃constant tempe-
rature water bath for 15min.
  混合均匀,反应1min,测定 OD294值,酶活力单位
为μmol·L
-1·min-1,并根据以下公式计算孔石莼水
相提取物对XO的相对抑制率:
I= 1-OD1-OD3OD2-OD( )4 ×100%,
其中:OD1~OD4 为实验处理1~4在294nm处测定的
吸光度值。
分别测定孔石莼水相提取物浓度为0.2、0.4、0.6、
0.8、1.0mg/mL时对黄嘌呤氧化酶的抑制率,将提取
物浓度对数与抑制率进行回归,得回归方程,并根据方
程求得半抑制浓度(IC50)。
1.3.3孔石莼水相提取物对XO的抑制机理  在5mL
磷酸缓冲溶液的酶测活体系中(pH=7.5),设定底物黄
嘌呤的浓度为0.6mmol/L,分别加入不同浓度的孔石
莼水相提取物(0、0.4、0.8、1.6和2.4mg/mL),测定不
同酶浓度(2、4、6和8μg/mL)的酶活力,以酶活力对酶
浓度作图得到一组直线,根据直线是否平行或相交于
原点来判断孔石莼水相提取物对XO的抑制作用是否
可逆。
1.3.4孔石莼水相提取物对XO的抑制作用类型及抑
制常数的测定  在5mL的酶反应体系中,设定酶浓
度为4μg/mL,分别加入不同浓度的孔石莼水相提取
物(0、0.2、0.4和0.8mg/mL),测定不同底物(黄嘌呤)
浓度(0.2、0.4、0.6和0.8mmol/L)的酶活力,按Lin-
eweaver(Burk双倒数作图法,以酶活力(v)的倒数对底
物浓度[S]的倒数作图,得一组动力学曲线,根据动力
学参数Vm 和Km 的变化来判断孔石莼水相提取物对
XO的抑制类型,并通过直线纵轴截距对提取物浓度二
次作图,求得孔石莼水相提取物对酶(底物络合物的抑
制常数(KIS)。
1.3.5孔石莼水相提取物与别嘌呤醇的联合抑制作用
  参照文献[16],采用等毒法,按提取物和别嘌呤醇
对XO的抑制率为25%时的剂量混合,计算该混合物
对XO的联合抑制率,并根据公式:
共毒系数=(抑制率-50%)/50%×100,
求得共毒系数,评价混合物的联合抑制作用。
1.4数据处理
实验所有样品平行测定3次,采用SPSS19.0软件
进行数据处理和统计分析,并以平均值±标准偏差(珡X±
SD)表示。
2 结果及分析
2.1孔石莼水相提取物的浓度对XO酶活力的影响
由图1可知,在0~0.6mg/mL范围内,孔石莼水
相提取物对XO的抑制率与浓度呈近似正相关关系,当
提取物浓度进一步增大时,抑制率增长趋势减缓。根
据曲线数据求得,孔石莼水相提取物的半抑制浓度
(IC50)为0.58mg/mL。
图1 不同浓度孔石莼水相提取物对XO活力的影响
Fig.1 Effect of different concentration of water phase extracts
fromUiva pertusa on the activity of XO
2.2孔石莼水相提取物对XO的抑制机理
由图2可知,当加入不同浓度的孔石莼水相提取
物时,以酶浓度为横坐标,酶活力为纵坐标作图,得到
一组相较于原点的直线,并且直线斜率随着提取物浓
度的增大而减小。说明孔石莼水相提取物对XO作用
的抑制机理属于可逆抑制,即提取物通过非共价键与
酶结合而导致酶催化活性降低,可以通过物理方法使
酶复活。另外,提取物中的活性成分是通过影响酶(底
物络合物的形成或酶(产物络合物的分解来降低酶的
催化效率。
2.3孔石莼水相提取物对XO抑制作用类型的判定
在不同浓度的孔石莼水相提取物存在时,测定不
同底物浓度下对应的酶反应速度,以Lineweaver(Burk
13
中 国 海 洋 大 学 学 报 2 0 1 5年
双倒数作图法得到一组相互平行的直线(见图3),并且
直线截距随着提取物浓度的增大而增大,可见,孔石莼
水相提取物既影响酶反应的米氏常数(Km),又影响最
大反应速率(Vm),Km、Vm 值均随提取物浓度的增大而
减小,由此说明,孔石莼水相提取物对XO的抑制作用
属于反竞争性抑制类型,即提取物中的抑制成分只能
与酶(底物络合物(ES)结合,而不能与游离酶结合。
([I]表示孔石莼水相提取物的不同浓度。[I]represent the
different concentration of extracts of Ulva pertusa.)
图2 孔石莼水相提取物对XO的抑制作用机理
Fig.2 Inhibitory mechanism of water phase
extracts fromUiva pertusa on XO
以直线纵轴截距对抑制物浓度二次作图(见图4),
求得抑制常数KIS为0.40mg/mL。
2.4孔石莼水相提取物和别嘌呤醇的联合抑制作用
经计算,孔石莼水相提取物和别嘌呤醇对XO的抑
制率达到25%的计量分别是0.18和0.02mg/mL,联
合抑制作用结果见表2。
图3 孔石莼水相提取物抑制类型测定
Fig.3 Determination of inhibitory type of water phase
extracts fromUiva Pertusa on XO
图4 孔石莼水相提取物对XO抑制常数的测定
Fig.4 Determination of inhibition constant of water phase
extracts fromUiva pertusa on XO
  由表2可知,孔石莼水相提取物和别嘌呤醇的共
毒系数为18.2,处于10~20之间,属于弱协同作用[16]。
因此,孔石莼水相提取物可以与别嘌呤醇联合使用,提
高药效,减少别嘌呤醇的使用量,进而减少别嘌呤醇的
毒副作用,因此,具有良好的应用前景。
表2 混合物对XO活性的联合抑制作用
Table 2 Combined inhibition effect of mixture on XO
混合物成分
Mix components
预期抑制率
Expected inhibition rate/%
实测抑制率
Acture inhibition rate/%
共毒系数
Cotoxicity coefficient
作用类型
Type of action
孔石莼水相提取物
Extracts fromUivaPertusa
50  58.1±1.7* 18.2±3.2* 弱协同作用
别嘌呤醇
Alopurinol
注:数据以平均值±标准差的形式表示(n=3),P<0.05显著相关。Data expressed in the form of average±standard deviation(n=3),P<0.05,Signifi-
cant correlation.
3 讨论
到目前为止,有关植物提取物对XO抑制作用的研
究已有较多报道。姜彤伟等[17]研究了玉米须提取物对
黄嘌呤氧化酶的抑制作用,甲醇提取物的IC50为4.5
mg/mL;李英和陈君[18]研究了金银花提取物对XO的
抑制作用,水相提取物的IC50为1.95mg/mL;黎莉
等[19]研究了卷柏属7种药物植物的提取物对XO的抑
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1期 焉翠蔚,等:孔石莼水相提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用研究
制活性,水相提物的IC50为0.9mg/mL;杨增明等[20]研
究了土连翘提取物对XO的体外抑制作用,乙醇提取物
的IC50为1.569mg/mL;Fadwa Chaabane等[21]研究了
大戟瑞香叶提取物对XO的抑制活性,甲醇提取物的
IC50为0.5mg/mL;Abderrahmane Baghiani等[22]研究
了筋骨草不同极性试剂提取物对XO的抑制作用,甲醇
提物IC50为1.76mg/mL;综观国内外研究发现,植物
提取物混合成分对XO的半抑制浓度主要处在0.5~
4.5mg/mL之间。孔石莼水相提取物的半抑制浓度
(IC50)为0.58mg/mL,说明孔石莼水相提取物与一般
植物提取物,特别是中药提取物相比,具有较高的XO
抑制活性。目前,由于中药使用时处理方法及用量掌
握不当而出现的毒副作用问题,是其走向世界的壁
垒[23]。然而,孔石莼原料来源丰富、无毒副作用,并含
有多种营养成分。同时,联合抑制作用研究发现,孔石
莼水相提取物和别嘌呤醇具有一定的协同作用,因此,
孔石莼水相提取物可以作为一种辅助成分与别嘌呤醇
联合使用,以减少别嘌呤醇的毒副作用,具有广阔的应
用前景。
本实验对孔石莼水相提取物进行了动力学分析,
结果表明,孔石莼水相提取物对XO的抑制作用类型为
反竞争性可逆抑制作用,即XO先与黄嘌呤结合之后,
再与抑制剂结合,但是形成的中间产物三元复合物不
能形成产物,导致酶的Km 和Vm 值都降低。综合国内
外研究发现[24],植物提取物中对XO具有显著抑制作
用的组分主要集中在黄酮类、多酚类、吡唑并嘧啶类、
嘌呤类、噻唑类等,而这些组分多为嘌呤类似物和嘌呤
合成前体的类似物,其中,嘌呤类、吡唑并嘧啶类、大部
分黄酮类作为底物类似物通过竞争性结合XO的含钼
活性中心来抑制XO活性。Jung等[25]研究发现,部分
黄酮类化合物可以通过结合酶的非含钼活性部位来抑
制酶活性,起到非竞争性抑制作用。而噻唑类药物[26]
通过占据XO的疏水空腔或与酶的钼蝶啶区域共价结
合,阻碍XO与底物的结合而抑制酶活性,多为混合性
抑制作用类型。对于反竞争性作用类型的抑制剂的研
究却鲜有报道,只出现在某些苯酚类物质中。李波[27]、
Meriem[1]等研究发现,苯酚类物质咖啡酸可以阻断自
由基链,反竞争性抑制XO活性,抑制活性与苯环上的
的羟基呈正相关。为探究孔石莼水相提取物中哪种组
分起作用,本实验对提取物进行了初步鉴定分析,结果
发现,提取物中不含多酚,黄酮成分,这证实了孔石莼
水相提取物对XO的抑制作用不属于竞争性或非竞争
性类型,而与实验测得的反竞争性抑制类型相吻合,即
黄嘌呤与XO结合之后引起了XO的结构变化,使得抑
制剂再与酶的其它部位结合,从而抑制酶的活性。同
时,实验测得提取物中含有多糖、生物碱和其他一些成
分。然而,至于哪种有效成分起作用还有待于做进一
步研究。
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Study of Inhibitory Capability of the Water Phase Extracts from
Uiva pertusa Against Xanthine Oxidase
YAN Cui-Wei,CHANG Bao,LI Jing,TIAN You-Hao
(Colege of Marine Life Science,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)
Abstract: The water phase extracts of Uiva Pertusa was prepared by low temperature drying,ethanol
digestion,vacuum concentration,ethyl acetate and diethyl ether extraction.The inhibitory capability of
the extracts of Uiva Pertusaagainst xanthine oxidase was studied with K2HPO4-KH2PO4as buffer solu-
tion(pH=7.5)and at 25℃.The results showed that water phase extracts of Uiva Pertusa could in-
hibit the activity of Xanthine Oxidase obviously.The concentration corresponding to 50%inhibitory rate
(IC50)was 0.58mg/mL.The inhibition kinetics analyzed by Lineweaver(Burk plotting demonstrated
that the water phase extracts was uncompetitive reversible inhibitor to xanthine oxidase,with an inhibi-
tion constant(kIS)of 0.40mg/mL.The study of combined inhibitory effects showed that it was weak
synergy between water phase extracts and alopurinol.
Key words: water phase extracts fromUiva pertusa;xanthine oxidase;inhibitory effect;weak syner-
gy
责任编辑 朱宝象
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