全 文 ：第二军医大学学报 　２０１４年１月第３５卷第１期 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｊｓｍｍｕ．ｃｎ
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊａｎ．２０１４，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．１
·４３　 ·
ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００８．２０１４．０００４３ ·论　著·
牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响
程利娟１，２，雷　虹２，郭　琪２，王彦宗２＊
１．河北北方学院药理学教研室，张家口０７５０００
２．北京军区联勤部药品仪器检验所中药室，北京１０００７１
　　［摘要］　目的　研究牛樟芝能否延长易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间，并运用蛋白质组学方法对其作用机制进
行探讨。方法　先选取８０只雄性易卒中的自发性高血压大鼠，随机分为给药组和对照组（每组４０只），给药组每天用牛樟芝
（１５０ｍｇ／ｋｇ）灌胃治疗，记录卒中大鼠的自然死亡时间。另外再选取６只易卒中的自发性高血压大鼠，随机分为给药组和对照
组（每组３只），给药组给予牛樟芝灌胃治疗（１５０ｍｇ／ｋｇ），连续９０ｄ后取大鼠脑组织进行蛋白质组学研究，用 ＷＫＹ大鼠作为
正常对照，对用药前后产生的差异蛋白点进行质谱鉴定，并用蛋白质印迹法进一步验证组学的鉴定结果。结果　牛樟芝延长
了易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间（Ｐ＜０．０５），蛋白质组学鉴定结果显示牛樟芝上调了脑组织抗氧化酶谷胱甘肽巯基
转移酶（ＧＳＴ）和超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）的表达（Ｐ＜０．０５），这一结果得到了蛋白质印迹法的验证。对脑组织氧化应激水平的
研究发现机体的总抗氧化能力增强［Ｔ－ＡＯＣ：（６６．４８±１６．１７）Ｕ／ｇ　ｖｓ（１２４．７５±２８．４３）Ｕ／ｇ，Ｐ＜０．０５），表现在 ＧＳＴ和
ＳＯＤ的酶活性增加［ＧＳＴ：（４０．３３±５．２４）Ｕ／ｍｇ　ｖｓ（７０．５０±６．２４）Ｕ／ｍｇ，Ｐ＜０．０５；ＳＯＤ：（１０９．２５±２３．６１）Ｕ／ｍｇ　ｖｓ（１９２．
６０±２３．９５）Ｕ／ｍｇ，Ｐ＜０．０５］，而氧化应激产物丙二醛含量减少［（３．９６±０．４５）ｎｍｏｌ／ｍｇ　ｖｓ（２．０４±０．３１）ｎｍｏｌ／ｍｇ，Ｐ＜０．
０５］。结论　长期服用牛樟芝能延长易卒中的自发性高血压大鼠的生存时间，这可能与其增加脑组织抗氧化酶的表达、减轻
氧化应激的损伤有关。
　　［关键词］　牛樟芝；易卒中的自发性高血压大鼠；卒中；氧化性应激；脑；蛋白质组学
　　［中图分类号］　Ｒ　２８６．２；Ｒ　５４４．１　　　［文献标志码］　Ａ　　　［文章编号］　０２５８－８７９Ｘ（２０１４）０１－００４３－０６
Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　ｏｎ　ｂｒａｉｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｉｎ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ
ＣＨＥＮＧ　Ｌｉ－ｊｕａｎ１，２，ＬＥＩ　Ｈｏｎｇ２，ＧＵＯ　Ｑｉ　２，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ－ｚｏｎｇ２＊
１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｈｅｂｅｉ　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｇｊｉａｋｏｕ　０７５０００，Ｈｅｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ
２．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｔｅｓｔｉｎｇ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｄｒｕｇ　ａｎｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｔｈｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ＰＬＡ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ａｒｅａ　Ｃｏｍｍａｎｄ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００７１，Ｃｈｉｎａ
［收稿日期］　２０１３－０６－２７　　　　［接受日期］　２０１３－０９－０４
［基金项目］　军队中医药科研专项课题（１０ＺＹＺ２０４）．Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　ｆｏｒ　Ｍｉｌｉｔａｒｙ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１０ＺＹＺ２０４）．
［作者简介］　程利娟，硕士生．Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｅｎｇｌｊ＿２０１２＠１６３．ｃｏｍ
＊通信作者（Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ）．Ｔｅｌ：０１０－６６７１６３４７，Ｅ－ｍａｉｌ：１３７０１０８１０３６＠１３９．ｃｏｍ
　　［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｗｈｅｔｈｅｒ　Ａｎｔｒｏｄｉａｃｉｎｎａｍｏｍｅａｃａｎ　ｐｒｏｌｏｎｇ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ
ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ，ａｎｄ　ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａ
ｔｏｔａｌ　ｏｆ　８０ｍａｌｅ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ
Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｇｒｏｕｐ，ｎ＝４０）．Ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌｓ　ｗｅｒｅ　ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｌｙ　ｇｉｖｅｎ　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ （１５０ｍｇ／ｋｇ）．
Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｄｅａｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ａｎｏｔｈｅｒ　６ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ
ｒａｎｄｏｍｌｙ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　ｄｒｕｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｒｕｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｇｒｏｕｐ　ｉｎｔｒａｇａｓｔｒｉｃａｌｙ　ｇｉｖｅｎ　Ａｎｔｒｏｄｉａ
ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ （１５０ｍｇ／ｋｇ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ　ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　９０ｄａｙｓ　ｌａｔｅｒ，ｗｉｔｈ　ＷＫＹ　ｒａｔｓ　ｕｓｅｄ
ａｓ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｂｅｆｏｒｅ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｄｒｕｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ　ｔｏ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ａｎｔｒｏｄｉａ
ｃｉｎｎａｍｏｍｅａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ（Ｐ＜０．０５），ａｎｄ
ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴ）ａｎｄ
ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ），ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ａｌｓｏ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｙ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ａｎｔｉ
· ４４　 · 第二军医大学学报　２０１４年１月，第３５卷
－ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ（Ｔ－ＡＯＣ）ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｉｍａｌｓ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｔ－ＡＯＣ：［６６．４８±１６．１７］Ｕ／ｇ　ｖｓ［１２４．７５±２８．４３］Ｕ／ｇ，Ｐ
＜０．０５），ｗｈｉｃｈ　ｗａｓ　ｍａｎｉｆｅｓｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＧＳＴ　ａｎｄ　ＳＯＤ（ＧＳＴ：［４０．３３±５．２４］Ｕ／ｍｇ　ｖｓ［７０．５０±６．２４］Ｕ／
ｍｇ，Ｐ＜０．０５；ＳＯＤ：［１０９．２５±２３．６１］Ｕ／ｍｇ　ｖｓ［１９２．６０±２３．９５］Ｕ／ｍｇ，Ｐ＜０．０５），ａｎｄ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ
（［３．９６±０．４５］ｎｍｏｌ／ｍｇ　ｖｓ［２．０４±０．３１］ｎｍｏｌ／ｍｇ，Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｒｏｄｉａ
ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　ｃａｎ　ｐｒｏｌｏｎｇ　ｔｈｅ　ｌｉｆｅｓｐａｎ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ，ｗｈｉｃｈ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｄａｍａｇｅ．　　　
　　［Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ］　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ；ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ；ｓｔｒｏｋｅ；ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ；ｂｒａｉｎ；ｐｒｏ－
ｔｅｏｍｉｃｓ
［Ａｃａｄ　Ｊ　Ｓｅｃ　Ｍｉｌ　Ｍｅｄ　Ｕｎｉｖ，２０１４，３５（１）：４３－４８］
　　易卒中的自发性高血压大鼠（ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ
ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ，ＳＨＲＳＰｓ）是从自
发性高血压大鼠（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ，
ＳＨＲｓ）中通过选择性交配，再经继代近亲繁殖培育
而成［１］。该品系的大鼠脑卒中的发生率在９０％以
上，因此ＳＨＲＳＰｓ被广泛用于高血压诱导脑卒中的
发生发展机制研究。目前，已有很多传统药物被证
实具有心血管保护作用，可在一定程度上减轻脑血
管病变的严重程度［２－３］。
　　牛樟芝（Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）又名牛樟菇，属
于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌类，主要含有多糖
体、三萜类化合物、腺苷等多种生理活性成分。已有
研究证实牛樟芝具有免疫调节、抗肿瘤、抗血栓等多
种生物学活性［４－６］。牛樟芝体内含有的三萜类化合
物能有效抑制血管紧张素的活性，发挥降血压作用。
此外，有学者发现牛樟芝抗炎、抗血小板聚集、抗氧
化活性与其体内含有的多糖类物质有关［７］。因此，
牛樟芝可能对易发脑卒中的高血压患者具有潜在的
防治效应，而目前并无相关报道。本研究旨在明确
长期服用牛樟芝对ＳＨＲＳＰｓ是否具有保护作用，能
否延长ＳＨＲＳＰｓ的生存时间，并进一步运用蛋白质
组学方法对其机制进行探讨。
１　材料和方法
１．１　药物、动物及试剂　药物牛樟芝于２０１２年８
月购自宏潮生物健康科技推广中心，并经解放军３０２
医院药学部临床药理研究室黄正明教授鉴定。
ＳＨＲＳＰｓ购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物
许可证号：ＳＣＸＫ（沪）２００９－００１５。Ｗｉｓｔａｒ　Ｋｙｏｔｏ
（ＷＫＹ）大鼠（雄性，１８０～２２０ｇ）购自军事医学科学
院动物中心，动物许可证号：ＳＣＸＫ－（军）－２００７－
００４。固相ｐＨ梯度干胶条（ＩＰＧ　ｓｔｒｉｐ　ｐＨ　３～１０，１７
ｃｍ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），尿素（Ｓｉｇｍａ公司），硫脲（Ｓｉｇ－
ｍａ公司），３－［３－（胆酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸
内盐（ＣＨＡＰＳ，Ａｍｒｅｓｃｏ公司），两性电解质（Ｂｉｏ－
Ｌｙｔｅ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），矿物油（Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），二
硫苏糖醇（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，ＤＴＴ；Ｍｅｒｋ公司），Ｔｒｉｓ－
ＨＣｌ（上海增健生物科技有限公司），十二烷基苯磺
酸钠（ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ＳＤＳ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ公
司），碘乙酰胺（Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），过硫酸铵（ａｍｍｏｎｉ－
ｕｍ　ｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ，ＡＰ；Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），４０％丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺配胶液为２９１（上海增健生物科
技有限公司），四甲基二乙胺（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－ｔｅｔｒａｍ－
ｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ，ＴＥＭＥＤ；Ｓｉｇｍａ公司）。谷胱
甘肽巯基转移酶（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＧＳＴ）
抗体和超氧化物歧化酶 （ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ，
ＳＯＤ）抗体均购自Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司。总抗氧化能力
（Ｔ－ＡＯＣ）检测试剂盒、ＧＳＴ活性检测试剂盒、ＳＯＤ
活性检测试剂盒以及丙二醛 （ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ，
ＭＤＡ）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究
所。
１．２　仪器设备　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ冷冻离心机、等电聚焦
电泳仪、垂直电泳仪、凝胶成像扫描仪购自Ｂｉｏ－Ｒａｄ
公司，Ｏｄｙｓｓｅｙ红外激光成像系统购自 ＬＩ－ＣＯＲ
公司。
１．３　动物分组　８０只ＳＨＲＳＰｓ（５月龄，雄性）随机
分为对照组和牛樟芝给药组，每组４０只。牛樟芝给
药组采用灌胃治疗，剂量为１５０ｍｇ／ｋｇ，连续给药，
每天１次，观察并记录大鼠的死亡时间。
　　另外再取６只ＳＨＲＳＰｓ（５月龄，雄性）随机分为
第１期．程利娟，等．牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响 · ４５　 ·
对照组和牛樟芝给药组，每组３只。牛樟芝给药组
采用灌胃治疗，剂量为１５０ｍｇ／ｋｇ，连续给药，每天１
次，连续９０ｄ。用３只 ＷＫＹ大鼠作为正常对照。
实验结束后取脑组织进行二维电泳。
１．４　蛋白质抽提及蛋白浓度测定　处死大鼠，取全
脑，置于冰冷的ＰＢＳ中洗净血液，然后放入预冷的匀
浆管中加入５ｍＬ蛋白提取液（裂解液），冰上匀浆至
无肉眼可见的组织块。冰上孵育 ４０ ｍｉｎ。４℃
１０　０００×ｇ离心２０ｍｉｎ，取上清。运用２－Ｄ　Ｑｕａｎｔ
试剂盒进行浓度测定。具体步骤见参考文献［８］。
１．５　电泳　第一向等电聚焦电泳（ＩＥＦ）程序：３０Ｖ
６ｈ，６０Ｖ６ｈ，１００Ｖ１ｈ，２００Ｖ１ｈ，５００Ｖ１ｈ，１　０００
Ｖ　１ｈ，１　０００～８　０００Ｖ３０ｍｉｎ，８　０００Ｖ７．５ｈ。
　　在等电聚焦电泳结束时，将胶条在平衡液Ⅰ和
Ⅱ中分别平衡１４ｍｉｎ，再进行垂直电泳。第二向电
泳程序：８０Ｖ３０ｍｉｎ，２８０Ｖ４ｈ。电泳结束后进行
银染，所有步骤均在摇床上进行。凝胶图像分析用
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍａｇｅ　Ｆｘ激光图像扫描仪扫描，两组间
的差异点比较采用ＰＤＱｕｅｓｔ　６．０软件完成。
１．６　差异蛋白点的鉴定　将有显著差异的蛋白点
进行质谱鉴定，采用 ＭＡＬＴＩ－ＴＯＦ－ＴＯＦ（二级串
联质谱）技术，质谱流程见参考文献［９］。用蛋白质
印迹法对有差异的蛋白点进行重复验证。按文献
［９］介绍的步骤，依次进行上样、电泳（８０Ｖ３０ｍｉｎ，
１２０Ｖ２～３ｈ）、转膜（１００Ｖ６０ｍｉｎ）、封闭（５％脱脂
奶粉，３７℃１ｈ）、一抗孵育（室温，３ｈ）、二抗孵育（室
温，１ｈ），然后扫描（参数设置：激发光波长为７００
ｎｍ，８００ｎｍ；分辨率８４μｍ）。
１．７　氧化应激指标检测　ＧＳＴ活性、ＳＯＤ活性、
ＭＤＡ水平以及Ｔ－ＡＯＣ检测采用南京建成生物工
程研究所的相关试剂盒检测。在岛津 ＵＶ－２６５双
光道紫外分光光度计上测定光密度，并根据说明书
上的公式计算相应指标。
１．８　统计学处理　实验数据应用ＳＰＳＳ　１１．０统计
软件进行分析，计量资料以珚ｘ±ｓ表示，组间比较采
用ｔ检验。生存分析时，生存时间以中位生存时间
表示，生存率的非参数估计法采用 Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ
法，生存曲线的比较采用Ｌｏｇ－ｒａｎｋ检验。检验水
准（α）为０．０５。
２　结　果
２．１　长期服用牛樟芝对ＳＨＲＳＰｓ生存曲线的影
响　从图１可以看出，与未服药的ＳＨＲＳＰｓ大鼠相
比，在长期服用牛樟芝后ＳＨＲＳＰｓ因发生脑卒中导
致死亡的时间延后（Ｐ＜０．０５）。表明牛樟芝对
ＳＨＲＳＰｓ具有保护作用，长期服用牛樟芝可以延长
ＳＨＲＳＰｓ的寿命。
图１　两组ＳＨＲＳＰｓ生存曲线
Ｆｉｇ　１　Ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｃｕｒｖｅｓ　ｉｎ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ
ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ
２．２　长期服用牛樟芝后ＳＨＲＳＰｓ全脑蛋白质组学
分析　如图２Ａ～２Ｃ所示，服用牛樟芝后ＳＨＲＳＰｓ
脑组织中有２个蛋白点的表达量增加，经过质谱鉴
定，发现是与氧化应激有关的蛋白ＧＳＴ　ｐｉ２亚基和
ＳＯＤ。进一步经蛋白质印迹法验证，证实服用牛樟
芝后ＳＨＲＳＰｓ脑组织中 ＧＳＴ和ＳＯＤ的表达增加
（图２Ｄ、２Ｅ）。
　　从图２Ｅ可见，与正常对照 ＷＫＹ大鼠相比，未
服牛樟芝的ＳＨＲＳＰｓ脑组织ＳＯＤ和ＧＳＴ的活性均
出现下调（Ｐ 均＜０．０５）。服用牛樟芝后，ＳＨＲＳＰｓ
脑组织ＧＳＴ和ＳＯＤ的活性均上调（Ｐ均＜０．０５）。
２．３　长期服用牛樟芝对ＳＨＲＳＰｓ脑组织氧化应激
相关指标的影响　结果如表１所示，与未服牛樟芝
的ＳＨＲＳＰｓ相比，服用牛樟芝后，ＳＨＲＳＰｓ脑组织Ｔ
－ＡＯＣ增强（Ｐ＜０．０５），表现为服药后脑组织
ＧＳＴ和ＳＯＤ的活性增加（Ｐ＜０．０５），而氧化应激代
谢产物 ＭＤＡ的含量下降（Ｐ＜０．０５）。与正常对照
ＷＫＹ大鼠相比较，未服用牛樟芝的ＳＨＲＳＰｓ脑组
织ＧＳＴ和ＳＯＤ活性下调（Ｐ＜０．０５），这与蛋白质印
迹分析法所得结果一致，而反映机体整体氧化程度
的 ＭＤＡ水平上调（Ｐ＜０．０５），Ｔ－ＡＯＣ相应降低
（Ｐ＜０．０５）。　　　　
· ４６　 · 第二军医大学学报　２０１４年１月，第３５卷
图２　牛樟芝给药后ＳＨＲＳＰｓ脑组织的蛋白质组学分析和蛋白质印迹分析验证
Ｆｉｇ　２　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ　ｆｒｏｍ　ＳＨＲＳＰｓ
ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　ａｎｄ　ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａ，Ｂ，Ｃ：Ｉｍａｇｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎｓ　ｉｎ　ＷＫＹ　ｒａｔｓ，ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ（ＳＨＲＳＰｓ－Ｃｏｎ），ａｎｄ　ＳＨＲＳＰｓ
ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ （ＳＨＲＳＰｓ－ＡＣ），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ；Ｄ：Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ
（ＧＳＴ）ａｎｄ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ）ｉｎ　ｂｒａｉｎｓ　ｏｆ　ＷＫＹ　ｒａｔｓ，ＳＨＲＳＰｓ－Ｃｏｎ　ａｎｄ　ＳＨＲＳＰｓ－ＡＣ；Ｅ：Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ　ＧＳＴ　ａｎｄ
ＳＯＤ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ．＊Ｐ＜０．０５ｖｓ　ＳＨＲＳＰｓ－Ｃｏｎ　ｇｒｏｕｐ．ｎ＝３，珔ｘ±ｓ
表１　牛樟芝对ＳＨＲＳＰｓ脑氧化应激相关指标的影响
Ｔａｂ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　ｏｎ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎｓ
ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ（ＳＨＲＳＰｓ）
ｎ＝３，珚ｘ±ｓ
Ｇｒｏｕｐ ＧＳＴｚＢ／（Ｕ·ｍｇ－１）
ＳＯＤ
ｚＢ／（Ｕ·ｍｇ－１）
ＭＤＡ
ｍＢ／（ｎｍｏｌ·ｍｇ－１）
Ｔ－ＡＯＣ
ｚＢ／（Ｕ·ｇ－１）
ＷＫＹ　 ７６．５２±５．９７＊ １４８．５９±１７．４４＊ ２．６７±０．１９＊ １０２．２５±１８．２２＊
ＳＨＲＳＰｓ－Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ４０．３３±５．２４　 １０９．２５±２３．６１　 ３．９６±０．４５　 ６６．４８±１６．１７
ＳＨＲＳＰｓ－Ａｎｔｒｏｄｉａ　ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ　 ７０．５０±６．２４＊ １９２．６０±２３．９５＊ ２．０４±０．３１＊ １２４．７５±２８．４３＊
　ＧＳＴ：Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＳＯＤ：Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ；ＭＤＡ：Ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ；Ｔ－ＡＯＣ：Ｔｏｔａｌ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｃａ－
ｐａｂｉｌｉｔｙ．＊Ｐ＜０．０５ｖｓ　ＳＨＲＳＰｓ－Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ
３　讨　论
　　目前，以脑卒中为主要表现的脑血管病已成为
世界上成年人的第３位致死和第１位致残原因［１０］。
流行病学研究表明，我国每年有１５０～２００万新发卒
中的病例［１１］。脑卒中存活的患者绝大部分丧失了
不同程度的生活自理能力，给家庭和社会带来沉重
的负担。目前，对于脑卒中的预防尚没有十分理想
的方法，主要是针对其各种危险因素进行干预，从而
延缓卒中高危患者发生卒中的时间［１２－１３］。ＳＨＲＳＰｓ
是一种以高血压为主要表现的大鼠，并且该类雄性
大鼠自发脑卒中的时间为１０个月龄左右，发生率在
９０％以上，是一种非常理想的研究脑卒中的病理
模型。
　　在本研究中，我们发现长期给予ＳＨＲＳＰｓ牛樟
芝灌胃治疗可以延长其生存时间，表明牛樟芝对于
高血压诱发的脑卒中有防治作用。牛樟芝是产于台
湾的一种较为珍贵的中药材，目前对于它的研究报
道相对较少，而且主要集中在抗肿瘤和免疫调节方
面。有学者发现从牛樟芝中提取的三萜类化合物具
有广谱的抗肿瘤活性，体外实验证明三萜类化合物
能通过ｃａｓｐａｓｅ和Ｂａｘ介导的凋亡通路诱导肿瘤细
第１期．程利娟，等．牛樟芝对易卒中的自发性高血压大鼠脑蛋白质组学的影响 · ４７　 ·
胞程序性死亡［１４］。而腹腔注射半萜内酯化合物
ａｎｔｒｏｃｉｎ则可以抑制非小细胞肺癌的生长，其抗肿
瘤活性与ａｎｔｒｏｃｉｎ抑制了ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３通路有
关［４］。另外，从牛樟芝中提取的多糖分子还能减轻
多重细菌败血症小鼠体内的炎症反应，表明牛樟芝
是一种具有多重生物学活性的中药材［７］。本研究首
次发现牛樟芝能延长ＳＨＲＳＰｓ的生存时间，表明牛
樟芝能对高血压诱发的脑卒中具有潜在的保护效
应。我们随后测定了长期服用牛樟芝后ＳＨＲＳＰｓ
的血压值，尽管用药后ＳＨＲＳＰｓ的血压出现下降趋
势，但差异无统计学意义（数据未展示），提示牛樟芝
的这种保护效应可能与血压调节无关。
　　Ｍａｒｃ　Ｗｉｌｋｉｎｓ在１９９５年提出了蛋白质组学这
一理念，其本质上指的是在大规模水平上研究蛋白
质的特征。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律
提供物质基础，也能为众多疾病机制的阐明提供理
论根据和解决途径。在本研究中，我们运用蛋白质
组学的手段比较了服用牛樟芝前后ＳＨＲＳＰｓ脑组
织蛋白质的表达差异，发现有２个蛋白点的表达量
增加，经过质谱鉴定为机体参与抗氧化的蛋白酶
ＧＳＴ　ｐｉ２亚基和ＳＯＤ。这２种蛋白酶构成了机体抗
氧化系统的重要组成部分，并被广泛报道能对抗机
体的氧化应激造成的各种损伤。运用遗传学的手段
造成ＧＳＴ表达缺陷的小鼠往往更容易受到氧化应
激的伤害［１５］，而过度表达 ＧＳＴ则能增加生物体抗
击应激的能力［１６］。条件敲除小鼠骨骼肌的ＳＯＤ会
加重氧化应激对肌肉的损害［１７］。而在生理情况下，
大脑中的抗氧化酶类的含量均较低，加之其又富含
脂质，因此是最容易受到氧化应激损伤的器官。氧
化应激参与了多种脑部疾病的发生及发展过程，通
过抗氧化干预能有效地缓解病情的恶化［１８］。有学
者指出，长期给予ＳＨＲＳＰｓ以抗氧化剂维生素Ｃ和
维生素Ｅ可以减少大鼠急性大脑中动脉栓塞后的脑
梗死面积，同时也能在一定程度上缓解其血压的增
高，这可能是其发挥保护作用的关键机制［１９］。此
外，日常抗氧化饮品绿茶也被证明能通过减轻
ＳＨＲＳＰｓ的血管壁的氧化应激水平发挥预防脑血管
疾病的保护功能［２０］。大规模人群的流行病学调查
研究也证实了长期服用绿茶可以降低卒中的发生
率［２１］。因此抗氧化可以作为防治脑卒中的一种治
疗策略。在本研究中我们发现牛樟芝服用后可以上
调ＳＨＲＳＰｓ脑组织中ＧＳＴ和ＳＯＤ的活性，可以增
强机体的抗氧化能力，减少氧化应激的产物产生，并
最终延长了ＳＨＲＳＰｓ的生存时间，意味着牛樟芝可
能成为延缓卒中发作的一个新型药物。
　　但是本研究并没有明确是牛樟芝中的何种成分
发挥了抗氧化效应，并且在有高血压基础的ＳＨＲ－
ＳＰｓ上联合应用降压药和牛樟芝是否能产生协同效
应，以及对卒中的发作能否产生更大的保护作用还
不清楚，这都将是我们进一步研究和努力的方向。
４　利益冲突
　　所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。
［参 考 文 献］
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ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，
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［１６］Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ　Ｃ，Ｌüｅｒｓｅｎ　Ｋ，Ｈｅｉｎｉｃｋ　Ａ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ
ｉｎ　Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ：ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｏ－
ｍｅｇａ　ｃｌａｓｓ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＧＳＴＯ－１）［Ｊ］．
ＦＡＳＥＢ　Ｊ，２００８，２２：３４３－３５４．
［１７］Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ　Ｍ　Ｓ，Ｊａｎｇ　Ｙ　Ｃ，Ｌｉｕ　Ｙ，Ｍｕｌｅｒ　Ｆ　Ｌ，Ｑｉ　Ｗ，
Ｓｔｅｉｎｈｅｌｐｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｏｆ　Ｍｎ－ＳＯＤ
ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｔｏ　ｔｙｐｅⅡＢ　ｓｋｅｌｅｔａｌ　ｍｕｓｃｌｅ　ｆｉｂｅｒｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ
ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｉｓ　ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｔｏ　ａｌｔｅｒ　ａｅｒｏｂｉｃ　ｅｘｅｒ－
ｃｉｓｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ［Ｊ］．Ａｍ　Ｊ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｃｅｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００９，２９７：
Ｃ１５２０－Ｃ１５３２．
［１８］Ｈａｍｅｌ　Ｅ，Ｎｉｃｏｌａｋａｋｉｓ　Ｎ，Ａｂｏｕｌｋａｓｓｉｍ　Ｔ，Ｏｎｇａｌｉ　Ｂ，
Ｔｏｎｇ　Ｘ　Ｋ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ａｎｄ　ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｙｓ－
ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．
Ｅｘｐ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，２００８，９３：１１６－１２０．
［１９］Ｃｈｅｎ　Ｘ，Ｔｏｕｙｚ　Ｒ　Ｍ，Ｐａｒｋ　Ｊ　Ｂ，Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ　Ｅ　Ｌ．Ａｎｔｉｏｘｉ－
ｄａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｖｉｔａｍｉｎｓ　Ｃ　ａｎｄ　Ｅ　ａｒｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｌ－
ｔｅｒｅｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ＮＡＤＰＨ　ｏｘｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｓｕｐｅｒ－
ｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｉｎ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ＳＨＲ［Ｊ］．Ｈｙｐｅｒｔｅｎ－
ｓｉｏｎ，２００１，３８：６０６－６１１．
［２０］Ｎｅｇｉｓｈｉ　Ｈ，Ｘｕ　Ｊ　Ｗ，Ｉｋｅｄａ　Ｋ，Ｎｊｅｌｅｋｅｌａ　Ｍ，Ｎａｒａ　Ｙ，
Ｙａｍｏｒｉ　Ｙ．Ｂｌａｃｋ　ａｎｄ　ｇｒｅｅｎ　ｔｅａ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ　ａｔｔｅｎｕａｔｅ
ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｉｎ　ｓｔｒｏｋｅ－ｐｒｏｎｅ　ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ－
ｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｕｔｒ，２００４，１３４：３８－４２．
［２１］Ｋｏｋｕｂｏ　Ｙ，Ｉｓｏ　Ｈ，Ｓａｉｔｏ　Ｉ，Ｙａｍａｇｉｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｔｓｕｙａ　Ｈ，
Ｉｓｈｉｈａｒａ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｉｍｐａｃｔ　ｏｆ　ｇｒｅｅｎ　ｔｅａ　ａｎｄ　ｃｏｆｆｅｅ　ｃｏｎ－
ｓｕｍｐｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ｒｉｓｋ　ｏｆ　ｓｔｒｏｋｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｊａｐ－
ａｎｅｓｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ　Ｊａｐａｎ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｃｅｎｔｅｒ－
Ｂａｓｅｄ　Ｓｔｕｄｙ　Ｃｏｈｏｒｔ［Ｊ］．Ｓｔｒｏｋｅ，２０１３，４４：１３６９－１３７４．
［本文编辑］　尹　茶