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牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响



全 文 :第二军医大学学报  2014年1月第35卷第1期 http://www.ajsmmu.cn
Academic Journal of Second Military Medical University,Jan.2014,Vol.35,No.1
·43  ·
DOI:10.3724/SP.J.1008.2014.00043 ·论 著·
牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响
程利娟1,2,雷 虹2,郭 琪2,王彦宗2*
1.河北北方学院药理学教研室,张家口075000
2.北京军区联勤部药品仪器检验所中药室,北京100071
  [摘要] 目的 研究牛樟芝能否延长易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间,并运用蛋白质组学方法对其作用机制进
行探讨。方法 先选取80只雄性易卒中的自发性高血压大鼠,随机分为给药组和对照组(每组40只),给药组每天用牛樟芝
(150mg/kg)灌胃治疗,记录卒中大鼠的自然死亡时间。另外再选取6只易卒中的自发性高血压大鼠,随机分为给药组和对照
组(每组3只),给药组给予牛樟芝灌胃治疗(150mg/kg),连续90d后取大鼠脑组织进行蛋白质组学研究,用 WKY大鼠作为
正常对照,对用药前后产生的差异蛋白点进行质谱鉴定,并用蛋白质印迹法进一步验证组学的鉴定结果。结果 牛樟芝延长
了易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间(P<0.05),蛋白质组学鉴定结果显示牛樟芝上调了脑组织抗氧化酶谷胱甘肽巯基
转移酶(GST)和超氧化物歧化酶(SOD)的表达(P<0.05),这一结果得到了蛋白质印迹法的验证。对脑组织氧化应激水平的
研究发现机体的总抗氧化能力增强[T-AOC:(66.48±16.17)U/g vs(124.75±28.43)U/g,P<0.05),表现在 GST和
SOD的酶活性增加[GST:(40.33±5.24)U/mg vs(70.50±6.24)U/mg,P<0.05;SOD:(109.25±23.61)U/mg vs(192.
60±23.95)U/mg,P<0.05],而氧化应激产物丙二醛含量减少[(3.96±0.45)nmol/mg vs(2.04±0.31)nmol/mg,P<0.
05]。结论 长期服用牛樟芝能延长易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间,这可能与其增加脑组织抗氧化酶的表达、减轻
氧化应激的损伤有关。
  [关键词] 牛樟芝;易卒中的自发性高血压大鼠;卒中;氧化性应激;脑;蛋白质组学
  [中图分类号] R 286.2;R 544.1   [文献标志码] A   [文章编号] 0258-879X(2014)01-0043-06
Effect of Antrodia cinnamomea on brain proteomics in stroke-prone spontaneously hypertensive rats
CHENG Li-juan1,2,LEI Hong2,GUO Qi 2,WANG Yan-zong2*
1.Department of Pharmacology,Hebei North University,Zhangjiakou 075000,Hebei,China
2.Division of Traditional Chinese Medicine Testing,Institute for Drug and Instrument Control,The Joint Logistics
Department,PLA Beijing Military Area Command,Beijing 100071,China
[收稿日期] 2013-06-27    [接受日期] 2013-09-04
[基金项目] 军队中医药科研专项课题(10ZYZ204).Supported by Research Project for Military Traditional Chinese Medicine(10ZYZ204).
[作者简介] 程利娟,硕士生.E-mail:chenglj_2012@163.com
*通信作者(Corresponding author).Tel:010-66716347,E-mail:13701081036@139.com
  [Abstract] Objective To explore whether Antrodiacinnamomeacan prolong the survival time of stroke-prone
spontaneously hypertensive rats,and to investigate the underlying mechanisms from the proteomics perspective.Methods A
total of 80male stroke-prone spontaneously hypertensive rats were randomly divided into two groups(control group and
Antrodia cinnamomea treated group,n=40).The animals were intragastricaly given Antrodia cinnamomea (150mg/kg).
Then the death of the animals in the two groups was observed.Another 6stroke-prone spontaneously hypertensive rats were
randomly divided into drug treatment group and control group,with the drug treatment group intragastricaly given Antrodia
cinnamomea (150mg/kg),and the brain proteomics were compared between the two groups 90days later,with WKY rats used
as normal controls.The differentialy expressed proteins before and after drug treatment were subjected to mass spectrometry
analysis,and the results of mass spectrometry analysis were further confirmed by Western blotting analysis.Results Antrodia
cinnamomeasignificantly prolonged the survival time of stroke-prone spontaneously hypertensive rats(P<0.05),and
proteomics results showed that Antrodia cinnamomea increased the expression of glutathione S-transferase(GST)and
superoxide dismutase(SOD),which were also confirmed by Western blotting analysis.Further study revealed that the total anti
· 44  · 第二军医大学学报 2014年1月,第35卷
-oxidative capability(T-AOC)of the animals was increased(T-AOC:[66.48±16.17]U/g vs[124.75±28.43]U/g,P
<0.05),which was manifested by the increased activity of GST and SOD(GST:[40.33±5.24]U/mg vs[70.50±6.24]U/
mg,P<0.05;SOD:[109.25±23.61]U/mg vs[192.60±23.95]U/mg,P<0.05),and decreased level of malondialdehyde
([3.96±0.45]nmol/mg vs[2.04±0.31]nmol/mg,P<0.05).Conclusion Long-term treatment with Antrodia
cinnamomea can prolong the lifespan of stroke-prone spontaneously hypertensive rats,which might be related to the increased
activity of anti-oxidative enzymes and the decreased oxidative damage.   
  [Key words] Antrodia cinnamomea;stroke-prone spontaneously hypertensive rats;stroke;oxidative stress;brain;pro-
teomics
[Acad J Sec Mil Med Univ,2014,35(1):43-48]
  易卒中的自发性高血压大鼠(stroke-prone
spontaneously hypertensive rats,SHRSPs)是从自
发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,
SHRs)中通过选择性交配,再经继代近亲繁殖培育
而成[1]。该品系的大鼠脑卒中的发生率在90%以
上,因此SHRSPs被广泛用于高血压诱导脑卒中的
发生发展机制研究。目前,已有很多传统药物被证
实具有心血管保护作用,可在一定程度上减轻脑血
管病变的严重程度[2-3]。
  牛樟芝(Antrodia cinnamomea)又名牛樟菇,属
于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类,主要含有多糖
体、三萜类化合物、腺苷等多种生理活性成分。已有
研究证实牛樟芝具有免疫调节、抗肿瘤、抗血栓等多
种生物学活性[4-6]。牛樟芝体内含有的三萜类化合
物能有效抑制血管紧张素的活性,发挥降血压作用。
此外,有学者发现牛樟芝抗炎、抗血小板聚集、抗氧
化活性与其体内含有的多糖类物质有关[7]。因此,
牛樟芝可能对易发脑卒中的高血压患者具有潜在的
防治效应,而目前并无相关报道。本研究旨在明确
长期服用牛樟芝对SHRSPs是否具有保护作用,能
否延长SHRSPs的生存时间,并进一步运用蛋白质
组学方法对其机制进行探讨。
1 材料和方法
1.1 药物、动物及试剂 药物牛樟芝于2012年8
月购自宏潮生物健康科技推广中心,并经解放军302
医院药学部临床药理研究室黄正明教授鉴定。
SHRSPs购自上海斯莱克实验动物有限公司,动物
许可证号:SCXK(沪)2009-0015。Wistar Kyoto
(WKY)大鼠(雄性,180~220g)购自军事医学科学
院动物中心,动物许可证号:SCXK-(军)-2007-
004。固相pH梯度干胶条(IPG strip pH 3~10,17
cm,Bio-Rad公司),尿素(Sigma公司),硫脲(Sig-
ma公司),3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸
内盐(CHAPS,Amresco公司),两性电解质(Bio-
Lyte,Bio-Rad公司),矿物油(Bio-Rad公司),二
硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT;Merk公司),Tris-
HCl(上海增健生物科技有限公司),十二烷基苯磺
酸钠(sodium dodecyl sulfonate,SDS;Bio-Rad公
司),碘乙酰胺(Bio-Rad公司),过硫酸铵(ammoni-
um persulfate,AP;Bio-Rad公司),40%丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺配胶液为291(上海增健生物科
技有限公司),四甲基二乙胺(N,N,N′,N′-tetram-
ethylethylenediamine,TEMED;Sigma公司)。谷胱
甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase,GST)
抗体和超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,
SOD)抗体均购自Santa Cruz公司。总抗氧化能力
(T-AOC)检测试剂盒、GST活性检测试剂盒、SOD
活性检测试剂盒以及丙二醛 (malondialdehyde,
MDA)检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究
所。
1.2 仪器设备 Eppendorf冷冻离心机、等电聚焦
电泳仪、垂直电泳仪、凝胶成像扫描仪购自Bio-Rad
公司,Odyssey红外激光成像系统购自 LI-COR
公司。
1.3 动物分组 80只SHRSPs(5月龄,雄性)随机
分为对照组和牛樟芝给药组,每组40只。牛樟芝给
药组采用灌胃治疗,剂量为150mg/kg,连续给药,
每天1次,观察并记录大鼠的死亡时间。
  另外再取6只SHRSPs(5月龄,雄性)随机分为
第1期.程利娟,等.牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响 · 45  ·
对照组和牛樟芝给药组,每组3只。牛樟芝给药组
采用灌胃治疗,剂量为150mg/kg,连续给药,每天1
次,连续90d。用3只 WKY大鼠作为正常对照。
实验结束后取脑组织进行二维电泳。
1.4 蛋白质抽提及蛋白浓度测定 处死大鼠,取全
脑,置于冰冷的PBS中洗净血液,然后放入预冷的匀
浆管中加入5mL蛋白提取液(裂解液),冰上匀浆至
无肉眼可见的组织块。冰上孵育 40 min。4℃
10 000×g离心20min,取上清。运用2-D Quant
试剂盒进行浓度测定。具体步骤见参考文献[8]。
1.5 电泳 第一向等电聚焦电泳(IEF)程序:30V
6h,60V6h,100V1h,200V1h,500V1h,1 000
V 1h,1 000~8 000V30min,8 000V7.5h。
  在等电聚焦电泳结束时,将胶条在平衡液Ⅰ和
Ⅱ中分别平衡14min,再进行垂直电泳。第二向电
泳程序:80V30min,280V4h。电泳结束后进行
银染,所有步骤均在摇床上进行。凝胶图像分析用
Molecular Image Fx激光图像扫描仪扫描,两组间
的差异点比较采用PDQuest 6.0软件完成。
1.6 差异蛋白点的鉴定 将有显著差异的蛋白点
进行质谱鉴定,采用 MALTI-TOF-TOF(二级串
联质谱)技术,质谱流程见参考文献[9]。用蛋白质
印迹法对有差异的蛋白点进行重复验证。按文献
[9]介绍的步骤,依次进行上样、电泳(80V30min,
120V2~3h)、转膜(100V60min)、封闭(5%脱脂
奶粉,37℃1h)、一抗孵育(室温,3h)、二抗孵育(室
温,1h),然后扫描(参数设置:激发光波长为700
nm,800nm;分辨率84μm)。
1.7 氧化应激指标检测 GST活性、SOD活性、
MDA水平以及T-AOC检测采用南京建成生物工
程研究所的相关试剂盒检测。在岛津 UV-265双
光道紫外分光光度计上测定光密度,并根据说明书
上的公式计算相应指标。
1.8 统计学处理 实验数据应用SPSS 11.0统计
软件进行分析,计量资料以珚x±s表示,组间比较采
用t检验。生存分析时,生存时间以中位生存时间
表示,生存率的非参数估计法采用 Kaplan-Meier
法,生存曲线的比较采用Log-rank检验。检验水
准(α)为0.05。
2 结 果
2.1 长期服用牛樟芝对SHRSPs生存曲线的影
响 从图1可以看出,与未服药的SHRSPs大鼠相
比,在长期服用牛樟芝后SHRSPs因发生脑卒中导
致死亡的时间延后(P<0.05)。表明牛樟芝对
SHRSPs具有保护作用,长期服用牛樟芝可以延长
SHRSPs的寿命。
图1 两组SHRSPs生存曲线
Fig 1 Survival curves in stroke-prone spontaneously
hypertensive rats in two groups
2.2 长期服用牛樟芝后SHRSPs全脑蛋白质组学
分析 如图2A~2C所示,服用牛樟芝后SHRSPs
脑组织中有2个蛋白点的表达量增加,经过质谱鉴
定,发现是与氧化应激有关的蛋白GST pi2亚基和
SOD。进一步经蛋白质印迹法验证,证实服用牛樟
芝后SHRSPs脑组织中 GST和SOD的表达增加
(图2D、2E)。
  从图2E可见,与正常对照 WKY大鼠相比,未
服牛樟芝的SHRSPs脑组织SOD和GST的活性均
出现下调(P 均<0.05)。服用牛樟芝后,SHRSPs
脑组织GST和SOD的活性均上调(P均<0.05)。
2.3 长期服用牛樟芝对SHRSPs脑组织氧化应激
相关指标的影响 结果如表1所示,与未服牛樟芝
的SHRSPs相比,服用牛樟芝后,SHRSPs脑组织T
-AOC增强(P<0.05),表现为服药后脑组织
GST和SOD的活性增加(P<0.05),而氧化应激代
谢产物 MDA的含量下降(P<0.05)。与正常对照
WKY大鼠相比较,未服用牛樟芝的SHRSPs脑组
织GST和SOD活性下调(P<0.05),这与蛋白质印
迹分析法所得结果一致,而反映机体整体氧化程度
的 MDA水平上调(P<0.05),T-AOC相应降低
(P<0.05)。    
· 46  · 第二军医大学学报 2014年1月,第35卷
图2 牛樟芝给药后SHRSPs脑组织的蛋白质组学分析和蛋白质印迹分析验证
Fig 2 Proteomic analysis for differentialy expressed proteins of the brain from SHRSPs
treated with Antrodia cinnamomea and confirmation by Western blotting analysis
A,B,C:Images of the brains in WKY rats,stroke-prone spontaneously hypertensive rats(SHRSPs-Con),and SHRSPs
treated with Antrodia cinnamomea (SHRSPs-AC),respectively;D:Western blotting analysis of glutathione S-transferase
(GST)and superoxide dismutase(SOD)in brains of WKY rats,SHRSPs-Con and SHRSPs-AC;E:Normalized density of GST and
SOD by Western blotting analysis.*P<0.05vs SHRSPs-Con group.n=3,珔x±s
表1 牛樟芝对SHRSPs脑氧化应激相关指标的影响
Tab 1 Effects of Antrodia cinnamomea on oxidative stress parameters in the brains
of stroke-prone spontaneously hypertensive rats(SHRSPs)
n=3,珚x±s
Group GSTzB/(U·mg-1)
SOD
zB/(U·mg-1)
MDA
mB/(nmol·mg-1)
T-AOC
zB/(U·g-1)
WKY  76.52±5.97* 148.59±17.44* 2.67±0.19* 102.25±18.22*
SHRSPs-Control  40.33±5.24  109.25±23.61  3.96±0.45  66.48±16.17
SHRSPs-Antrodia cinnamomea  70.50±6.24* 192.60±23.95* 2.04±0.31* 124.75±28.43*
 GST:Glutathione S-transferase;SOD:Superoxide dismutase;MDA:Malondialdehyde;T-AOC:Total antioxidative ca-
pability.*P<0.05vs SHRSPs-Control group
3 讨 论
  目前,以脑卒中为主要表现的脑血管病已成为
世界上成年人的第3位致死和第1位致残原因[10]。
流行病学研究表明,我国每年有150~200万新发卒
中的病例[11]。脑卒中存活的患者绝大部分丧失了
不同程度的生活自理能力,给家庭和社会带来沉重
的负担。目前,对于脑卒中的预防尚没有十分理想
的方法,主要是针对其各种危险因素进行干预,从而
延缓卒中高危患者发生卒中的时间[12-13]。SHRSPs
是一种以高血压为主要表现的大鼠,并且该类雄性
大鼠自发脑卒中的时间为10个月龄左右,发生率在
90%以上,是一种非常理想的研究脑卒中的病理
模型。
  在本研究中,我们发现长期给予SHRSPs牛樟
芝灌胃治疗可以延长其生存时间,表明牛樟芝对于
高血压诱发的脑卒中有防治作用。牛樟芝是产于台
湾的一种较为珍贵的中药材,目前对于它的研究报
道相对较少,而且主要集中在抗肿瘤和免疫调节方
面。有学者发现从牛樟芝中提取的三萜类化合物具
有广谱的抗肿瘤活性,体外实验证明三萜类化合物
能通过caspase和Bax介导的凋亡通路诱导肿瘤细
第1期.程利娟,等.牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响 · 47  ·
胞程序性死亡[14]。而腹腔注射半萜内酯化合物
antrocin则可以抑制非小细胞肺癌的生长,其抗肿
瘤活性与antrocin抑制了JAK2/STAT3通路有
关[4]。另外,从牛樟芝中提取的多糖分子还能减轻
多重细菌败血症小鼠体内的炎症反应,表明牛樟芝
是一种具有多重生物学活性的中药材[7]。本研究首
次发现牛樟芝能延长SHRSPs的生存时间,表明牛
樟芝能对高血压诱发的脑卒中具有潜在的保护效
应。我们随后测定了长期服用牛樟芝后SHRSPs
的血压值,尽管用药后SHRSPs的血压出现下降趋
势,但差异无统计学意义(数据未展示),提示牛樟芝
的这种保护效应可能与血压调节无关。
  Marc Wilkins在1995年提出了蛋白质组学这
一理念,其本质上指的是在大规模水平上研究蛋白
质的特征。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律
提供物质基础,也能为众多疾病机制的阐明提供理
论根据和解决途径。在本研究中,我们运用蛋白质
组学的手段比较了服用牛樟芝前后SHRSPs脑组
织蛋白质的表达差异,发现有2个蛋白点的表达量
增加,经过质谱鉴定为机体参与抗氧化的蛋白酶
GST pi2亚基和SOD。这2种蛋白酶构成了机体抗
氧化系统的重要组成部分,并被广泛报道能对抗机
体的氧化应激造成的各种损伤。运用遗传学的手段
造成GST表达缺陷的小鼠往往更容易受到氧化应
激的伤害[15],而过度表达 GST则能增加生物体抗
击应激的能力[16]。条件敲除小鼠骨骼肌的SOD会
加重氧化应激对肌肉的损害[17]。而在生理情况下,
大脑中的抗氧化酶类的含量均较低,加之其又富含
脂质,因此是最容易受到氧化应激损伤的器官。氧
化应激参与了多种脑部疾病的发生及发展过程,通
过抗氧化干预能有效地缓解病情的恶化[18]。有学
者指出,长期给予SHRSPs以抗氧化剂维生素C和
维生素E可以减少大鼠急性大脑中动脉栓塞后的脑
梗死面积,同时也能在一定程度上缓解其血压的增
高,这可能是其发挥保护作用的关键机制[19]。此
外,日常抗氧化饮品绿茶也被证明能通过减轻
SHRSPs的血管壁的氧化应激水平发挥预防脑血管
疾病的保护功能[20]。大规模人群的流行病学调查
研究也证实了长期服用绿茶可以降低卒中的发生
率[21]。因此抗氧化可以作为防治脑卒中的一种治
疗策略。在本研究中我们发现牛樟芝服用后可以上
调SHRSPs脑组织中GST和SOD的活性,可以增
强机体的抗氧化能力,减少氧化应激的产物产生,并
最终延长了SHRSPs的生存时间,意味着牛樟芝可
能成为延缓卒中发作的一个新型药物。
  但是本研究并没有明确是牛樟芝中的何种成分
发挥了抗氧化效应,并且在有高血压基础的SHR-
SPs上联合应用降压药和牛樟芝是否能产生协同效
应,以及对卒中的发作能否产生更大的保护作用还
不清楚,这都将是我们进一步研究和努力的方向。
4 利益冲突
  所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
[参 考 文 献]
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[本文编辑] 尹 茶