全 文 ：第 27卷第 9期
2008年 9月
水 产 科 学
FISHERIES SCIENCE Vol.27No.9Sep.2008
不同产地及不同世代龙须菜
可溶性总蛋白的差异表达初探
蔡文龙 , 孟春晓
(山东理工大学 生命科学学院 ,山东 淄博 255049)
摘 要:以采自广东 、福建和青岛海域的龙须菜雌配子体 、栽培和野生龙须菜为试验材料 , 比较了它们
的形态和适应性差别 ,并研究了各样品可溶性总蛋白的表达情况。结果表明 , 这些样品之间不仅在形
态和适应性方面有较大差异 ,而且至少有 16种可溶性蛋白在它们之间差异表达 , 这为龙须菜遗传育种
提供了更可信的分子标识。该方法有望成为比传统的形态鉴定和分子标记更简便 、有效的含胶藻鉴定
手段。
关键词:龙须菜;形态;适应性;蛋白表达差异
中图分类号:S917 文献标识码:A 文章编号:1003-1111(2008)09-0462-04
收稿日期: 2007-06-03; 修回日期:2007-07-24.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(40706050;40706048);山东理工大学自然科学基金资助项目(4040-306017);山东理工
大学博士启动基金资助项目(4041-405017;4041-405016);山东理工大学特色学科建设基金资助项目;国家支撑项目
(11200602);中央级公益性研究所专项资金资助项目(2060402 /2).
作者简介:蔡文龙(1987-),男 ,山东理工大学生命科学学院生物技术专业 2005级学生;E-mail:caiwenlong45808@ 126.com;通讯
作者:孟春晓(1977-),女 ,副教授 ,博士 ,研究方向:藻类生理与分子生物学;E-mail:mengchunxiao@126.com.
江蓠(Gracilariasalicornia)是一种重要的海洋
经济红藻 , 广泛分布于热带 、亚热带和温带海区。
江蓠在分类系统上属红藻门 、真红藻纲 、杉藻目 、江
蓠科 、江蓠属 [ 1-2] 。目前已发现的江蓠约有 100多
种 ,在我国已鉴定清楚的约 30多种 [ 3-4] 。江蓠具有
很多用途 ,所以它的栽培和遗传改良自然引起人们
的高度重视。目前我国沿海作为人工栽培的种类
主要是细基江蓠(G.tenuistipita)和龙须菜(G.lema-
neiforms)。细基江蓠产量占我国江蓠总产量的 1/
2
[ 5] ,但它琼胶含量较低(10% ～ 15%),且胶质较
差 [ 2-4] ,而龙须菜琼胶含量高(20% ～ 25%), 质量
好 ,因此栽培龙须菜具有广阔的前景 。
野生龙须菜在我国山东和辽宁沿海分布较
多 [ 6-8] 。它分枝多 ,生长快 , 单茬亩产 (1000 m绳
长)干品超过 1.5 t,是江蓠属中琼胶含量最高 、质
量最好的一个种 [ 9-12] 。龙须菜的最适生长温度为
12 ～ 22 ℃[ 8, 12] 。目前 ,龙须菜在我国已经成为继海
带 (Laminariajaponica)、紫菜 (Porphyra)、裙带菜
(Undariapimnatifida)之后的第 4大栽培海藻。龙须
菜在我国大规模养殖主要集中在南部海域 ,但广东 、
福建等南部海域夏季水温太高 ,龙须菜对高温适应
性较差 ,而且目前在南方栽培的龙须菜品种单一 ,长
期栽培后 ,原有的一些优良性状已逐渐退化。因此
开展龙须菜遗传育种 ,选育出耐高温 、含胶量高 ,适
合我国南方海域养殖的新品种具有非常重要的意
义 。
目前 ,含胶海藻的鉴定主要以形态识别和分子
标记为主 ,但 2种方法均存在缺点。若能建立一套
在蛋白差异表达的水平上的鉴定方法 ,将大大降低
含胶海藻鉴定的复杂性 ,增加可信度。早在 20世
纪 90年代初 ,胡志昂等 [ 13]曾有用蛋白质表达的多
样性来进行品种鉴定的报道。笔者以采自广东和
福建养殖场的龙须菜 、青岛海滨的野生龙须菜 、雌
配子体为材料 ,初步研究了它们形态和适应性差别
及总可溶性蛋白的差异表达情况 ,为选育出适合高
产 、优质的新品种奠定基础 。
1 材料与方法
1.1 材料的采集与样品的选择
栽培龙须菜分别采自广东 、福建养殖场 ,龙须
菜雌配子体和野生龙须菜采自青岛海滨 。在试验
室室温通气培养 1个月 ,每周更换 1次过滤天然海
水 。
1.2 样品的形态学观察
在 4种样品中随机选取植株各 1棵 ,样品太大
的截取其中一个主要分枝 ,在平板上铺开样品 ,并
将其分枝尽量展开 ,然后拍照。
1.3 各样品可溶性总蛋白的提取
称取 4种新鲜样品各 1.0 g,分别加入 5.0 ml
的蛋白提取缓冲液(0.1 mmol/LTris, 1.0 mmol/L
EDTA, 0.05 mol/L抗坏血酸 , 8.0 mol/L尿素 , 1.0
mmol/LPMSF, 1% β -巯基乙醇(V/V), 1% Triton
X-100(V/V), pH7.8] ,冰浴中研磨 20 min后 4
℃, 13 000g/min离心 20min,收集得到的上清液即为
DOI :10.16378/j.cnki.1003-1111.2008.09.010
蛋白样品。按 Bradford的方法 [ 13]测量蛋白的浓度。
1.4 SDS-PAGE
样品中加入等体积的上样缓冲液 [ 0.25 mol/L
Tris-HCl, pH6.8, 10%的甘油 (V/V), 10%的
SDS(m/V), 0.1%的溴酚蓝(m/V), 0.5% β -巯
基乙醇(V/V)]后 ,沸水浴中加热 3 ～ 5 min,冰浴冷
却 , 4 ℃, 13000 g/min离心 5 min。电泳按 Lae-
mmli[ 14]的方法 , 稍作改进。采用 12%的分离胶 ,
5%的浓缩胶 ,电极液是 Tris-Gly系统 , pH8.3。电
泳槽为 DYY-Ⅲ 23A型(北京六一仪器厂)。按各
泳道等蛋白量上样(40 μg/lane)。电泳过程中 ,当
溴酚蓝在浓缩胶中时 ,稳压 40 V,当溴酚蓝进入分
离胶中时 ,稳压 60 V。整个电泳约需 3 h。电泳完
成后 ,用考玛斯亮蓝 G250染色 4h,然后褪色 。
2 结果
2.1 形态学观察
采自不同海区 、不同世代龙须菜的形状比较见
图 1。由图 1可见 ,龙须菜雌配子体颜色很深 ,呈黑
褐色 ,很少有分枝 、粗壮的藻体上有很多黑色的囊
果;青岛海滨野生的龙须菜个体较小 ,基部颜色较
深 、呈深褐色 、中部呈浅褐色 ,上部更浅 、变成黄褐 、
分枝少;广东栽培龙须菜颜色较深 ,呈红褐色 、分枝
较多而较短 、整个藻体较长而健壮;与广东栽培龙
须菜相比 ,福建栽培龙须菜颜色较浅 ,呈黄褐色 、藻
体也相对较小 、分枝多而较长 ,大分枝上还有很多
非常短的二级分枝。
从生长特性和在实验室的适应性来看 ,除福建
龙须菜适应性较差 ,在实验室培养过程中 ,藻体易
从中间出现白化现象 ,最后导致整株藻逐渐死亡以
外 ,其他来源的龙须菜的生长适应性均较强 ,实验
室较易培养成活 。
图 1 4种样品的形态观察
注:1、 2、 3、 4分别是青岛海滨野生龙须菜 、龙须菜雌配子体 、
广东龙须菜 、福建龙须菜。箭头 A所指的黑色突起为龙须菜雌配子
体囊果 ,箭头 B是福建龙须菜培养过程中 ,藻体中间出现白化部分.
2.2 SDS-PAGE结果
4种样品总可溶性蛋白 SDS-PAGE电泳图谱
见图 2。由图 2可见 , 4种样品中可溶性总蛋白的
表达水平存在较大的差异:115kD蛋白(箭头 1)只
在广东龙须菜中表达;98 kD蛋白(箭头 2)在龙须
菜雌配子体中表达;92 kD蛋白(箭头 3)只在龙须
菜雌配子体 、广东龙须菜和青岛野生龙须菜中表
达;72 kD蛋白(箭头 4)、53 kD蛋白(箭头 5)只在
福建龙须菜中表达;54 kD蛋白(箭头 8)只在广东
龙须菜和青岛野生龙须菜中大量表达 ,其表达量与
53 kD蛋白(箭头 5)在福建龙须菜中的表达量相
当 ,但分子量明显偏大 ,应该不是同一种蛋白;48
kD蛋白(箭头 9所指)在广东龙须菜和青岛野生龙
须菜中痕量表达;36kD蛋白(箭头 10)只在雌配子
体 、福建龙须菜和青岛野生龙须菜中有表达;12 kD
蛋白(箭头 13)则是广东龙须菜的特异表达蛋白。
此外 ,还有一些蛋白在各样品中的表达量差异
很大;如 43kD蛋白(箭头 6)和 41 kD蛋白(箭头
7)在各龙须菜样品均有表达 ,但表达量差异明显 ,
它们在龙须菜雌配子体中没有表达 。然而 ,也有些
蛋白在各样品中均等量表达。如 19 kD蛋白(箭头
11), 16 kD蛋白(箭头 12)。
图 2 4种样品总可溶性蛋白的 SDS-PAGE电泳图谱
注:M为标准蛋白 ,泳道 a、b、 c、 d分别为龙须菜雌配子体 、福
建龙须菜 、广东龙须菜 、青岛海滨野生龙须菜的总可溶性蛋白。各
箭头及相关的数字代表差异表达蛋白。它们的分子量分别是:1:
115kD;2:98kD;3:92kD;4:72kD;5:53kD;6:43kD;7:41kD;
8:54kD;9:48kD;10:36kD;11:19kD;12:16kD;13:12kD.
3 讨论
江蓠化学组成存在明显的地区差异 ,可能是因
为藻体化学组成的稳定性受季节与地理分布影
响 [ 5, 15] 。赵谋明等 [ 5]的研究表明不同品种或同一
品种不同产地的江蓠经碱处理后 ,其琼胶强度提高
463第 9期 蔡文龙等:不同产地及不同世代龙须菜可溶性总蛋白的差异表达初探
的程度差异很大 。此外 ,不同世代 、不同性别及不
同季节的龙须菜琼胶特性也有明显差异[ 8] 。 Liu、
Hoxmark、Hushovd等[ 16-18]早就有关于同一物种在
不同世代蛋白表达差异的报道。但迄今为止 ,未见
有关不同产地的同一物种样品蛋白差异表达的报
道 。
现在含胶藻的鉴定主要以传统的形态鉴定为
主 。近些年分子标记也成为主要鉴定手段。但这
些方法均有不足之处 。如形态鉴定可信度较低 ,因
为有时同种不同地理株的样品在形态上也会差异
显著。分子标记中的 RAPD技术受反应条件影响
较大 ,重复性较差 ,而 RFLP技术步骤太复杂 , 且一
般需使用同位素 ,不安全 [ 19] 。若能在蛋白差异表
达水平上建立一套含胶海藻的鉴定方法 ,无疑将为
藻类遗传育种提供了更可信的分子标识。
由试验结果看 ,不同海区及不同世代的龙须菜
不仅在个体形态 、颜色 、实验室培养的适应性上存
在着明显的差异 ,而且在蛋白的表达水平上也差别
很大。在我国 ,野生龙须菜分布在华北山东和辽宁
海域 ,作为养殖品系首先被引种到广东沿海 。龙须
菜为适应广东海区南亚热带的生长环境 ,表达了一
些特异蛋白 ,如 115 kD蛋白(图 2,箭头 1), 12 kD
蛋白(图 2,箭头 13);而另一些特殊蛋白不再表达 ,
如 36kD蛋白(图 2,箭头 10)。由于引种到广东沿
海的龙须菜表现良好 ,然后又被从广东引种到临近
的福建海域 。福建海区属中亚热带海域 ,其生长环
境与广东沿海有较大差别 ,如广东海域的海水平均
温度明显比福建海域海水平均温度高 ,且 2个海区
的污染情况 、营养含量及生物种群均有明显的差
异 。正是生长环境的改变 ,导致龙须菜在福建海域
也表达出了一些特异的蛋白 ,如 69 kD蛋白(图 2,
箭头 4)和 53kD蛋白(图 2,箭头 5);另一些蛋白不
再表达 ,如 87 kD蛋白(图 2,箭头 3), 48 kD蛋白
(图 2,箭头 9),还有一些蛋白的表达量则变化较
大 ,如 43 kD蛋白(图 2,箭头 6)和 41 kD蛋白(图
2,箭头 7)。由图 2可见 ,雌配子体与栽培和野生龙
须菜的蛋白表达图谱相差较大 ,这与 Liu、 Hoxmark
和 Hushovd等 [ 16-18]报道的其他植物在不同世代蛋
白表达差异较大的结果相吻合 。
笔者推测 ,很可能正是这些在各样品中差异表
达的蛋白 ,导致各样品在形态 、颜色 、实验室培养适
应性上的明显差异 。若能将这些差异表达的蛋白
在比较蛋白质组的水平上鉴定其结构与功能 ,找出
引起各样品差异的相关基因 ,必将推动龙须菜遗传
育种研究。
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Differentialy-ExpressedTotalSolubleProteinsofSeaWeedGracilaria
lemaneiformsatDifferentStagesfromDifferentSeaArea
CAIWen-long, MENGChun-xiao
(CollegeofLifeSciences, ShandongUniversityofTechnology, Zibo255049, China)
Abstract:GracilarialemaneiformsisagenusofGracilariacultivatedseaweed.Apex, afterthefemalegameto-
phyte, GracilarialemaneiformsfromGuangdong, FujianandQingdaoareawerecultivatedforonemonthinlabora-
tory, andwerecomparedonshapeandadaptability.Thediferentialy-expressedtotalsolubleproteinsoffivesam-
pleswerestudiedwithSDS-PAGEtechnology.Asaresult, therewasdistinctdiversityonshapeandadaptabilitya-
mongthefivesamples.Andatleast16 solubleproteinswerediferentialy-expressedamongthem.Thisstudypro-
videdmorecrediblemoleculartagforGracilarialemaneiformsgeneticbreeding.Itwilbeaneasierandmoreefec-
tivemethodthanmodalityidentificationandmolecularmarkertoidentifyalgaewithagar.
Keywords:Gracilarialemaneiforms;shape;adaptability;diferentialy-expressedprotein
(责任编辑:晓 荷)
辽宁省 3亿头海蜇苗放流辽东湾渔场
为进一步贯彻实施国务院 《中国水生生物资源养护行动纲要》 ,修复近海渔业资源 ,促进渔业增效 、渔民
增收 , 2008年辽宁省在辽东湾渔场继续开展海蜇增殖放流。6月 16— 25日 ,在环辽东湾 5个放流入海点 ,共
向辽东湾渔场放流 1cm海蜇苗 3亿头 ,超额完成年初辽宁省海洋与渔业厅确定的 2008年辽东湾渔场放流
海蜇2.3亿头的计划任务。其中大连瓦房店市海域 3645万头 ,营口市海域 12245万头 ,盘锦市海域 5384万
头 ,锦州市海域 4343万头 ,葫芦岛市海域 4331万头。
在海蜇放流验收期间 ,验收人员起早贪黑 ,顶风冒雨 ,付出了艰辛的劳动 ,严把放流苗种的数量 、质量
关 ,当地渔政管理人员和渔民代表对验收 、入海过程进行了全过程监督 ,确保了放流海蜇苗种质优 、量足。
2008年是辽宁省在辽东湾渔场进行大规模海蜇增殖放流工程的第 4个年头 ,为确保放流苗种来源 ,通
过招投标方式 ,精心选定了 10家育苗能力强 、技术水平高 、信誉好的企业为海蜇放流提供苗种单位。放流
验收前 ,有关管理部门对放流验收码头 、运输船只 、验收操作及入海点等具体事宜进行了精心的组织落实;
对验收人员进行了技术培训;同时对所有的放流苗种进行了检验 、检疫 ,检疫结果表明 2008年放流入海的
海蜇苗种均为质量合格苗种。
(辽宁省海洋与渔业厅信息中心 供稿)
465第 9期 蔡文龙等:不同产地及不同世代龙须菜可溶性总蛋白的差异表达初探