全 文 ：• 2349 •中华中医药杂志(原中国医药学报)2015年7月第30卷第7期 CJTCMP , July 2015, Vol . 30, No. 7
牛樟芝水溶性成分的HPCE-DAD指纹图谱研究
张奉苏，陈菲，傅兴圣，刘训红，杨念云，蔡宝昌，夏敏媛
（南京中医药大学，南京 210023）
摘要：目的：建立牛樟芝水溶性成分的HPCE-DAD指纹图谱分析方法。方法：采用高效毛细管电泳法进
行色谱分离，以60mmol/L硼砂（pH值9.3）为运行缓冲液，分离电压为22kV，检测波长为260nm，压力进样为
50mbar×6s，毛细管温度为28℃。以腺苷为参照物，测定其指纹图谱，并作模糊聚类分析和相似度评价。结
果：初步建立了以10个共有峰为特征指纹信息的牛樟芝水溶性成分的HPCE-DAD指纹图谱，相似度较高，色谱
分离度较好，达到了中药指纹图谱的技术要求。结论：方法准确可靠，重现性好，可用于牛樟芝内在质量的评
价和控制。
关键词：牛樟芝；高效毛细管电泳二极管阵列检测法；指纹图谱
基金资助：江苏省中药炮制重点实验室开放式课题（No.ZYPZ007），江苏省高校优秀科技创新团队“中药
资源化学研究”（No.2011），江苏高校优势学科建设工程资助项目（No.ysxk-2010）
Study on HPCE-DAD fingerprint of water-soluble components of Antrodia camphorata
ZHANG Feng-su, CHEN Fei, FU Xing-sheng, LIU Xun-hong, YANG Nian-yun,
CAI Bao-chang, XIA Min-yuan
( Nanjing University of Chinese Medicine, Nangjing 210023, China )
Abstract: Objective: To establish the analytical method for the fingerprint of water-soluble components of Antrodia
camphorata by HPCE-DAD. Methods: Based on the mode of high performance capillary electrophoresis, 60mmol/L sodium
borate was used as buffer solution (pH 9.3). The separation voltage was 22kV and the detection wavelength was set at 260nm. The
sample was injected at 50mbar×6s and column temperature was maintained at 28℃. Adenosine was used as reference standard,
the chromatographic fingerprints were determined. The data were analyzed by fuzzy cluster and fingerprint similarity evaluation
software to compare the similarity of samples. Results: HPCE-DAD fingerprints with 10 common peaks of water-soluble
components of Antrodia camphorata were established preliminarily. There was a high similarity and each chromatographic peak
was obtained with good separation and correlation according to the technical requirements of fingerprint. Conclusion: The method
was reliable, accurate and could be used for quality control of Antrodia camphorata.
Key words: Antrodia camphorata; HPCE-DAD; Fingerprint
Fund assistance: Open Project of Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine of Jiangsu (No.
ZYPZ007), ‘Chemical Research of Chinese Medicine Resources’ of Excellent Science and Technology Innovation Team Project
of Higher Education of Jiangsu Province (No.2011), A Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu
Higher Education Institutions (No.ysxk-2010)
通讯作者：刘训红，南京市栖霞区仙林大道138号南京中医药大学药学院，邮编：210023，电话：025-85811511
E-mail：liuxunh1959@sohu.com
樟芝（Antrodia camphorata）又称牛樟芝、牛樟
菇、樟内菇、红樟菇等，系多孔菌科薄孔菌属真菌，
为我国台湾特产真菌和传统药，具有预防和缓解食
物与药物中毒、腹泻、腹痛、高血压引起的皮肤瘙
痒等功效，民间视其为解毒、保肝和抗肿瘤的珍贵
草药[1]。
现代研究表明，樟芝含有多糖、三萜、超氧化物歧
化酶、腺苷、小分子蛋白质（含免疫蛋白）等生理活性
物质[2-7]。近年来，核苷和核酸碱基已被证实是重要
的生物活性化合物，它具有抗惊厥、抗血小板聚集、
抗氧化活性的作用[8-9]。毛细管电泳技术作为一种新
型分析技术，兼有电泳和色谱技术的双重优点，因
而具有高效、高速、高灵敏度、高自动化以及样品和
试剂耗用量少等一系列优点[10]，已较为广泛地应用
于中药指纹图谱的研究[11]。中药色谱指纹图谱用于
中药质量控制，比目前沿用的方法提供的信息要丰
·论著·
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富[12]。本实验在前期研究基础上[13-14]，以腺苷为参照
峰，采用高效毛细管电泳法建立牛樟芝发酵菌粉水
溶性成分的指纹图谱分析方法，以期为牛樟芝发酵
菌粉的品质评价及向大陆市场推广提供参考。
材料
1. 仪器 G1600-AX高效毛细管电泳仪（美国
Agilent公司），配惠普化学工作站，二极管阵列检测
器（DAD），自动进样器；Anke TGL-16B离心机（上
海安亭科学仪器厂）；YP601N电子天平（上海精密
科学仪器 有限公司）；HH-S型水浴锅（巩义市英峪
予华仪器厂）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超
声仪器有限公司，超声功率500W）；pHS-3C型pH计
（上海康仪仪器有限公司）。
2 . 药物 牛樟芝样品S1-S10为台湾长庚 生
物科技股份有限公司提供的发酵菌粉，批号分别
为：02L07，02L11，02L14，02L18，02L21，02L25，
02L28，03L04，03L07，03L11。留样凭证存放于南京
中医药大学中药鉴定实验室。对照品：腺苷（批号：
110879-200202）、尿苷（批号：110887-200202）购于
中国药品生物制品鉴定所；鸟苷（批号：1001103046）
购于美国Sigma公司，纯度大于98%。硼砂（南京化学
试剂一厂，分析纯），氢氧化钠（上海化学试剂有限公
司，分析纯），实验用水均为重蒸馏水。
方法与结果
1. 电泳条 件 未涂渍标准熔融石 英毛细管
75μm×64.5cm，有效长度56cm（Agilent科技有限
公司）；运行缓冲液：60mmol/L硼砂（pH值9.3）；
检测波长：260nm；分离电压：22kV；压力进样：
50mbar×6s；毛细管温度：28℃。毛细管使用前依次
用0.1mmol/L氢氧化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲
液压力冲洗5、10、5min，样品分析间隔用0.1mmol/L
氢氧化钠溶液、重蒸馏水、缓冲液平衡3、5、5min。
上述试剂使用前均经0.22μm滤膜滤过，并超声
脱气。
2. 对照品溶液制备 精密称定腺苷9.98mg，尿
苷10.00mg，鸟苷8.08mg分别置于10mL量瓶中，加水
溶解并定容至刻度，得到各对照品母液。分别取腺苷
2.5mL、尿苷2.5mL及鸟苷1.25mL母液至25mL量瓶
中，加水定容至刻度，制成腺苷、尿苷、鸟苷浓度分别
为99.8、100.0、40.4μg/mL的混合对照品储备液。
3. 供试品溶液制备 取经50℃干燥48h后的样
品粉末0.5g，精密称定，加蒸馏水5mL，称重，超声
提取40min，沸水加热10min，再次称重，补足至原重
量，12 000r/min离心8min，取上清液，用0.22μm滤膜
过滤，作为供试品溶液。
4. 方法学考察
4.1 精密度试验 取供试品（S1）粉末，制备供试
品溶液，连续进样5次，测定指纹图谱，用“中药指纹
图谱相似度评价系统（2004A）”软件计算，结果相
似度均大于0.98，表明供试品进样精密度良好。
4.2 稳定性试验 取供试品（S1）粉末，制备
供试品溶液，分别在1、4、8、16、24h进样5次，测
定指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统
（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.93，说明
供试品溶液在24h内稳定。
4.3 重复性试验 取供试品（S1）粉末6份，制
备供试品溶液，按照“1.”项下的条件进样分析，
测定指纹图谱，用“中药指纹图谱相似度评价系统
（2004A）”软件计算，结果相似度均大于0.88，表明
本法测定的重现性尚好。
以上结果表明指纹图谱中各色谱峰的相对迁移
时间和峰面积基本一致，相似度较高，符合指纹图谱
研究的的技术要求。
5. 指纹图谱的建立 将供试品溶液分别放入自
动进样的样品管中，按选定的测试条件进行检测。
同一上述实验条件下，测定S1-S10供试品HPCE色谱
图。根据不同批次供试品测定结果所给出的峰数、
峰值（积分值）和峰位（相对迁移时间）等相关参
数，进行分析、比较，制定优化的指纹图谱。见图1-
图2。
图1 HPCE-DAD对照图谱
注：3.腺苷；4.鸟苷；8.尿苷。
时间（min）
40
35
25
20
15
10
5
0
30
2 4 6 8 10 12 14
图2 牛樟芝菌粉的HPCE-DAD指纹图谱
时间（min）
0.00
21.31
44.03
-1.41
3.19 6.38 9.57 12.76 15.94 19.13 22.32
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表1 樟芝水溶性成分HPCE-DAD指纹图谱中共有峰相对峰面积
峰号 α
相对峰面积
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
1 0.647 0.56 0.51 0.42 0.47 0.63 0.53 0.67 0.61 0.53 0.54
2 0.743 0.17 0.31 0.11 0.18 0.34 0.08 0.22 0.08 0.08 0.12
3 1.000 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
4 1.235 0.10 0.09 0.06 0.13 0.12 0.13 0.16 0.17 0.13 0.08
5 1.298 0.33 0.27 0.33 0.29 0.30 0.35 0.35 0.40 0.35 0.36
6 1.327 0.80 0.58 0.68 0.64 0.62 0.74 0.89 0.86 0.74 0.79
7 1.365 0.59 0.45 0.52 0.51 0.54 0.51 0.65 0.62 0.51 0.55
8 1.492 0.39 0.29 0.36 0.40 0.24 0.44 0.40 0.43 0.44 0.42
9 1.647 0.39 0.33 0.21 0.35 0.45 0.24 0.47 0.31 0.24 0.25
10 2.317 0.13 0.19 0.18 0.25 0.30 0.27 0.21 0.39 0.27 0.25
6. 指纹图谱分析
6.1 共有指纹峰标定 经对供试品HPCE色谱
图的分析、比较，樟芝菌粉标定10个共有峰作为指
纹图谱的特征峰，3、4、8号峰与对照品对照分别鉴
定为腺苷、鸟苷、尿苷。以3号峰腺苷为参照峰，分
别求出各共有峰与之相比的α值（调整迁移时间之
比）和各共有峰的相对峰面积（峰面积之比）。见
表1。
6.2 指纹图谱的聚类分析 选择牛樟芝HPCE
指纹图谱中10个比较明显的共有峰，根据表1中的
数据，用SPSS软件中的Hierarchical Cluster Analysis
对10 个牛樟 芝 样品进 行 聚类分析，所用聚类 方
法为Between-groups Linkage，距离公式为Square
Euclidean Distance，得不同样品牛樟芝的聚类分析
图，结果见图3-图4。
图3 樟芝水溶性成分HPCE-DAD指纹图谱的聚类分析图
          ᳝݅㒘ߚⳌᇍዄ䴶⿃
6666666666
图4 樟芝水溶性成分HPCE-DAD指纹图谱中共有峰组分含量图
结果显示，当距离标尺在1时，样品S6、S9归为一
类，在2时，样品S6、S9、S10归为一类；在7时，样品
S6、S9、S10与S3归为一类；在8时，样品S6、S9、S10、
S3与S4归为一类，样品S1与S7归为一类；在15时，样
品S6、S9、S10、S3、S4与S8归为一类；在18时，样品
S6、S9、S10、S3、S4、S8与S1归为一类；在25时，所有
样品才归为一类。
6.3 色谱峰的重叠率 以牛樟芝对照谱图（S）
为基准，按以下公式计算（待测样品与对照谱图共
有的峰数×2/待测样品与对照谱图峰数和）×100％，
S1-S10号样品色谱峰的重叠率依次为：80.20%，
87.58%，87.79%，83.64%，86.43%，86.43%，90.43%，
89.12%，80.74%，91.74%。见图5。
图5 樟芝水溶性成分HPCE指纹图谱共有模式
时间（min）
0.00
-1.41
44.01
89.42
134.83
3.19 6.38 9.57 12.76 15.94 19.13
6 .4 相似度评价 将测试数据导入国家药典
委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”
软件，经校正选峰，设定匹配模式，将色谱峰自动
匹配，进行色谱峰差异性评价和整体相似性评价。
各样品与对照指纹图谱相似度值如下：S1为0.942，
S2为0.909，S3为0.918，S4为0.915，S5为0.893，S6
为0.873，S7为0.934，S8为0.901，S9为0.938，S10为
0.924。
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讨论
1. 电泳条件的优化
1.1 缓冲液的选择 实验考察了硼砂、硼砂-硼
酸、硼砂-甲醇、硼砂-氨水、乙酸钠-乙酸铵、磷酸氢
二钠-磷酸二氢钠体系的缓冲液，发现选用乙酸钠-乙
酸铵缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，各组
分分离度很差，基本不能分开；选用硼砂-硼酸液分
离效果稍好，但仍有一些峰达不到基线分离；当选用
硼砂-甲醇及硼砂-氨水时，分离效果一般。经反复实
验确定以硼砂为缓冲液，样品各组分分离效果最好。
故选择硼砂缓冲体系。
1 . 2 缓冲 液 浓 度 的 选 择 实 验 考 察了5 0 -
70mmol/L的硼砂缓冲溶液，结果发现迁移时间和分
离度随着缓冲液浓度的升高而减小。当缓冲液浓度
为60mmol/L时，样品各组分的峰形和分离度较好，故
选择缓冲液的浓度为60mmol/L。
1.3 缓冲液pH值的选择 缓冲液pH值是影响组
分迁移时间及分离度的重要因素，实验考察了pH值
9.08-9.35的缓冲液，发现随着pH值的增大，各组分
的分离度增加而迁移时间延长，峰高亦增高，当pH
值为9.30时３种核苷组分可达到基线基本分离，样品
各组分分离较好。故选择缓冲液的pH值为9.30。
1.4 运行电压的选择 实验考察了分离电压在
15-24kV的条件下对各组分迁移时间的影响，实验结
果表明分离电压过小，不能达到很好分离，当分离电
压为22kV时样品中各组分分离度较好，样品各组分
可以达到基线分离。故选择分离电压为22kV。
1.5 检测波长的选择 采用二极管阵列检测器
对检测波长进行考察，记录并比较不同波长的色谱
图，根据分析物的紫外吸收特征，发现在260nm波长
处，样品各组分均有较好的吸收，色谱图中色谱峰较
多，信息丰富，故选择260nm为检测波长。
2. 指纹谱分析 指纹谱分析结果表明，不同批
次牛樟芝菌粉之间既有相关性，又有区别。相应共
有指纹峰均已在色谱图上体现，色谱峰重叠率、指
纹谱相似度较好，但各峰面积有所不同，说明不同批
次樟芝菌粉的水溶性成分含量有一定差异。通过与
对照品对照分析，腺苷、鸟苷、尿苷可列为牛樟芝指
纹谱共有特征峰中n强峰，而腺嘌呤、肌苷分别在个
别批次菌粉中峰较小或未检出，未标定为共有峰；
腺苷、鸟苷、尿苷峰面积比值为其配比关系1∶（0.06-
0.17）∶（0.45-0.65），这对评价牛樟芝水溶性成分的
质量具有一定意义。
本实验建立了牛樟芝HPCE-DAD指纹图谱分析方
法，为市售牛樟芝菌粉内在质量的综合评价和全面控
制提供了科学依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2013年12月10日）