全 文 ：160 2013, Vol.34, No.23 食品科学 ※基础研究
龙须菜中硫琼脂的分离纯化及其成分分析
刘秋凤，苏永昌，吴成业*
(福建省水产研究所，福建 厦门 361013)
摘 要：采用EDTA-Na2浸提法提取硫琼脂，经DEAE Cellulose-52层析柱分段梯度洗脱得到3个多糖组分(SPS-1、
SPS-2及SPS-3)，并结合离子色谱法、高效液相色谱法、紫外光谱分析、红外光谱等多种分析手段，对其硫酸基含
量、相对分子质量、纯度、单糖组成、特征键进行测定。结果表明：SPS-1、SPS-2、SPS-3的得率分别为2.7%、
47.2%、2.2%，硫酸根含量分别为5.1%、9.3%、6.3%；硫琼脂结构中不含蛋白质、氨基酸和核酸；SPS-2中含有一
种相似链长的多糖，其含量高达92.14%，重均相对分子质量(Mw)为367686，数均相对分子质量(Mn)为230434。可初
判断，其是由17.34%半乳糖、2.72%棉子糖、8.82%蔗糖和1.18%阿拉伯糖等组成的结构复杂的硫酸酯多糖。
关键词：硫琼脂；分离纯化；红外光谱分析；单糖组成
Isolation, Purification and Compositional Analysis of Agaropectin from Gracilaria lemaneiformis
LIU Qiu-feng，SU Yong-chang，WU Cheng-ye*
(Fisheries Research Institute of Fujian, Xiamen 361013, China)
Abstract：Three polysaccharides named as SPS-1, SPS-2 and SPS-3 were separated by gradient elution on a DEAE-
cellulose column from the agaropectin extracted from Gracilaria lemaneiformis. Their chemical analysis including sulfate
base content, relative molecular mass, purity, characteristic bonds and monosaccharide composition were characterized byion
chromatography, high performance liquid chromatography, ultraviolet spectroscopy and infrared spectroscopy. The results indicated that the
yields of SPS-1, SPS-2 and SPS-3 were 2.7%, 47.2% and 2.2%, with sulfate base contents of 5.1%, 9.3% and 6.3%, respectively.
The agaropectin contained no protein, amino acid or nucleic acid. The content of SPS-2 consisting of polysaccharides of similar chain
length of was 92.14%. The mass-average and number-average relative molecular masses of SPS-2 were 367686 and 230434,
respectively. SPS-2 was a group of complex sulfated polysaccharide with 17.34% galactose, 2.72% raffinose, 8.82% saccharose
and 1.18% arabinose in the monosaccharide composition.
Key words：agaropectin；isolation and purification；IR analysis；monosaccharide composition
中图分类号：Q819 文献标志码：A 文章编号：1002-6630(2013)23-0160-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201323034
收稿日期：2012-12-25
作者简介：刘秋凤(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为水产资源综合利用。E-mail：qfeng.liu@163.com
*通信作者：吴成业(1953—)，男，研究员，研究方向为水产品保鲜、加工、综合利用及食品安全。E-mail：wcy@fjscs.ac.cn
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是江蓠属(Gracilaria)
的一种温带性红藻[1]，原产于我国的山东沿海和日本冲绳
岛。龙须菜多糖含量约占藻体干质量30%，是一类高活性
物质，具有免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂、肾脏保
护作用、抗凝血、抗肿瘤及抗病毒等多种生理活性和药
理活性[2]，但有关龙须菜多糖的活性作用机制还有待更进
一步的研究[3]。Marinho-Soriano[4]、宫春宇[3]、卢佳芳[5]等
研究了龙须菜多糖的抗氧化和免疫活性、分离纯化及结构
鉴定，说明多糖的活性与纯度、结构均有关。硫琼脂属于
龙须菜多糖，国内外对硫琼脂的研究报道不多，尤其在结
构、相对分子质量、单糖组成等方面的研究更是少见。本
实验利用DEAE Cellulose-52离子交换柱分离纯化硫琼脂组
分，高效体积排阻色谱(HPSFC)、高效液相凝胶过滤色谱法
(HPGFC)等进行纯度鉴定和分子质量测定，高效液相色
谱(HPLC)分析硫琼脂的单糖组成，同时采用紫外光谱和
红外光谱对硫琼脂的结构特征进行初步判断，以期为硫
琼脂的分离纯化及对生物活性的影响提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂及仪器
二乙胺基乙基纤维素52(DEAE Cellulose-52) 美国
Whatman公司；葡聚糖 上海源叶生物科技有限公司；
棉子糖、L-鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、
葡萄糖、半乳糖、果糖 美国Sigma公司；氯化钠、浓硫
酸、苯酚、 溴化钾等，均为国产分析纯。
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.23 161
BT/01L系列分配智能型蠕动泵 保定雷弗流体科
技有限公司；LGJ-12真空冷冻干燥机 宁波新芝生物科
技股份有限公司；R205旋转蒸发器 上海申生科技有
限公司；玻璃层析柱、SBS-100数控计滴自动部份收集器
上海沪西仪器厂有限公司，BS124S型分析天平 赛多
利斯科学仪器(北京)有限公司；752PC 紫外-可见光分光
光度计 上海光谱仪器有限公司；RFX-65A傅里叶变换
红外光谱仪 美国Analect 公司；410示差检测器、515
型高效液相色谱仪 美国Waters公司；MIC-1型离子色
谱仪 瑞士万通公司。
1.2 硫琼脂的制备
龙须菜中琼脂的提取方法参照参考文献[6]；制备硫
琼脂的方法参照参考文献[7]。
1.3 硫琼脂的分离纯化
硫琼脂分离纯化的方法参照参考文献[8]。配制质量浓
度为20mg/mL 的硫琼脂溶液，将该溶液溶解后上样于DEAE
Cellulose-52层析柱(1.6cm×60cm)，流速为1.0mL/min，自
动收集器收集。上样体积5mL，上样量100mg，每管收
集5mL。依次用蒸馏水及0.5、1.0mol/L NaCl溶液分段梯
度洗脱。洗脱时，采用苯酚-硫酸法对洗脱液进行跟踪
测定，直至无多糖检测出为止，并以试管数为横坐标，
吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集蒸
馏水级分、0.5mol/L NaCl级分和1.0mol/L NaCl级分的样
品，经浓缩、透析、冷冻干燥后再做进一步分析。
1.4 硫琼脂分级产物的紫外光谱分析
将1.2节制备得到的硫琼脂配成质量浓度为10mg/mL的
溶液，在波长200～400nm区域内进行紫外光谱扫描。
1.5 游离硫酸基含量及总硫含量的测定
样品中游离硫酸基含量的测定方法参照参考文献[9]。
总硫含量测定中，样品处理方法按RCC-M-Edition 2007
版[10]，氧弹法处理样品。离子色谱法[11]测定游离硫酸基
及总硫的含量。离子色谱仪条件：MIC-1型离子色谱仪
Metrosep A Supp 5-250色谱柱；检测器：电导检测器；
淋洗液：3.2mmol/L Na2CO3溶液和1.0mmol/L NaHCO3溶
液；抑制器再生模式：外加100mmol/L硫酸溶液抑制；检
测池温度：常温，30℃；进样量：20μL，定量环进样。
1.6 硫琼脂分级产物的纯度鉴定
纯度鉴定方法参照参考文献[3]。采用高效体积排阻
色谱(HPSFC)对硫琼脂分离产物的纯度进行鉴定。配制
2mg/mL样品(溶剂为高效液相流动相)，10000r/min离心
20min，取上清100μL上样，以出峰时间为横坐标，出
峰强度为纵坐标，记录洗脱曲线，样品纯度根据峰型和
峰面积进行判断及测定。HPSEC的具体测试条件如下：
Waters-515型高效液相色谱系统中Sugar-PakTM Ⅰ色谱
柱，柱温：70℃，流动相为纯水，流速为0.6mL/min，
Waters-410示差检测器检测。
1.7 硫琼脂分级产物相对分子质量的测定
相对分子质量方法参照参考文献[1]。采用高效液
相凝胶过滤色谱法(HPGFC)对硫琼脂的分级产物进行
相对分子质量的测定。样品及系列标准多糖(具有不同
相对分子质量的葡聚糖：50000、100000、200000、
300000、500000)分别流经Waters-515型高效液相色谱系
统中Sugar-PakTM Ⅰ色谱柱，柱温：70℃，流动相为纯
水，流速为0.6mL/min，Waters-410示差检测器检测。
根据微分重量分布曲线和Agilent GPC软件计算样品相对
分子质量。
1.8 硫琼脂分级产物的红外光谱(IR)分析
硫琼脂分级产物的IR分析方法参照参考文献[13]。
取冷冻干燥的硫琼脂分级产物1～2mg，与100mg干燥的
KBr混匀，使用压片装置将混合物压成透明片剂，在波数
400～4000cm-1区域内进行扫描。
1.9 单糖组成分析
单糖标准品及样品的衍生化方法参照参考文献[14]。
高效液相色谱法检测条件：Waters-515型高效液相色谱
仪；色谱柱：Sugar-PakTM Ⅰ；柱温：70℃；流动相：纯
水；流速：0.6mL/min；进样量：100μL，Waters 410示差
检测器。通过比对单糖标准品及样品的出峰时间谱图分
析样品的单糖组成。
2 结果与分析
2.1 硫琼脂的分离纯化
0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
1 15 29 43 57 71 85 99 113 127 141
㇑ᮠ
੨
ݹ
ᓖ
SPS-1
SPS-2
SPS-3
图 1 硫琼脂的DEAE-Cellulose 52柱层析纯化图
Fig.1 Purification of agaropectin by DEAE-Cellulose 52 column
chromatography
硫琼脂经DEAE-52层析柱吸附，不同溶液分段洗
脱，同时采用苯酚-硫酸法对洗脱液进行跟踪测定，得到
的洗脱曲线结果如图1所示。洗脱曲线图上出现的3个峰
分别是经蒸馏水及0.5、1.0mol/L NaCl 溶液分段梯度洗
脱得到的。根据洗脱曲线收集洗脱液，并分别经减压浓
缩、透析袋透析透析、冷冻干燥后得到3种分级产物，分
别命名为SPS-1、SPS-2、SPS-3，其得率分别为2.7%、
47.2%、2.2%。
2.2 硫琼脂的紫外光谱分析
硫琼脂配成10mg/mL溶液用紫外分光光度计在波长
162 2013, Vol.34, No.23 食品科学 ※基础研究
200～400nm区域内扫描，结果见图2。蛋白质、氨基酸
和核酸在250～280nm波长处有特征吸收峰，而图上无显
示上述特征吸收峰，说明硫琼脂结构中不含蛋白质、氨
基酸及核酸。
0
1
2
3
200 250 300 350 400
⌒䮯/nm
੨
ݹ
ᓖ
图 2 硫琼脂的紫外扫描图
Fig.2 UV spectrum of agaropectin
2.3 硫琼脂分级产物SPS-1、SPS-2、SPS-3总硫含量的
测定
离子色谱法测定硫琼脂分级产物SPS-1、SPS-2、
SPS-3硫酸基含量结果如表1所示。SPS-1、SPS-2、SPS-3
的游离硫酸基含量分别为 2.81%、0.18%、1.63%，总硫
含量分别为1.7%、3.1%、2.1%。根据总硫含量换算得到
各分级产物总硫酸基的含量为5.1%、9.3%、6.3%。硫
琼脂的生物活性是多方面的，但基本组成成分是酸性半
乳糖和硫酸根，而且其生物活性主要是受硫酸根含量及
其在糖链上所在位置的影响。一般来说，硫酸根含量越
高，生物活性越强。因此，以总硫酸基含量判断，SPS-2
具有较高的生物活性。
表 1 硫琼脂分级产物硫酸基含量测定结果(x±s)
Table 1 Sulfate group contents in agaropection fractions (x±s)
样品 游离硫酸基含量/% 总硫含量/% 总硫酸基含量/%
SPS-1 2.81 1.7 5.1
SPS-2 0.18 3.1 9.3
SPS-3 1.63 2.1 6.3
2.4 SPS-2的纯度鉴定及相对分子质量测定
250
255
260
265
270
275
280
285
290
0 5 10 15 20 25 30 35
20
.9
51
25
.6
55
m
V
ᯊ䯈/min
图 3 SPS-2的高效体积排阻(HPSEC)色谱图
Fig.3 High performance size exclusion chromatogram of SPS-2
由于多糖是一种生物高分子，其存在的微观不均一
性决定了多糖的纯度不能以通常的小分子化合物的纯度
标准来衡量[12]。多糖的纯度表示的是某一种相似链长的
多糖分子的平均分布。一般来说，在凝胶柱填料的排阻
极限内，HPSEC色谱图中呈现窄的单一对称峰即可认为
所测的多糖组分为均一多糖。由此判断，图3中SPS-2不
是均一多糖，但由表2可知，SPS-2的组成峰面积百分比
分别为92.14%、7.86%，这说明SPS-2中一种相似链长的
多糖占绝大部分，有少部分是另一种相似链长多糖的成
分，即SPS-2的纯度为 92.14%。
表 2 SPS-2的纯度鉴定结果
Table 2 HPSEC data of SPS-2
样品名称 保留时间/min 出峰面积 面积比/%
SPS-2
20.951 8956553 92.14
25.655 763778 7.86
根据微分重量分布曲线和Agilent GPC软件计算得到
的SPS-2相对分子质量结果，SPS-2的重均相对分子质量
(Mw)为367686，数均相对分子质量(Mn)为230434。
2.5 SPS-2的红外光谱分析
4000 3000 2000 1800 15001400 1200 1000 800 600 400
50
42
33
25
17
8
0
⌒ᮠ/cm-1
䘿
ݹ
⦷
%
图 4 SPS-2的红外光谱图
Fig.4 IR spectrum of SPS-2
由图4可知，2925.48cm-1是C－H键的特征吸收峰，
3436.53cm-1处强吸收峰是－OH的伸缩振动峰，通过这2
个吸收峰可判断硫琼脂是一种糖类化合物；1633.41cm-1
是C＝O伸缩振动的强吸收峰，表明硫琼脂是一种含有
－COOH的酸性多糖；1540cm-1为肽键CO－NH的特征吸
收峰，而图上并无此吸收峰，表示硫琼脂结构中不含有
蛋白质类杂质，这也进一步验证了硫琼脂的紫外光谱分
析结果；1378.85cm-1有较弱吸收峰，为C＝O的对称吸收
峰，是硫琼脂中羟基化的特征吸收峰；1234.22cm-1为S＝O
伸缩振动峰，说明含有硫酸酯键，为总硫酸基，且含量
较高；1147.44cm-1为C－O的伸缩振动及O－H变形振动
峰；932cm-1和1074.16cm-1处为C－O键的伸缩振动峰，证
明含有3,6-内醚半乳糖；851cm-1处为C－O－S伸缩振动
峰，推断出D-半乳糖C4上有直键硫酸基；此外在810、
870、1720cm-1处无吸收峰，可知硫琼脂结构中未含有甘
露糖及糖醛酸。通过1234.22cm-1和1633.41cm-1的吸收峰
初步可判断SPS-2是一种硫酸酯多糖。
2.6 SPS-2的单糖组成分析
采用高效液相色谱法(HPLC)判断多糖中的单糖组
※基础研究 食品科学 2013, Vol.34, No.23 163
成，是根据样品中各单糖的保留时间与标准单糖的保
留时间的比对结果判断样品中的单糖成分。由图5可
知，棉子糖、蔗糖、半乳糖和阿拉伯糖的出峰时间分
别为8.332、10.068、13.023、15.450min，峰面积分别
为11864572、412179、13836218、344995(表3)。由图6
可知，SPS-2含有4种单糖，其出峰时间分别为8.467、
10.225、12.943、15.533min，峰面积分别为75127、
168493、514911、33316。与标准单糖比对，可知SPS-2
中含有棉子糖、蔗糖、半乳糖和阿拉伯糖，其峰面积百
分比分别为9.5%、21.3%、65.0%、4.2%。根据Agilent
GPC软件计算结果可知SPS-2中棉子糖、蔗糖、半乳
糖和阿拉伯糖的含量分别为2.72%、8.82%、17.34%、
1.18%(表4)。由于SPS-2中不含有L-鼠李糖、岩藻糖、甘
露糖、木糖、葡萄糖、果糖，故不附上述标准单糖的色
谱图及谱图分析结果。
表 3 标准单糖高效液相色谱分析结果
Table 3 HPLC analytical results of monosaccharide standards
标准单糖 棉子糖 蔗糖 半乳糖 阿拉伯糖
出峰时间/min 8.332 10.068 13.023 15.450
峰面积 11864572 412179 13836218 344995
350
a
300
250
200
150
20 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
V
ᰦ䰤/min
8.332
23
b
22
21
20
19
18
17
16
20 4 6 8 10 12 14 16 18 2220
m
V
ᰦ䰤/min
10.068
120
160
200
240
280
320 c
20 4 6 8 10 12 14 16 18
m
V
ᰦ䰤/min
13.023
22 d
21
20
19
18
20 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
V
ᰦ䰤/min
15.450
a.棉子糖；b.蔗糖；c.半乳糖；d.阿拉伯糖。
图 5 各单糖的标准色谱图
Fig.5 Standard chromatograms of monosaccharides
280
260
240
220
200
180
20 4 6 8 10 12 14 16 18 20
m
V
ᰦ䰤/min
8.
46
7
10
.2
25
12
.9
43
15
.5
33
图 6 SPS-2的单糖成分色谱图
Fig.6 Chromatogram of the monosaccharide composition of SPS-2
表 4 SPS-2的单糖分析结果
Table 4 HPLC analytical results of the monosaccharide composition of SPS-2
测定指标 棉子糖 蔗糖 半乳糖 阿拉伯糖
含量/% 2.72 8.82 17.34 1.18
出峰时间/min 8.467 10.225 12.943 15.533
峰面积 75127 168493 514911 33316
峰面积比例/% 9.5 21.3 65.0 4.2
3 讨 论
采用EDTA-Na2浸提法制备的硫琼脂，经过DEAE
Cellulose-52层析柱分离纯化得到硫琼脂3种分级产物SPS-1、
SPS-2、SPS-3，其得率分别为2.7%、47.2%、2.2%。通
过紫外光谱分析可知，硫琼脂结构中无蛋白质、氨基酸
和核酸，同时SPS-2的红外扫描光谱结果也进一步验证此
结论。采用离子色谱法测定了SPS-1、SPS-2、SPS-3的
硫酸根含量分别为5.1%、9.3%、6.3%，这与文献[15]中
硫琼脂硫酸基含量的结果比较，文章检测结果偏低，可
能是因为样品受潮或者消化不完全所致，也有可能是因
为龙须菜原料的季节性、产地等原因其自身的硫酸基含
量不同所致，对于硫琼脂各分级产物的硫酸基含量有待
进一步研究。高效液相色谱法分别鉴定及测定了SPS-2的
纯度和相对分子质量，结果表明SPS-2中具有相似链长的
多糖占有92.14%，其重均相对分子质量(Mw)为367686，
数均相对分子质量(Mn)为230434。SPS-2的红外光谱分
析可知，SPS-2含有3,6-内醚半乳糖、硫酸酯键及酸性多
164 2013, Vol.34, No.23 食品科学 ※基础研究
糖，其硫酸基在D-半乳糖C4上，初步可确定SPS-2为硫
酸酯多糖，这与参考文献[15-20]对硫琼脂的定义相符。
根据单糖组成分析的结果可知，SPS-2中含有棉子糖、蔗
糖、半乳糖和阿拉伯糖，其含量分别为2.72%、8.82%、
17.34%、1.18%。本实验对硫琼脂的分级产物做了初步
探讨，这对硫琼脂的结构以及其在生物活性多样性方面
的应用研究提供了一定的参考，但要对其进行全面分析
以确定糖类的链接方式，还需要结合其他方法如Smith降
解、甲基化分析、核磁共振方法等[21-25]。
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