全 文 ：第 3期
收稿日期：2011-12-12
基金项目：浙江省分析测试科技计划项目（2008F70067）
作者简介：周秀锦（1974-），女，河南商水人，工程师，硕士，研究方向：理化分析与食品安全. E-mail：zxj@zs.ziq.gov.cn
文章编号: 1008－830X(2012)03－0211－04
HPLC法快速检测记忆缺失性贝毒软骨藻酸
周秀锦 1，周向阳 1，郑 斌 2，邵宏宏 1，王淑娜 1
（1. 舟山出入境检验检疫局，浙江舟山 316000；2. 浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316100）
摘 要：采用高效液相色谱法测定贝类食品中的记忆缺失性贝毒软骨藻酸。软骨藻酸经适当甲醇水提取，经过阴离子
柱净化，用高效液相色谱仪进行检测，外标法定量方法。方法定量限为 200 μg/kg，回收率大于 88.0%。该方法操作简单、快速、
准确、灵敏、适用性强，能满足贝类食品中软骨藻酸的测定。
关键词：高效液相色谱法；软骨藻酸；检测；贝类食物
中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A
HPLC Method of Rapid Detecting Domoic Acid in Shellfish
ZHOU Xiu-jin1, ZHOU Xiang-yang1, ZHENG Bin2, et al
(1. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316000;
2. Zhejiang Marine Development Research institute, Zhoushan 316100, China)
Abstract：A HPLC method of rapid detecting the domoic acid in shellfish was developed in the present
study． Domoic acid in the shellfish samples were extracted with methanol-water and cleaned up by passing
through SPE anion exchange cartridge． The residue was determined by HPLC with UV lamp at 310 nm and
quantified by external standard method. The results showed that the limit of determination of the method was
200 μg/kg, the recovery rate was higher than 88.0%. This method was simple, efficient, accurate, agility, appli－
cability strong to detect domoic acid in shellfish.
Key words：HPLC; domoic acid; detect; shellfish
贝类毒素是有毒有害赤潮生物产生的生物活性物质的总称，又被称为赤潮生物毒素。贝类毒素不仅严
重破坏海洋渔业资源和水产养殖，恶化海洋环境，还可以通过食物链的传递，危害人类健康，造成人体中毒
甚至死亡。在世界范围内，由赤潮毒素引起的人员中毒和死亡事件屡见不鲜。
首次报道记忆缺失性贝类毒素事件是在 1987年加拿大爱德华王子岛发生因食用养殖紫贻贝而引起
的食物中毒。随后加拿大国立大西洋研究中心的 QUILLIAM等从当地居民食用的养殖贝类体内分离出了
一种被称为软骨藻酸(Domoic Acid，DA)的活性物质，确认它为引起中毒的化学物质，并肯定该物质来源于
经常在加拿大东海岸形成赤潮的一种硅藻[1]。1996年，墨西哥 Baja地区，成百上千只海鸟因食用体内富集
浙江海洋学院学报(自然科学版)
Journal of Zhejiang Ocean University(Natural Science)
第 31卷 第 3期
2012年 5月
Vol．31 No．3
May.,2012
浙江海洋学院学报(自然科学版) 第 31卷
高浓度 DA的螃蟹、凤尾鱼、沙丁鱼中毒死亡[2]。1998年美国加利福尼亚州中部沿海发生 400多头海狮中
毒死亡事件，存活的海狮中有神经功能失调症状，从海狮的体液中检测出了高浓度 DA[3]。由 DA引起的中
毒症状包括恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，同时有昏眩、昏迷等类似神经性中毒症状，一段时间内丧失部分记忆
是此类中毒的典型特征，因此这类毒素被称为记忆缺失性贝类毒素[4]。软骨藻酸是记忆缺失性贝类毒素的
最常见生物毒素，是由硅藻门 Bacillariophyta、羽纹硅藻纲 Pennatae、管壳缝目 Aulonoraphidinals、菱形藻科
Nitzschiaceae中的拟菱形藻属 Pseudo-nitzschia和菱形藻属 Nitzschia中硅藻的某些种产生的一种兴奋性
神经毒素。软骨藻酸是一种溶于水具有强烈神经毒性、与红藻酸(2-梭基-3-异丙稀基脯氨酸)相关的兴奋
性非蛋白氨基酸类物质[5]。软骨藻酸是长链羽状硅藻 Nitzschia pseudodelicatissima的代谢物[6]，热稳定，熔点
为 223～224 ℃。易溶于水、稀酸和碱溶液中，微溶于甲醇和乙醇，不溶于石油醚和苯，紫外光谱最大吸收波
长为 242 nm。水中的贝类和鱼类对 DA有较强的耐受力，它们可以富集藻类产生的 DA，再经食物链的传
递对所在地区的生态环境造成影响，人类食用被 DA污染的海产品后即可引起中毒。1998年被英国作为
贝类动物的常规检测项目，规定 DA<20 mg/kg的贝类才可以食用。
笔者根据软骨藻酸贝类毒素的性质，建立一种快速简便的高效液相色谱分析方法。
1材料与方法
1.1方法原理
试样中的记忆缺失性贝类毒素经适当甲醇水提取，经过阴离子柱净化，用高效液相色谱仪进行检测；
外标法定量。
1.2试剂和材料
实验所用试剂应无干扰峰，除另有特别说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682一
级水的要求。
1.2.1试剂
甲醇、乙腈，色谱纯；三氟乙酸，优级纯；冰乙酸，盐酸，氢氧化钠，氨水，甲酸铵，乙酸铵，磷酸氢二钠，磷
酸二氢钠，磷酸铵，磷酸氢二铵，庚烷磺酸钠。标准品：软骨藻酸（DA）购自加拿大海洋局，Lot#20071205。
1.2.2仪器
高效液相色谱仪：配紫外-可见光检测器（岛津 LC-20A）；电子天平（梅特乐公司 CP124S）：感量 0.000
1 g；离心机（西格玛公司 3-18K）：10 000 r/min；微孔滤膜：0.45 μm；组织均质器（IKA公司 T25BASIC）；旋
转蒸发仪（LABOROTA-4003）；旋涡混合器（IKA公司 MSI）。
1.3样品处理
取样：用清水清洗外壳，开壳，清水淋洗除去泥沙等外来杂质，取可食用部分用作检测，匀质。
提取：称取试样 5.0 g，于 50 mL离心管中，加入 10 mL甲醇水溶液，旋涡混匀，超声波提取 5 min，
以4 000 r/min离心 5 min，移取全部上清夜至 50 mL离心管中。
柱净化：取阴离子交换柱，依次用 6 mL甲醇，3 mL水，3 mL 50%甲醇水溶液过柱活化，然后取提取液
5.0 mL，以 1滴/s的速度过柱，再用 1 mL甲醇洗涤，弃去流出液，挤干，最后用 2 mL冰乙酸+甲醇（25+75）
洗脱，收集洗脱液。45 ℃水浴，N2吹干。准确移取 1 mL乙腈+水（1+9）溶解残留物，转移到 5 mL离心管，加
入 1 mL正己烷萃取，静置 1 min，弃上层液体，下层过 0.45 μm微孔滤膜，供高效液相色谱仪检测。
1.4色谱条件
色谱柱：Venusil ASB C8，4.6×250 mm；流动相：乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸钠；流速：1.0 mL/min；
检测条件：紫外检测器，检测波长 242 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。
1.5标准工作曲线
以乙腈+水（1+9）稀释标准储备液分别配成为含软骨藻酸 0.1、1.0、2.5、10.0、25.0 μg/mL的标准溶液，
按样品处理柱净化步骤进行，高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。测量保留时间和峰面积，用峰面积
和含量作图，绘制标准曲线。
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第 3期
（2）柱 pH：用氨水调节提取液 pH为 7、9、11、14，过柱后收集洗脱液上机检测；结果表明：随着 pH的
升高，柱子上保留的杂质量也相应升高，严重影响检测。
（3）过柱体积：设定过柱的提取液体积分别为 3、5、8、10、15 mL，过柱后收集洗脱液上机检测；试验发
现：过柱提取液的体积过高或过低，都影响柱子的保留效率，体积过低及过高还会导致部分杂质保留在柱
体上，影响检测结果。
（4）洗脱液的体积：试验表明，2 mL洗脱液基本能将柱子上吸附的目标物质完全洗脱下来，增加洗脱
液的体积意义不大。
2.3色谱条件的优化
配制了乙腈+0.1%三氟
乙酸 +0.02%庚烷磺酸钠、
0.1%三氟乙酸+乙腈+甲醇
和 0.1%三氟乙酸 +乙腈 +
0.5%庚烷磺酸钠溶液三种流
动相，后 2种峰形和分离度
较差，因此采用乙腈+0.1%三
氟乙酸+0.02%庚烷磺酸钠作
为实验的流动相。
2.4方法的精密度、线性关系
配成浓度为 0.1、1.0、
2.5、10.0、25.0 μg/mL的软骨
藻酸标准溶液系列，进样 20
1.6计算
样品中软骨藻酸的残留量按下式计算。
X= Ci×V1×V3m×V2
X/mg·kg-1为样品中软骨藻酸的残留量；Ci/μg·mL-1为标准曲线上查出试样溶液中软骨藻酸的浓度；
V1/mL提取液总体积；V2/mL为净化用提取液体积；V3/mL为洗脱液体积；m/g为样品重量。
2结果与讨论
2.1提取时间的选择
设计超声波提取时间分别为 2、3、5、7、10 min，经检测发现提取 5 min时，提取接近完全，延长提取时
间意义不大，故选取提取时间为 5 min。
2.2离子交换柱类型以及过柱条件的选择
（1）柱子类型：分别自行生产的 I、II、III型阴离子交换柱，取适量提取液过柱净化洗涤后，用 2 mL冰
乙酸甲醇溶液洗脱；处理洗脱液后上高效液相色谱检测，以检验离子交换柱的净化效率，结果见表 1，I型
阴离子交换柱净化效果最佳。
表 1 DA在不同离子交换柱的净化效果
Tab.1 DA is purified by different anion exchange cartridges
柱子类型 净化效果 杂质干扰
I型
II型
III型
92%
27%
50%
少
少
干扰较严重
图 1 软骨藻酸标品、空白样品、加标样品的高效液相色谱图，保留时间 17.732 min
Fig.1 Chromatogram of DA standard, blank sample, spiked ample by HPLC, RT=17.732 min
周秀锦等：HPLC法快速检测记忆缺失性贝毒软骨藻酸 213
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3结论
综上所述，为检测贝类产品中的记忆缺失性贝类毒素软骨藻酸，采用甲醇水溶液进行提取，经过阴离
子交换柱净化，正己烷萃取等处理，使用高效液相色谱仪进行检测。前处理时间短，处理后的样品中杂质
少，该方法可达到下限 200 μg/kg，准确度和精密度等性能指标符合相关要求，适用于贝类食品的检测。
参考文献:
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NMDA reactivated as a consequence of excitatoryreceptors that a amino acid rele-ase[J]. Journal of Neurochemistry, 1997, 69:
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μL，软骨藻酸的保留时间约为 17.732 min，测量峰面积，计算平均值，求得回归方程 Y=0.010 975 x+0.009
456，r=0.999 9，相对标准偏差分别为 6.3%、4.8%、5.7%、3.9%、5.9%，平均为 5.3%。
2.5样品测定回收率试验
称取两批贝肉，在其中加入不同浓度的软骨藻酸标准品。各称取 5.0 g，按照 1.3样品处理中步骤进行，
高效液相色谱仪检测定量。检测 4组不同添加浓度的贝肉，计算测定方法回收率、精密度和检测下限，结果
见表 2。DA标准溶液、空白样品、空白样品添加色谱图如图 1所示。
表 2 样品中添加回收率及方法的精密度试验（n=5）
Tab.2 Results of recovery test and precision of the method from fortified samples（n=5）
样品 加标量/μg·kg-1 平均测定值/μg·kg-1 平均回收率/% RSD/%
贝肉 1
200
400
600
800
176.3
396.5
550.6
782.6
88.15
99.1
91.7
97.8
7.7
6.3
5.8
7.2
贝肉 2
200
400
600
800
195.6
368.7
530.9
801.2
97.8
92.1
88.5
100.1
9.0
5.3
6.4
5.1
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