全 文 ：相，改善 2 种药物的色谱行为，缩短出峰间隔，使 2
种药物快速出峰，将分析时间降至 9 min。
3. 3 体外释放条件
释放介质选择了 0. 3% SDS 溶液，这主要是考
虑到 FEL为难溶性药物，水中溶解度小于 1 μg·
mL －1，适当加入表面活性剂后可改善药物的释放，
可满足漏槽条件。另外采用浆法进行释放度测定
时，由于片芯中加入了高分子黏性材料，加入沉降篮
防止控释片黏到杯底，释放结果与篮法无差异，因此
选择篮法进行测定。
REFERENCES
［1］ BERNARD W，JEAN-MARIE D，BJORN D，et al． Felodipine-
Metoprolol combination tablet:A valuable option to initinate anti-
hypertensive therapy［J］． Am J Hypertens，1999，12(9) :915-
920.
［2］ HARIA M，PLOSKER G L，MARKHAM A． Felodipine /Metopro-
lol:A review of the fixed dose controlled release formulation in the
management of essential hypertension［J］． Drugs，2000，59(1) :
141-145.
［3］ GAO J L． A review of the effect of felodipine and metoprolol com-
bination in the management of hypertension［J］． Jiangxi Med J
(江西医药) ，2011，46(4) :348-349.
［4］ YAN K，LI Z P，LIU H Y，et al． Preparation of osmotic pump
controlled release ta-blets of compound felodipine with metoprolol
tartrate［J］． Mil Med Sci(军事医学) ，2011，35(3) :214-218.
［5］ WANG W G，YUN L H，WANG R，et al． Simultaneous determi-
nation of metoprolol tartrate and felodipine in skin diffuse solution
by HPLC［J］． Chin Pharm J(中国药学杂志) ，2006，41(2) :
143-146.
［6］ YANG Y N． Study on the dissolution of compound felodipine re-
tard tablets［J］． Chin J Pharm Anal(药物分析杂志) ，2001，11
(2) :8-9.
［7］ LI Z Q，WU F． Determination of felodipine and metoprolol tartrate
in compound felodipine sustained-release tablets［J］． Chin Pharm
J(中国药学杂志) ，2004，39(9) :693-694.
［8］ Ch． P(2010)VolⅡ(中国药典 2010 年版． 二部) ［S］． 2010:
Appendix:85-87.
(收稿日期:2012-12-17)
基金项目:江苏省中药炮制重点实验室开放式课题(ZYPZ007) ;江苏省高校优秀科技创新团队“中药资源化学研究”(2011) ;江苏高校优势学
科建设工程资助项目(ysxk-2010)
作者简介:张奉苏，女，硕士研究生 研究方向:中药品质评价 * 通讯作者:刘训红，男，教授 研究方向:中药鉴定与品质评价
Tel:(025)85811511 E-mail:liuxunh1959@ sohu. com
高效毛细管电泳法同时测定牛樟芝中 5 种核苷类成分的含量
张奉苏，陈菲，傅兴圣，刘训红* ，杨念云，蔡宝昌，夏敏媛(南京中医药大学江苏省中药炮制重点实验室，南京 210046)
摘要:目的 建立高效毛细管电泳法( HPCE)同时测定不同批次牛樟芝中腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷和肌苷等5种核苷类成分含量
的方法。方法 采用未涂渍标准熔融石英毛细管( 75 μm ×64. 5 cm，有效长度56 cm)为分离通道，60 mmol·L －1硼砂( pH 9. 3)为
运行缓冲液，分离电压为 22 kV，检测波长为 260 nm，毛细管温度为 28 ℃，压力进样为 50 mbar ×6 s。结果 5种核苷类成分的响
应峰面积与其相应浓度的线性关系良好( r ＞0. 999 5) ; 加样回收率为 98. 83% ～ 101. 08%。实验表明，不同批次牛樟芝菌粉中 5
种核苷类成分的含量有所差异。结论 该方法准确、可靠，重复性较好，可用于牛樟芝菌粉内在质量的评价和控制。
关键词:高效毛细管电泳;牛樟芝;核苷;碱基;同时测定
doi: 10. 11669 /cpj. 2013. 12. 018 中图分类号:R917 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2013)12 － 1018 － 04
Simultaneous Determination of Five Nucleosides in Antrodia camphorata by HPCE
ZHANG Feng-su，CHEN Fei，FU Xing-sheng，LIU Xun-hong* ，YANG Nian-yun，CAI Bao-chang，XIA Min-yuan
(Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicines Processing，Nangjing 210046，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish a high performance capillary electrophoresis (HPCE)method for simultaneous determina-
tion of five nucleosides and nucleobases，including adenine，adenosine，uridine，guanosine and inosine in antrodia camphorate of dif-
ferent batches. METHODS Based on the mode of HPCE，uncoated fused silica capillary (75 μm × 64. 5 cm ，56 cm of effective
length)was used with separation voltage of 22 kV. 60 mmol·L －1 sodium borate was selected for the running buffer solution (pH 9. 3)．
The detection wavelength was set at 260 nm. The sample was injected at 50 mbar ×6 s and column temperature was maintained at 28 ℃. RE-
SULTS The calibration curves of the five nucleosides showed good linearity (r ＞0. 999 5). The average recoveries of the method were be-
·8101· Chin Pharm J，2013 June，Vol. 48 No. 12 中国药学杂志 2013 年 6 月第 48 卷第 12 期
tween 98. 83% －101. 08%. The contents of the five nucleosides in Antrodia camphorate samples of different batches were different. CON-
CLUSION The established method is reliable，accurate and can be used for the quality control of Antrodia camphorata.
KEY WORDS:HPCE;Antrodia camphorata;nucleoside;nucleobase;simultaneous determination
牛樟芝(Antrodia camphorata)又称樟芝、牛樟
菇、樟内菇、红樟菇等，是只生长于我国台湾省牛樟
树(Cinnamomum kanehirai)腐朽内壁的多孔真
菌［1］，为我国台湾特有的稀世珍宝，牛樟芝一直被
誉为治疗肝病的神奇药王，早期原住民以其作为解
酒之用，近年来的药效学实验证实其具有解毒保肝、
消除肿瘤、补肾强心、益胃整肠、强化免疫等作用。
现代研究表明，樟芝含有多糖、三萜、超氧化物歧化
酶(SOD)、腺苷、小分子蛋白质(含免疫蛋白)等多
种生理活性物质［2-7］。近年来，核苷类成分已被证实
是重要的生物活性物质，具有抗惊厥、抗血小板聚
集、抗氧化活性［8-9］。作为新兴名贵食、药用菌，目前
我国台湾及日本已有樟芝保健食品上市，并作为食
品进口销往内地市场。迄今，有关牛樟芝的质量研
究报道较少，仅见多糖、三萜类成分分析的零星报
道，尚未见核苷类成分测定的报道。毛细管电泳技
术作为一种新型分析技术，兼有电泳和色谱技术的
双重优点，因而具有高效、高速、高灵敏度、高自动化
以及样品和试剂耗用量少等一系列优点［10］，已较为
广泛地应用于中药指标成分含量分析研究［11］。本
实验在前期研究基础上［12 ～ 13］，建立 HPCE同时测定
牛樟芝中腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷 5 种核苷
类成分含量的方法，并对不同批次商品牛樟芝菌粉
进行比较分析，为牛樟芝内在质量的综合评价和全
面控制提供可靠的检测方法。
1 仪器与材料
G1600 － AX 高效毛细管电泳仪(美国 Agilent
公司) ，配惠普化学工作站，二极管阵列检测器
(DAD) ，自动进样器;Anke TGL － 16B 离心机(上海
安亭科学仪器厂) ;YP601N 电子天平(上海精密科
学仪器有限公司) ;HH － S型水浴锅(巩义市英峪予
华仪器厂) ;KQ － 500B 型超声波清洗器(昆山市超
声仪器有限公司，超声功率 500 W) ;pHS － 3C型 pH
计(上海康仪仪器有限公司)。
对照 品:腺 嘌 呤 (adenine，批 号:110886-
200001)、腺苷(adenosine，批号:110879-200202)、肌
苷(inosine，批号:140669-201104)、尿苷(uridine，批
号:110887-200202)购于中国药品生物制品检定所;
鸟苷(guanosine，批号:1001103046)购于美国 Sigma
公司，纯度大于 98%。硼砂、氢氧化钠为分析纯，实
验用水均为重蒸馏水。
牛樟芝样品 S1 ～ S10 为台湾长庚生物科技股份
有限公司提供的发酵菌粉，批号分别为:02L07，
02L11，02L14，02L18，02L21，02L25，02L28，03L04，
03L07，03L11。留样凭证存放于南京中医药大学中
药鉴定实验室。
2 方法与结果
2. 1 电泳条件
未涂渍标准熔融石英毛细管 75 μm × 64. 5 cm，
有效长度 56 cm(Agilent 科技有限公司) ;运行缓冲
液:60 mmol·L －1硼砂(pH 9. 3) ;检测波长:260 nm;
分离电压:22 kV;压力进样:50 mbar × 6 s;毛细管温
度:28 ℃。毛细管使用前依次用 0. 1 mmol·L －1氢氧
化钠溶液、重蒸馏水和运行缓冲液压力冲洗 5、10、5
min，样品分析间隔用 0. 1 mmol·L －1氢氧化钠溶液、
重蒸馏水、缓冲液平衡 3、5、5 min。上述试剂使用前
均经 0. 22 μm滤膜滤过，并超声脱气。
2. 2 对照品溶液制备
精密称定腺嘌呤 10. 30 mg，腺苷 9. 98 mg，尿苷
10. 00 mg，鸟苷 8. 08 mg，肌苷 10. 24 mg，分别置于
10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到各对照
品母液。分别取腺嘌呤 0. 5 mL、腺苷 2. 5 mL、尿苷
2. 5 mL、鸟苷 1. 25 mL 及肌苷 0. 625 mL 母液至 25
mL量瓶中，加水定容至刻度，制成腺嘌呤、腺苷、尿
苷、鸟苷、肌苷质量浓度分别为 20. 6、99. 8、100. 0、
40. 4、25. 6 μg·mL–1的混合对照品储备液。
2. 3 供试品溶液制备
取经50 ℃干燥48 h后的样品粉末0. 5 g，精密称
定，加蒸馏水5 mL超声(40 kHz，500 W)提取 40 min，
沸水加热 10 min，12 000 r·min －1离心 8 min，取上清
液，用 0. 22 μm滤膜过滤，作为供试品溶液。
2. 4 标准曲线、检测限与定量限
精密吸取混合对照品溶液 0. 5、1、2、3、4 mL 于
5 mL量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，将上述不同浓
度混合对照品溶液及混合对照品储备液进样测定，
以对照品的峰面积(Y)对相应的质量浓度(ρ)进行
线性回归，得回归方程、相关系数及线性范围;以各
化合物的信噪比等于 3(S /N = 3)时的相应浓度确
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定最低检测限(LOD) ;以各化合物的信噪比等于 10
(S /N = 10)时的相应浓度确定最低定量限(LOQ)。
结果见表 1。
2. 5 系统适用性实验
在选定的条件下注入供试品溶液，按 n = 5. 54
(tR /Wh /2)
2分别计算色谱柱理论塔板数 n;按 R = 2
(tR2 － tR1)/(W1 + W2)分别计算分离度 R。结果表
明，理论塔板数、分离度均达到相关要求。结果见表
2，图 1。
2. 6 方法学考察
精密度实验:取混合对照品溶液，重复进样 5
次，考察日内精密度;连续 3 d，进样分析考察日间精
密度，测得各对照品平均迁移时间、峰面积的相对标
准偏差(RSD)均分别小于 1. 34%、5. 87%。
稳定性实验:取供试品(S1)溶液，分别在 1、4、
8、16、24 h 进样 5 次，测得 5 种核苷的平均迁移时
间、峰面积的相对标准偏差(RSD)均小于 1. 18%、
5. 18%。
重复性实验:精密称取供试品(S1)5 份，每份
0. 5 g，分别按供试品溶液制备方法制备供试液，进
样测定，腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷的平均含量
分别为 18. 11、1887. 24、956. 43、749. 28、100. 24 μg·
g －1;RSD 分别为 2. 38%、4. 96%、1. 88%、2. 67%、
3. 24%。
表 1 5 种核苷对照品标准曲线、检测限与定量限
Tab. 1 Calibration curves，LODs and LOQs of five nucleosides
Component Regression equation Correlation coefficients (r) Linear range /μg·mL －1 LOD /μg·mL －1 LOQ /μg·mL －1
Adenine Y =6. 421ρ +3. 589 3 0. 999 5 2. 06 － 16. 48 0. 36 1. 22
Adenosine Y =1. 267 3ρ －0. 383 6 0. 999 8 9. 98 － 79. 84 0. 98 1. 88
Guanosine Y =1. 166 2ρ －0. 189 9 0. 999 6 10. 00 － 80. 00 0. 70 1. 96
Uridine Y =2. 483 1ρ +0. 026 8 0. 999 5 4. 04 － 32. 32 0. 82 1. 76
Inosine Y =2. 432 8ρ +0. 092 2 0. 999 5 2. 56 － 20. 48 0. 64 1. 64
表 2 5 种核苷类成分的系统适用性实验结果
Tab. 2 System adaptivity test of five nucleosides in Antrodia
camphorate
Component
Migration time
/min
Theoretical plate
number (n)
Resolution (R)
Ahead After
Adenine 6. 962 38 706 4. 75 8. 65
Adenosine 7. 747 104 858 8. 65 3. 98
Guanosine 8. 789 189 688 3. 98 3. 44
Uridine 10. 071 191 543 2. 44 6. 24
Inosine 11. 972 203 285 2. 64 4. 08
图 1 混合对照品(A)和牛樟芝样品(B)的 HPCE-DAD色谱图
Fig. 1 HPCE-DAD Chromatograms of mixed standards(A)and
Antrodia camphorate
加样回收率实验:取已知含量的样品(S1)0. 25 g(5
份) ，精密称定，分别精密加入一定量的腺嘌呤、腺
苷、尿苷、鸟苷及肌苷对照品，按“2. 3”制备方法制
备加样回收供试品液，并按样品测定方法进行测定，
计算回收率，结果表明，腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及
肌苷的平均回收率分别为 98. 83%、99. 83%、
101. 04%、99. 65%、101. 08%;RSD 分别为 3. 18%、
1. 75%、2. 61%、2. 82%、3. 27%，结果见表 3。
2. 7 样品分析
在选定的电泳优化条件下，将供试品溶液注入
高效毛细管电泳仪，进行测定。根据相应线性关系
计算样品中腺嘌呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷的含量。
结果见表 4。
3 讨 论
3. 1 泳条件优化
缓冲液的选择:实验考察了硼砂、硼砂-硼酸、硼
砂-甲醇、硼砂-氨水、乙酸钠-乙酸铵、磷酸氢二钠-磷
酸二氢钠体系的缓冲液，发现选用乙酸钠-乙酸铵缓
冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，5 种核苷分
离度很差，基本不能分开;选用硼砂-硼酸液分离效
果稍好，但仍有一些峰达不到基线分离;当选用硼
砂-甲醇及硼砂-氨水时，分离效果一般。经反复实
验确定以硼砂为缓冲液，5 种核苷分离效果最好。
·0201· Chin Pharm J，2013 June，Vol. 48 No. 12 中国药学杂志 2013 年 6 月第 48 卷第 12 期
表 3 5 种核苷类成分的加样回收率实验结果． n = 5
Tab. 3 Result of recovery test． n = 5
Reference
substance
m(Weight)
/g
m(Added)
/μg
m(Actual)
/μg
m(Average)
/%
RSD
/%
Adenine 0. 250 1 6. 2 12. 315 98. 83 3. 18
Adenosine 0. 250 8 450. 0 909. 84 99. 83 1. 75
Guanosine 0. 250 8 200. 0 406. 33 101. 4 2. 61
Uridine 0. 250 2 130. 0 267. 24 99. 65 2. 82
Inosine 0. 250 1 25. 0 49. 67 101. 08 3. 27
表 4 牛樟芝中 5 种核苷类成分含量测定结果． μg·g －1，
n = 2
Tab. 4 Contents of five nucleosides in Antrodia camphorata．
μg·g －1，n = 2
No. Adenine Adenosine Guanosine Uridine Inosine
S1 24. 78 1 796. 28 823. 78 536. 82 100. 25
S2 5. 11 1 914. 13 901. 43 621. 16 74. 12
S3 14. 28 2 317. 57 835. 02 802. 96 99. 18
S4 ND 2 042. 27 1 071. 85 766. 72 109. 95
S5 ND 1 917. 09 931. 91 759. 31 77. 23
S6 14. 47 1 992. 61 939. 12 756. 81 47. 59
S7 ND 1 794. 43 1 025. 38 700. 15 126. 51
S8 13. 57 1 886. 24 941. 26 786. 17 95. 35
S9 14. 5 1 925. 98 1 001. 79 757. 45 ND
S10 13. 92 2 060. 67 1 002. 75 806. 31 94. 24
故选择硼砂缓冲体系。
缓冲液浓度的选择:实验考察了 60 ～ 70
mmol·L －1的硼砂缓冲溶液，结果发现，迁移时间和
分离度随着缓冲液浓度的升高而减小。当缓冲液浓
度为 60 mmol·L －1时，样品各组分的峰形和分离度
较好，故选择缓冲液的浓度为 60 mmol·L －1。
缓冲液 pH的选择:缓冲液 pH是影响组分迁移
时间及分离度的重要因素，实验考察了 pH 9. 08 ～
9. 30 的缓冲液，发现随着 pH值的增大，各组分的分
离度增加而迁移时间延长，峰高亦增高，当 pH 为
9. 30 时 5 种核苷组分可达到基线基本分离，样品各
组分分离较好。故选择缓冲液的 pH为 9. 30。
运行电压的选择:实验考察了分离电压在
15 ～24 kV的条件下对各组分迁移时间的影响，实验
结果表明，分离电压过小，不能达到很好分离，当分离
电压为 22 kV时样品中各组分分离度较好，5 种核苷
可以达到基线分离。故选择分离电压为 22 kV。
检测波长的选择:采用二极管阵列检测器对检
测波长进行考察，记录并比较不同波长的色谱图，根
据分析物的紫外吸收特征，发现在 260 nm波长处，5
种核苷类成分均有较好的吸收，故选择 260 nm为检
测波长。
3. 2 实验结果分析
含量测定结果表明，不同批次牛樟芝菌粉中 5
种核苷类成分的含量有所差异。腺嘌呤以 S1 含量
较高，腺苷以 S3 含量较高，尿苷以 S4、S7 含量较高，
鸟苷以 S3、S10 含量较高，肌苷 S4、S7 含量较高，这
可能与发酵培养基质、培养条件等有关。牛樟芝菌
粉中 5 种核苷的含量高低顺序总体为:腺苷 ＞ 尿
苷 ＞鸟苷 ＞肌苷 ＞腺嘌呤，其核苷含量变化规律仍
需要进一步实验探讨。综上所述，核苷可作为评价
牛樟芝菌粉质量稳定和均一性的一项重要指标。
4 结 论
本实验建立了 HPCE 同时测定牛樟芝中腺嘌
呤、腺苷、尿苷、鸟苷及肌苷等 5 种核苷类成分含量
的方法，本方法准确、可靠，重现性较好，可用于牛樟
芝菌粉内在质量的评价和控制。
REFERENCES
［1］ WU S H，RYVAREDN L，CHANG T T． Antrodia camphorata
(“niu-chang-chih”) ，new combination of a medicinal fungus in
Taiwan［J］． Bot Bull Acad Sin，1997，38:273-275．
［2］ ZHANG D Z． Taiwan＇s unique precious medicinal fungus Antro-
dia camphorata［J］． Edible and Medicinal Mushrooms(食药用
菌) ，2011，19(1) :33-34．
［3］ CHEN T Q，FANG Z Y． Taiwan food (drugs)with bacteria de-
velopment status［J］． Fujian Agric Sci Technol(福建农业科
技) ，2000(1) :20-21．
［4］ CHRN C，YANG S． New steroid acids from Antrodia cinna-
momea，a fungal parasite of Cinnamomum micranthum［J］． J
Nat Prod，1995，58(11) :1655-1661．
［5］ CHENG I ，CHIANG H ，CHENG M，et al． Threenew trierpe-
noids from Antrodia cinnamomea［J］． J Nat Prod，1995，58
(3) :365-371．
［6］ YANG S，SHEN Y，CHEN C． Steroids and triterpenoids of Antrodia
cinnamomea-A fungus parasitic on Cinnamomum micranthum［J］．
Phytochemietry(植物化学)，1996，41(5):1389-1392．
［7］ CHERNG I，CHIANG H，WU D． Triterpenoids from Antrodia
cinnamomea［J］． Phytochemistry(植物化学) ，1996，41(5) :
263-267．
［8］ BALLARIN M，HERRERA-MARSCHITZ M，CASSA M，et al．
Striatal adenosine levels measured in vivo by microdialysis in rats
with unilateral dopamine denervation［J］． Neuroscience Letters
(神经学快报) ，1987，83(3) :338-344．
［9］ SCHMIDT A P，LARA D R，MARASCHIN J F，et al． Guanosine
and GMP prevent seizures induced by quinolinic acid in mice［J］．
Brain Res(脑研究)，2000，864(1):40-43．
［10］ XU W C，CHU Y J，LIN D，et al． Study on separation perform-
ance of capillary column coated physically with modified Hyper-
branched polycarbosilane［J］． Chin J Anal Chem(分析化学) ，
2010，38(8) :1167-1169．
［11］ SHI C Y，SUN G X，SONG W． Capillary eletrophoresis finger-
prints of Radix Scutellariae and determination of baicalin by CZE
［J］． Chin Tradit Pat Med(中成药) ，2008，30(4) :469-472．
［12］ CHEN F，LIU X H，YANG N Y，et al． Research Description of
Antrodia camphorata［J］． J Chin Med Mater(中药材) ，2011，
34(11) :1804-1808．
［13］ CHEN F，ZHANG F S，LIU X H，et al． The preliminary analysis
of the quality of Antrodia camphorata［J］． J Chin Med Mater(中
药材) ，2012，35(10) ，1623-1627.
(收稿日期:2012-07-23)
·1201·
中国药学杂志 2013 年 6 月第 48 卷第 12 期 Chin Pharm J，2013 June，Vol. 48 No. 12