全 文 ：中国生物制品学杂志 2012年 4月第 25卷第 4期 Chin J Biologicals April 2012，Vol. 25 No. 4
十字花科蔬菜（Cruciferae vegetable，CFV）具有
抗肿瘤的作用。CFV中硫甙（又称芥子油甙）的水解
产物异硫氰酸酯（Isothiocyanate，ITC）是 CFV最主要
的抗癌活性成分。山葵又名山嵛菜，为十字花科山
嵛菜属绿色草本植物，山葵提取物中烯丙基异硫氰
酸酯（Allyl isothiocyanate，AITC）含量最高，约占
89％ ～ 94％，其次是 6-甲硫基己基异硫氰酸酯［1］。
结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，应用化
学预防制剂对结肠癌进行化学预防是一种有效的策
略。本实验研究了山葵提取物对人结肠癌 SW480细
胞增殖的影响，并初步探讨其相关机制，为结肠癌的
预防及治疗提供新的靶点。
1. 材料与方法
1. 1 细胞
人结肠癌 SW480细胞为本中心保存。
1. 2 主要试剂
山葵由重庆市武隆县山葵绿色发展有限公司提
供；AITC购自安徽海贝进出口有限公司；RPMI1640
培养基购自 HyClone公司；小牛血清购自杭州四季青
生物工程材料有限公司；MTT和抗坏血酸均购自重庆
百杰生物有限公司；Trizol试剂购自北京鼎国昌盛生
物技术有限责任公司；RT-PCR试剂盒及细胞凋亡和
周期检测试剂盒（Annexin V、PI）购自 TaKaRa公司。
1. 3 山葵中混合 ITC的制备
参考文献［2］方法。取冰冻山葵植株，解冻后将
山葵的根须、根茎、叶分开，称取根茎 100 g，用高速
组织粉粹机在低温环境下粉粹，加入 20 ml 0. 1％
的抗坏血酸，29℃水浴水解 30 min；四层纱布过滤，
用 40 ml的无水乙醚萃取滤液，收集乙醚层萃取液；
120 ml无水乙醚萃取滤渣 1 h，用 30 ml无水乙醚冲
洗滤渣，冲洗后的乙醚与乙醚层萃取液混合，置于
45℃水浴锅内除乙醚，直至得到辛辣味极强的橙黄
色油状液体；离心去除上层漂浮的杂质，即得到山葵
·治疗性制剂·
山葵提取物对结肠癌 SW480细胞增殖及抑癌基因 P16INK4a mRNA
转录水平的影响
毛春梅，杨兰兰，刘先俊
【摘要】 目的 研究山葵提取物对结肠癌 SW480细胞增殖及抑癌基因 P16INK4a mRNA转录水平的影响。方法 采用不同
浓度的山葵提取物作用于 SW480细胞 48 h后，MTT法检测其对 SW480细胞增殖的影响；流式细胞仪检测细胞凋亡和周期分布
的变化；RT-PCR检测抑癌基因 P16INK4a mRNA转录水平的变化。结果 山葵提取物对 SW480细胞的增殖具有抑制作用，且呈浓
度依赖性，IC50值约为 130 μmol ／ L；细胞的早期、晚期凋亡率呈浓度依赖性升高，细胞周期主要阻滞于 G2期；细胞中抑癌基因
P16INK4a mRNA的转录水平下降，且呈浓度依赖性。结论 山葵提取物对 SW480细胞的增殖具有抑制作用，并可诱导细胞凋亡；
其通过抑制抑癌基因 P16INK4a mRNA的转录使细胞周期主要阻滞于 G2期。
【关键词】 山葵属；异硫氰酸酯；结肠癌；抑癌基因；P16INK4a
【中国图书分类号】 735. 3 ＋ 5【文献标识码】 A 【文章编号】 1004-5503（2012）04-453-05
Effect of wasabi extract on proliferation of colon carcinoma SW480 cells and transcription
level of mRNA of tumor suppressor gene P16INK4a
MAO Chun-mei，YANG Lan-lan，LIU Xian-jun（Molecular Medicine and Cancer Research Center，Chongqing
Medical University，Chongqing 400016，China）
【Abstract】 Objective To investigate the effect of wasabi extract on proliferation of colon carcinoma SW480 cells as well as
transcription level of mRNA of tumor suppressor gene P16INK4a. Methods SW480 cells were treated with wasabi extract at various
concentrations for 48 h，then determined for proliferation level by MTT method，for apoptosis and distribution of cell cycle by flow
cytometry，and for transcription level of P16INK4a mRNA by RT-PCR. Results Wasabi extract showed dose-dependent inhibitory effect
on proliferation of SW480 cells，with an IC50 of about 130 μmol ／ L. The early and late apoptosis rates of SW480 cells showed a dose-
dependent increase，of which the cell cycle was mainly arrested at G2 phase. However，the transcription level of P16INK4a mRNA
showed a dose-dependent decrease. Conclusion Wasabi extract inhibited and proliferation and induced the apoptosis of SW480
cells，and arrested the cell cycle at G2 phase by inhibiting the transcription of P16INK4a mRNA.
【Key words】 Wasabi；Isothiocyanate；Colon carcinoma；Tumor suppressor gene；P16INK4a
作者单位：重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心（重庆 400016）.
通讯作者：刘先俊，E-mail：lxj6422＠yahoo.com
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DOI：10.13200/j.cjb.2012.04.70.maochm.020
中国生物制品学杂志 2012年 4月第 25卷第 4期 Chin J Biologicals April 2012，Vol. 25 No. 4
的提取物混合ITC。取 0. 8 ml山葵提取物和 10 ml
六氢吡啶标准溶液（按文献［3］方法配制），依次加入
至 150 ml锥形瓶中，摇匀后加塞反应 50 min，参照
文献［3］方法滴定，按下式计算 ITC的百分含量。根
据 ITC的百分含量计算山葵提取物中混合 ITC（以下
称山葵提取物）的浓度。
ITC（％）＝ 0. 099（N1V1 － N2V2）× 100 ／ V0
式中N1为六氢吡啶标准溶液浓度（0． 0661mol ／ L）；
V1为六氢吡啶标准溶液的体积（ml）；N2为盐酸标准
溶液的浓度（0． 054 2 mol ／ L）；V2为盐酸标准溶液的
体积（ml）；V0 为山葵提取物加入体积（ml）；0． 099
为 1 mg当量的烯丙基异硫氰酸酯的重量（g）。
1. 4 细胞培养
用含 10％小牛血清、100 kU ／ L青霉素和 100 kU ／ L
链霉素的 RPMI1640培养基于 37℃，5％ CO2和 95％
空气饱和湿度的孵箱中常规培养 SW480细胞，隔天
换液，待细胞长至对数生长期时，用 0. 25％胰蛋白
酶消化传代。
1. 5 药物的配制
将 AITC溶解于 DMSO中，过滤除菌制成浓度为
1 mmol ／ L的溶液，使用前用 RPMI1640培养基稀释
至实验所需浓度，DMSO的终浓度小于 0. 025％，配
制过程和贮备时避光。山葵提取物用 PBS缓冲液稀
释 10倍，过滤除菌备用。
1. 6 山葵提取物对 SW480细胞增殖影响的检测
采用 MTT法。取对数生长期的 SW480细胞，调
整细胞浓度为 1 × 105个 ／ ml，接种于 96 孔板中，
100 μl ／孔，于 37℃，5％ CO2孵箱培养；次日，每孔加入
100 μl终浓度分别为 60、75、100、150和 300 μmol ／ L
的山葵提取物，并设空白对照组（不加山葵提取物），
每组设 5个复孔，继续孵育 48 h；每孔加入 20 μl 0. 5％
的 MTT溶液，继续培养 4 h；吸弃孔内培养液，每孔
加入 150 μl DMSO，置摇床上低速振荡 10 min，酶标
仪读取 A490值，按下式计算细胞生长抑制率，并计算
山葵提取物对 SW480细胞的半数抑制浓度（IC50）。
细胞生长抑制率（％）＝（对照组 A490值 －给药组 A490值）／
对照组 A490值 × 100％
1. 7 山葵提取物对 SW480细胞凋亡及细胞周期影
响的检测
采用流式细胞术。取对数生长期的 SW480细
胞，常规消化制成单细胞悬液，以 1 × 105个 ／瓶的密
度接种于 100 ml培养瓶中，于 37℃，5％ CO2孵箱培养，
24 h后加入终浓度分别为 50、60、75、100、150 μmol ／ L
的山葵提取物，并设空白对照组（不加山葵提取物），
培养 48 h；收集细胞，将浓度约为 1 × 106个 ／ ml的细
胞移入离心管中，1 000 × g离心 5 min，弃上清，用
PBS溶液洗涤 1次，加入 1. 2 ml预冷 PBS缓冲液吹
打均匀，用细胞凋亡和周期检测试剂盒检测细胞凋
亡情况；另取 2瓶培养的 SW480细胞，分别加入终
浓度为 130 μmol ／ L的山葵提取物和 AITC，并设空
白对照组，继续培养 48 h；分别收集 3瓶细胞，缓慢
加入 1 ml预冷的 70％酒精，边滴边摇，最后吹打均
匀，置于 4 ～ 8℃冰箱中固定过夜；次日上流式细胞
仪检测细胞周期的分布。
1. 8 山葵提取物对 SW480细胞中抑癌基因 P16INK4a
mRNA转录的影响
采用 RT-PCR法。SW480细胞与经相同浓度的
山葵提取物（130 μmol ／ L）和 AITC及不同浓度的山
葵提取物（37. 5、75、150、300、600 μmol ／ L）处理 48 h
后，采用 Trizol试剂提取各组细胞总 RNA，逆转录合
成 cDNA，以其为模板，PCR扩增 P16INK4a基因（NM＿
000077. 3），引物序列如下：上游：5′-ACGCACCGAA-
TAGTTACGG-3′，下游：5′-CCAGGTCCACGGGCAGA-
3′，扩增片段大小为 237 bp。内参 β-actin引物：上游：
5′-CCAACCGCGAGAAGATGACC-3′，下游：5′-TGCC-
AATGGTGATGACCTGG-3′，扩增片段大小为 414 bp。
反应条件为：95℃预变性 2 min；94℃变性 30 s，50℃
退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 35个循环；72℃再延伸
7 min。内参退火温度为 64℃，其余条件不变。扩增
产物经 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，凝胶成像仪成像分
析灰度值。
1. 9 统计学分析
应用 SPSS17. 0软件，采用单因素方差分析进行
统计学分析，实验数据以 x ± s表示，以 P ＜ 0. 05为差
异有统计学意义。
2. 结果
2. 1 山葵提取物的浓度
经计算，山葵提取物的浓度为 0. 027 mol ／ L。
2. 2 山葵提取物对 SW480细胞增殖的影响
MTT检测结果显示，SW480细胞的增殖能力随
山葵提取物浓度的升高而降低，各浓度组与对照组
之间差异均有统计学意义（F ＝ 45. 93，P ＜ 0. 05），
见图 1。经计算，山葵提取物对 SW480细胞的 IC50
值约为 130 μmol ／ L。
2. 3 山葵提取物对 SW480细胞凋亡和细胞周期的
影响
流式细胞仪检测结果显示，空白对照组和山葵提
取物 50、60、75、100、150 μmol ／ L组 SW480细胞的早
期凋亡率分别为 3. 09％、8. 21％、12. 77％、12. 81％、12. 87％
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和 45. 94％，晚期凋亡率分别为 2. 81％、8. 41％、11. 88％、
14. 49％、14. 96％和 27. 28％，表明 SW480细胞的凋亡
率随着山葵提取物浓度的增加而升高，见图 2。空白对
照组细胞主要阻滞在 G1期（48. 78％），山葵提取物组
和 AITC组细胞主要阻滞在 G2期（分别为 49. 08％和
70. 24％），山葵提取物组细胞也阻滞在 S期，见图3。
2. 4 山葵提取物对 SW480细胞中 P16Ink4a基因mR－
NA转录水平的影响
RT-PCR结果显示，相同浓度山葵提取物组和AITC
组P16Ink4a基因 mRNA的转录水平（分别为 0. 662 6 ±
0. 02和 0. 450 7 ± 0. 02）明显低于空白对照组（0. 830 3 ±
0. 03），且差异有统计学意义（F ＝ 234. 72，P ＜ 0. 05），
见图 4。P16Ink4a基因 mRNA的转录水平随山葵提取
物浓度的增高而降低，浓度为 600 μmol ／ L 的山葵
提取物导致细胞全部死亡，浓度分别为 300、150、75
和 37． 5 μmol ／ L的山葵提取物组 P16Ink4a基因mRNA
的转录水平分别为（1. 229 7 ± 0. 004）、（1. 621 0 ±
0. 018）、（1. 848 7 ± 0. 415）和（2. 031 0 ± 0. 067），均
明显低于空白对照组（2. 106 3 ± 0. 005），且差异均
有统计学意义（F ＝ 1 715，P ＜ 0. 05），见图 5。
图 1 不同浓度的山葵提取物对 SW480细胞增殖的影响
Fig 1. Effect of wasabi extract at various concentrations on
proliferation of SW480 cells
A ～ E：分别为山葵提取物 50、60、75、100、150 μmol ／ L 组；F：空白对照组。
图 2 流式细胞术检测不同浓度山葵提取物对 SW480细胞凋亡的影响
Fig 2. Flow cytometry of effect of wasabi extract at various concentrations on apoptosis of SW480 cells
A：空白对照组；B：山葵提取物组；C：AITC组。
图 3 流式细胞术检测山葵提取物对 SW480细胞周期分布的影响
Fig 3. Flow cytometry of effect of wasabi extract on distribution of SW480 cell cycle
75
90
80
70
60
50
40
30
20
10
细
胞
生
长
抑
制
率
（
％）
山葵提取物浓度（μmol ／ L）
150 100300
0
0 60
500
400
300
200
100
0
0 80604020 100 120 0 80604020 100 120 0 80604020 100 120
210
280 360
140
70
0
270
90
180
0
A B C
Channels（FL2-A）
Nu
m
be
r
100
101
102
103
104
100 101 102 103 104
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
A B C
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
100
101
102
103
104
100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104
D E F
Annexin-V
PI
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中国生物制品学杂志 2012年 4月第 25卷第 4期 Chin J Biologicals April 2012，Vol. 25 No. 4
M：DNA marker DL1000；1，4：空白对照组；2，5：AITC组；3，6：山
葵提取物组。
图 4 RT-PCR 检测山葵提取物对 SW480 细胞中 P16Ink4a
基因 mRNA转录水平的影响
Fig 4. Analysis of effect of wasabi extract on transcription
level of P16Ink4a mRNA in SW480 cells by RT-PCR
M：DNA marker DL1000；1 ～ 5：分别为山葵提取物 600、300、150、
75、37． 5 μmol ／ L组；6：空白对照组。
图 5 RT-PCR检测不同浓度山葵提取物对 SW480细胞
中 P16Ink4a基因 mRNA转录水平的影响
Fig 5. Analysis of effect of wasabi extract at various con－
centrations on transcription level of P16Ink4a mRNA in SW480
cells by RT-PCR
3. 讨论
山葵提取物的抗癌机制具有多样性，如可抑制
致癌物激活酶，减少基因损伤，诱导致癌物解毒酶，
抑制遗传性受损细胞的增殖，通过诱导细胞凋亡和
细胞周期的阻滞，诱导恶性细胞的分化等。在诱导细
胞凋亡方面，ITC能够诱导肺癌、前列腺癌、肝癌、胃
癌、乳腺癌、膀胱癌、胆管癌等癌细胞的凋亡，但不同
类型的 ITC对不同肿瘤细胞的抑制作用差异较大，
如 AITC、莱菔硫烷（Sulforaphane，SFN）和异硫氰酸
苯乙酯（Phenylethyl isothiocyanate，PEITC）可诱导人
前列腺癌细胞 PC-3凋亡［4］；朱婧等［5］的研究证明，
AITC能抑制脂多糖诱导的原代大鼠肝细胞的生长；
Bhattacharya等［6］的研究证明，AITC能抑制膀胱癌
细胞的生长。本实验探讨了山葵提取物中的混合异
硫氰酸酯对人结肠癌细胞 SW480的影响，结果表明
山葵提取物能有效抑制 SW480细胞的增殖，并呈浓
度依赖性。
目前有关 ITC 诱导细胞周期阻滞的报道不一
致。有研究表明，以 SFN处理膀胱癌细胞 T24，可使
细胞周期阻滞在 G0 ／ G1期［7］；而 AITC可使膀胱癌
细胞 UM-UC-3的细胞周期阻滞在 G2 ／ M期［8］。本
实验结果显示，AITC和山葵提取物主要是将 SW480细
胞阻滞在 G2期，而山葵提取物除了可将细胞阻滞在
G2期外，在 S期也起到阻滞细胞的作用。表明山葵提
取物含有其他促使细胞凋亡的 ITC，能够诱导结肠癌
SW480细胞凋亡，并将细胞周期阻滞在 G2 ／ S期。
在 ITC诱导细胞凋亡的过程中，有丝分裂原活
化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）
的调节和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的
产生起关键作用［9］。由于大多数 ITC的结构相似，
并均可诱导细胞凋亡，因此其作用机制也相似。上述
研究显示，MAPK的活化在 ITC 诱导的细胞凋亡中
是共有事件，但 MAPK成分［胞外信号调节激酶（Ex－
tracellular signal-regulated kinase，ERK）、c-jun 氨基
末端激酶（c-jun amino-terminal kinase，JNK）、P38］的
各自作用根据细胞类型的不同而不同［9］。如 AITC、
SFN和 PEITC诱导的前列腺癌细胞 PC-3 凋亡过程
中伴有 ERK和 JNK的活化［4］。Miyoshi等［10］证实，
BITC可以激活 JNK和 MAPK P38，使人白血病 T细
胞凋亡。MAPK家族相关蛋白通过一系列不同的下
游蛋白来调节 P16Ink4a的活性，如 Ets1、Ets2 能激活
P16Ink4a［11-12］，而 ELK1、PEA3、SAP1则对 P16Ink4a的活
性起负调节作用［4，11，13］。P16Ink4a的主要作用是通过
与 CyclinD 竞争结合 CDK4 ／ 6 来抑制 CDK4 ／ 6 的
活性，从而抑制细胞由 G1期进入 S期。有研究表明，
P16Ink4a在正常细胞中表达极低，而在结肠癌中高表
达。根据山葵提取物中的 ITC 可磷酸化 MAPK，而
MAPK又能通过下游蛋白调节 P16Ink4a的活性，推测
山葵提取物对 P16Ink4a也有影响。基于上述推断，本
实验研究了经山葵提取物或 AITC处理后的 SW480
细胞中 P16Ink4a基因 mRNA 的转录水平，结果显示，
二者均使 P16Ink4a基因 mRNA 的转录水平下降，且
AITC组较山葵提取物组低，说明山葵提取物是多种
ITC的混合物。实验结果证明，山葵提取物对 P16Ink4a
基因有影响，具体是哪些 MAPK 的下游蛋白调控
P16Ink4a的活性还有待于进一步研究证实。P16Ink4a基
因主要是阻滞细胞由 G1期进入 S 期，P16Ink4a基因
mRNA转录水平的降低证明了结肠癌细胞周期的阻
滞不在 G1期，该结果与流式细胞仪检测结果（SW480
细胞被阻滞在 G2期）相符合。
本实验从基因水平上说明山葵提取物对结肠癌
SW480细胞的抑制及促使细胞凋亡作用不是使细胞
阻滞在 G1期而是在 G2期，但其具体机制还需要大
量实验证明。本实验结果为山葵提取物可以抑制肿
瘤细胞增殖的机制提供了新的实验依据，也为结肠
癌的预防及治疗提供了一个新的靶点。
400
200
bp M 1 2 3 4 5 6
β-actin
P16Ink4a
200
β-actin
P16Ink4a
500
300
bp M 1 2 3 4 5 6
400
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中国生物制品学杂志 2012年 4月第 25卷第 4期 Chin J Biologicals April 2012，Vol. 25 No. 4
（上接第 452页）
大量升高的 Ca2＋作为第二信使，启动多条信号转导
途径［10-11］。本实验利用 Rhodamine123荧光探针，采
用 LSCM观察 TP对 GBC-SD细胞线粒体膜电位的
影响，发现 TP可降低 GBC-SD细胞线粒体膜电位，
且随 TP浓度的升高、作用时间的延长而增强，呈剂
量和时间效应关系。上述结果表明，线粒体途径在
TP诱导 GBC-SD细胞凋亡过程中起重要作用，其机
制一方面是增加细胞内 Ca2＋量，激发线粒体通透性
转运孔开放，降低线粒体跨膜电位，诱导细胞凋亡；
另一方面，TP还可以通过开放线粒体通透性转运孔
通道，引起线粒体内 Ca2＋释放造成［Ca2＋］i升高，从而
启动细胞凋亡的发生。
综上所述，TP对 GBC-SD细胞增殖及细胞活力
具有抑制作用，并能诱导细胞凋亡，其诱导 GBC-SD
细胞凋亡的机制可能与其上调细胞内［Ca2＋］i浓度、
诱导线粒体通透性转换孔开放、增强线粒体内膜通
透性和降低线粒体膜电位有关，其具体机制还有待
于深入研究。
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（收稿日期：2011-08-13）
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