全 文 ：收稿日期:2010-11-30; 修订日期:2011-05-23
基金项目:国家自然科学基金(No． 20905017) ;
海洋公益性行业科研专项(No． 201005034 － 3) ;
国家海洋局青年基金(No． 2010140) ;
国家海洋局第一海洋研究所基本科研业务专项(No． 2010G25)
作者简介:史 倩(1984-) ，女(汉族) ，山东青岛人，现为国家海洋局第一
海洋研究所在读硕士研究生，学士学位，主要从事海洋天然产物化学研究
工作．
* 通讯作者简介:陈军辉(1978-) ，男(汉族) ，河北石家庄人，现任国家海
洋局第一海洋研究所助理研究员，博士学位，主要从事天然药物现代化相
关研究工作．
海洋药用红藻龙须菜高效液相色谱指纹图谱的研究
史 倩1，陈军辉1* ，张道来1，2，程红艳1，赵恒强1，王小如1
(1．国家海洋局第一海洋研究所，海洋生态研究中心，
青岛市现代分析技术及中药标准化重点实验室，山东 青岛 266061;
2．青岛海洋地质研究所，山东 青岛 266071)
摘要:目的 建立海洋药用红藻龙须菜高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，为其真伪鉴别和质量控制提供科学依据。方法
采用反相 Extend C18色谱柱，以乙腈 － 0． 1%(V /V)磷酸水为流动相，二元线性梯度洗脱，流速为 1． 0 ml /min，柱温为 20
℃，检测波长为 226 nm，进样量为 30 μl;采用高效液相色谱 －质谱联用技术(HPLC － MS)对其特征峰进行快速分析;通过
相似度分析对 8 批龙须菜进行评价。结果 以 8 批龙须菜样品的 6 个共有峰为评价指标，建立了龙须菜 HPLC指纹图谱，
相似度均在 0． 90 以上;通过 HPLC － MS分析获得 4 个特征峰的质谱信息，实现了龙须菜指纹图谱共有峰和特征峰的准
确定位。结论 该方法简单可靠、稳定性好，是龙须菜真伪鉴别和质量控制的有效方法。
关键词:龙须菜; 高效液相色谱法; 指纹图谱
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 10． 018
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)10-2358-03
HPLC Fingerprint of Oceanic Officinal Red Alga Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta)
SHI Qian1，CHEN Jun-hui1* ，ZHANG Dao-lai1，2，CHENG Hong-yan1，ZHAO Heng-qiang1，WANG Xiao-ru1
(1． Qingdao Key Lab of Analytical Technology Development and Standardization of Chinese Medicines，Research
Center for Marine Ecology，First Institute Oceanography of SOA ，Qingdao 266061，China;2． Qingdao Institute
of Marine Geology，Qingdao，266071，China)
Abstract:Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC)fingerprint method for the quality evalua-
tion and discrimination of oceanic officinal red alga － Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta)．Methods The chromatographic fin-
gerprint of the 8 samples was determined by injecting 30 μl of the sample solution each time on a reversed phase extend － C18 col-
umn with the gradient elution solvent system composed of 0． 1% phosphatic solution and acetonitrile． The flow rate was 1． 0 ml /
min，the column temperature was maintained at 20 ℃ and the detection wavelength was at 226 nm． Characteristic peaks of the fin-
gerprint could be rapidly analyzed by high performance liquid chromatography － mass spectrometry (HPLC － MS) ，and the method
of similarity analysis was used to evaluate the 8 samples． Results The HPLC fingerprint of Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta)
was set up，which included 6 common peaks，and the similarities of 8 samples were all better than 0． 90． Mass spectra of the 4
characteristic peaks obtained by HPLC － MS could be used to accurately confirm the characteristic and common peaks in finger-
print of Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta)． Conclusion The method is simple and stable，and it can be used for identification
and quality control of Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta)．
Key words:Gracilaria lemaneiformis (Rhodophyta) ;High performance liquid chromatography; Fingerprint
龙须菜 Gracilaria lemaneiformis 又名江蓠，为红藻门(Rhodo-
phyta)江蓠科(Gracilariaceae)江蓠属(Gracilaria)的一种广泛分布
于我国沿海地区的海洋经济型藻类。据《本草纲目》记载，龙须
菜具有清热利水之功效，多用于治疗内热、小便不利等。龙须菜
富含有多种氨基酸、脂肪酸、蛋白质、多糖和纤维素等［1］，其中多
糖类成分具有抗突变、清除自由基的作用［2］。除了药用价值外，
龙须菜还可用于渔场富营养化的治理，并有助于实现经济多样
化，提高工业产值［3］。龙须菜作为一种药用和经济作物在其质量
控制方面，未见国内外相关报道。
高效液相色谱法由于其快速可靠且技术成熟，已被国内外许
多学者用于各种陆源药用植物指纹图谱的建立及质量控制［4 ～ 6］。
在对海洋药用生物的真伪鉴别和质量控制上，已有学者建立了三
斑海马［7］、皱瘤海鞘［8］等海洋动物的指纹图谱，本课题组也先后
建立了小海马、马粪海胆、干贝和黄海葵等的指纹图谱［9 ～ 12］。本
研究首次对海洋药用红藻龙须菜进行高效液相色谱指纹图谱研
究，以期为龙须菜的质量控制和真伪鉴别提供科学依据。
1 仪器与材料
1． 1 仪器 1200 型高效液相色谱仪，配有四元泵，DAD 检测器，
自动进样器等(美国 Agilent 公司) ;6320 型离子阱质谱仪，配有
大气压化学电离源(APCI) (美国 Agilent 公司) ，KQ － 400KDE 型
高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司) ;R201 型旋转
蒸发仪(上海申生科技有限公司) ;FA1104 型电子天平(上海精
天电子仪器厂) ;THZ － 8 恒温水浴锅(中国浙江嘉兴电热仪器
厂) ;Milli － Q(18． 2 MΩ)超纯水处理系统(美国 Millipore 公
司)。
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时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 10 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 10
Diamonsil － C18色谱柱(4． 6 mm × 150 mm，5 μm，中国 Dik-
ma公司) ;Zorbax Bonus － RP C18色谱柱(4． 6 mm × 250 mm，5
μm，美国 Agilent公司) ;Extend C18色谱柱(4． 6 mm × 200 mm，5
μm，美国 Agilent公司) ;Eclipse XDB － C18(4． 6 mm × 150 mm，5
μm，美国 Agilent公司)。
1． 2 材料 甲醇、乙腈为色谱纯(德国 MERCK 公司) ;乙酸色谱
纯(德国 Riedel 公司) ;磷酸色谱纯(天津瑞金特化学品有限公
司) ;水为自制 Milli － Q 超纯水;乙醇、丙酮为分析纯(烟台三和
化学试剂有限公司) ;正丁醇为分析纯(天津市科密欧化学试剂
有限公司) ;醋酸乙酯为分析纯(天津广成化学试剂公司)。
本实验所采用的 8 批龙须菜样品均购自青岛市内酒店和市
场(见表 1) ，经中国海洋大学水产学院曾晓起教授鉴定为江蓠科
龙须菜 Gracilaria lemaneiformis。
表 1 龙须菜药材来源
编号 来源 时间
1 青岛 2009 － 03
2 青岛 2009 － 03
3 青岛 2009 － 03
4 青岛 2009 － 04
5 青岛 2009 － 04
6 青岛 2009 － 04
7 青岛 2009 － 04
8 青岛 2009 － 05
2 方法
2． 1 色谱条件 Extend C18色谱柱(4． 6 mm × 250 mm，5 μm) ，流
动相 A:0． 1%磷酸水，B:乙腈，流速为 1． 0 ml /min，柱温为 20 ℃，
检测波长为 226 nm，进样量为 30 μl，梯度洗脱程序为 t:0 － 40 －
60 － 75 － 90 min，B%:45% － 70% － 90% － 100% － 100%，仪器
梯度滞后时间为 0． 5 min。
2． 2 质谱条件 流动相 A:0． 2%乙酸水溶液 － B:乙腈，其他色谱
分离条件同上;进入质谱的流动相流速 1． 0 ml /min，大气压化学
电离离子源，正离子电离模式，雾化气压力 50 psi，干燥气(N2)流
速 5． 0 L /min，干燥气体温度 350℃，毛细管电压 4 000 V，全扫描
(Scan)质荷比(m/z)范围为 100 ～ 1 200。
2． 3 样品制备 将新鲜龙须菜样品用蒸馏水冲洗干净，置于烘箱
中 55 ℃鼓风干燥 24 h，然后置于真空干燥箱中 55 ℃干燥 24 h
至干。干燥后的龙须菜样品切段粉碎、过 40 目筛后混合均匀后，
制备成龙须菜粉末样品，封装于样品瓶中，密闭、避光、干燥、常温
贮藏。
准确称取 0． 5 g 龙须菜粉末样品，置于 100 ml 具塞锥形瓶
中，加入 50 ml正丁醇、乙醇混合液(V∶ V = 9∶ 1) ，在室温条件下
超声提取 60 min，静置 30 min，过滤，取上清液于 100 ml 旋蒸瓶
中，在 80 ℃ 条件下旋转蒸发浓缩至干，用乙腈溶解提取物并定
容至 2 ml，过 0． 45 μm微孔滤膜后作为供试品溶液。
3 结果
通过对龙须菜样品 6 个共有峰的相对保留时间和相对峰面
积来进行仪器精密度、方法重复性和稳定性等方法学考察。
3． 1 仪器精密度 按“2． 1”项的色谱条件，对同一份龙须菜样品
(3 号样品)的供试品溶液重复进样 5 次，分别测得其中 6 个共有
峰的峰面积和保留时间，并分别计算各相对标准偏差(RSD)。其
相对保留时间 RSD≤0． 23% ，相对峰面积 RSD≤3． 50%，表明仪
器精密度较好。
3． 2 重复性 准确称取 3 号样品 5 份，按“2． 3”项的方法制备供
试品溶液，按“2． 1”项提供的色谱条件进样分析。实验结果表
明，所有共有峰的相对保留时间 RSD≤0． 31%，相对峰面积 RSD
≤4． 50%，表明方法的重复性较好，符合指纹图谱的要求。
3． 3 稳定性 将供试品溶液按照“2． 1”项的色谱条件，分别在 0，
3，6，12，24，48 h时进样分析，其 6 个共有峰相对保留时间的 RSD
≤0． 15%，相对峰面积的 RSD≤4． 07%，表明样品在 48 h 内稳定
性良好。
3． 4 样品指纹图谱的建立 取 8 批不同的龙须菜样品，按“2． 3”
项供试品溶液制备方法将其制备成供试品溶液，按“2． 1”项的色
谱条件进样分析，记录色谱图，建立龙须菜样品的 HPLC 指纹图
谱，8 批龙须菜样品的色谱图(见图 1)。从图 1 可以看出 8 批龙
须菜样品的指纹图谱差异不大，因此，8 批龙须菜样品均可用于
共有峰的确定。选择稳定性好、吸收强、特征明显的色谱峰为共
有峰，8 批龙须菜样品 HPLC 指纹图谱的共有峰有 6 个(较大的
峰，已扣除溶剂峰) ，见图 2。在本研究所建立的分析条件下，龙
须菜提取物成分出峰时间主要在 80 min 之前，特征性明显的主
要有 4 个色谱峰，这 4 个色谱峰即构成龙须菜 HPLC指纹图谱的
特征峰(分别为峰 2，4，5，6) ，其中以 2 号峰为指标峰，该峰化学
性质稳定，保留时间以及峰面积重复性良好，与其它相邻峰分离
良好，采用化学工作站计算该峰的纯度表明该峰为一纯化合物。
图 1 8 批龙须菜 HPLC指纹图谱
图 2 龙须菜 HPLC － DAD(226nm)图谱
3． 5 特征峰的准确定位 为便于龙须菜共有峰的进一步准确识
别和定位，借助于 4 个特征峰，采用高效液相色谱 －大气压化学
电离质谱联用技术(HPLC － APCI － MS)对龙须菜指纹图谱中的
特征峰进行分析。HPLC工作条件同“2． 1”色谱条件，APCI － MS
按照“2． 2”项质谱条件进行检测分析，获得的质谱总离子流色谱
图(TIC)如图 3 所示，可以看出龙须菜正丁醇 －乙醇(V /V = 9∶
1)混合溶剂提取物中各特征峰质谱分析信号良好，龙须菜指纹
图谱中的 4 个特征峰的质谱图见图 4。结合各特征峰的保留时
间，可以实现龙须菜样品中 4 个特征峰准确快速的定位，为龙须
菜的真伪鉴别提供可靠依据，对其质量控制有重要意义。
图 3 龙须菜样品 HPLC － APCI － MS分析总离子流色谱图
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 10 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 10 期
图 4 龙须菜 4 个特征峰质谱图
3． 6 相似度分析 色谱图及质谱图可以直观地表征样品的形态
特征，相似度分析则可以从内在表征样品间的联系，为龙须菜的
鉴定进一步提供客观公正的评价。通过“中药色谱指纹图谱相
似度评价系统”(《中国药典》2004A 版)对 8 批龙须菜的指纹图
谱进行相似度分析(以 8 批龙须菜指纹图谱的共有模式为对照
模板)。结果如表 2 所示。从表 2 中可以看出，8 批样品的相似
度均在 0． 90 以上，其中 3 号样品的相似度高达 0． 987，因此选择
3 号样品作为龙须菜的参考指纹图谱(见图 2) ，具有较好的代表
性，而 3 号样品则可以作为龙须菜的标准物质，用于龙须菜药材
的 HPLC指纹图谱质量评价。
表 2 相似度计算结果
No． 相似度
1 0． 942
2 0． 902
3 0． 987
4 0． 944
5 0． 956
6 0． 936
7 0． 939
8 0． 947
4 讨论
4． 1 供试品溶液提取条件的优化 参照相关文献，本实验对 5 种
不同提取溶剂及其混合液(甲醇、乙醇、醋酸乙酯、正丁醇、丙酮)
制备的龙须菜提取物进行了比较，结果表明，龙须菜不同溶剂提
取物 HPLC指纹特征差异显著，乙醇、正丁醇混合液提取物 HPLC
指纹图谱效果最好，该提取溶剂能提取出龙须菜中代表性小分子
物质，且引入干扰少，无需经过去除蛋白，脱盐等过程便可直接进
样检测，且该提取溶剂相对价格便宜，便于购买，因此选择正丁
醇、乙醇混合液作为龙须菜供试品溶液制备提取溶剂;另外，还对
不同比例正丁醇、乙醇混合液进行了比较，结果表明，正丁醇、乙
醇体积比为 9∶ 1 的混合液效果最佳。此外，还对超声波提取法、
冷浸法、回流提取法等不同提取方式进行了比较，结果表明，超声
提取法方便、快捷、提取效率高、便于操作，且提取液中干扰物质
少，是最佳提取方法。在超声过程中，考察了温度、超声频率对提
取效率的影响，经比较确定温度对提取效果影响不大可忽略，超
声功率在仪器的 80% ～100%之间的提取效果无差别，故提取过
程无须控温，超声波仪器功率设在 80%即可。在此基础上进一
步比较了不同体积提取溶剂、不同提取时间对提取效率的影响，
以 50 ml提取溶剂超声提取 60 min为宜。在上述条件下，提取一
次即可将龙须菜中的代表性物质提取出来。
4． 2 色谱条件的优化 龙须菜成分复杂，含有丰富的蛋白质、脂
肪、维生素、微量元素等营养成分，采用等度洗脱的方法很难将龙
须菜提取物中的多种化合物分离开，因此采用线性梯度洗脱方式
进行分离。本研究对“1． 1”项中所列的 4 根不同生产型号的色
谱柱进行了比较，结果表明，使用 Agilent Extend C18色谱柱获得
的龙须菜提取物指纹图谱各峰分离度高，色谱峰分布均匀，峰型
好，具有较好的代表性，因此选择 Agilent Extend C18柱用于龙须
菜药材的指纹图谱研究。在此基础上，比较了甲醇、乙腈、水为流
动相时的色谱图效果，并加入磷酸、乙酸调节流动相 pH 以改善
分离度和色谱峰形，结果发现以 0． 1%磷酸水 －乙腈为流动相
时，色谱指纹图谱效果最好。通过二极管阵列检测器全波段扫描
(190 ～ 400 nm) ，考察了不同检测波长对指纹图谱的影响，结果
表明，在 UV 226 nm条件下检测获得的色谱指纹图谱信息量大，
指纹峰特征性强，具有较好的代表性，因此选择 226 nm作为龙须
菜 HPLC 指纹图谱研究的检测波长。
4． 3 小结 本文建立了龙须菜的高效液相色谱指纹图谱，结合液
质联用技术和相似度分析，实现了龙须菜样品的真伪鉴别和质量
控制。其中，HPLC指纹图谱全面展示并反映龙须菜样品中化学
成分的分布、比例关系和特征，进而反映龙须菜药材的内在质量，
为龙须菜的真伪判别、优劣评价提供依据;本研究所采用的方法
准确有效，可为龙须菜及相关海洋藻类植物质量评价提供借鉴。
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