全 文 ：31※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 01
裸燕麦球蛋白的分离纯化及其抗氧化活性研究
蔺 瑞，张美莉﹡，张家超
(内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018)
摘 要：采用Osborne法提取裸燕麦球蛋白，利用盐析、SephadexG-100凝胶过滤层析、SDS-PAGE电泳等方法进
一步纯化，并对各球蛋白组分进行抗氧化能力的研究。结果表明：裸燕麦球蛋白的硫酸铵饱和度为 60%。在柱层
析分离条件下(洗脱速度为 3～7mL/10min，缓冲溶液为蒸馏水)，得到的组分 I分子质量范围分布在 44、34～29、
25kD，组分 II分子质量范围分布在 25、23、19kD。组分 I清除 3 种自由基的作用较强，清除·O H、O 2·、
DPPH自由基的 IC 50分别为 3.73、0.016、1.033mg/mL，其中对O 2·清除能力大于VC对O 2·的清除能力。组
分 II清除 3种自由基能力均低于分离组分 I、盐析后球蛋白和球蛋白粗提物。
关键词：裸燕麦；球蛋白；纯化；抗氧化
Purification and Antioxidant Activity of Globulins from Naked Oat Seeds
LIN Rui，ZHANG Mei-li*，ZHANG Jia-chao
(College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China)
Abstract：A crude globulin extract from naked oat seeds was prepared by Osborne method and purified by salting-out and
Sephadex G-100 gel filtration chromatography, and the crude extract was separated into two fractions (I and II). The crude
globulin extract, its salting-out purification product and fractions I and II were subjected to SDS-PAGE analysis and antioxidant
activity evaluation. Oat seed globulins exhibited 60% degree of saturation with ammonium sulphate. The molecular weight
distribution of fraction I consisted of 44, 34－ 29kD and25 kD, and that of fraction I was 25, 23, 19 kD. Among the four
materials, fraction I had the strongest scavenging effect on hydroxyl, superoxide anion and DPPH free radicals, with IC50 values
of 3.73, 0.016 mg/mL and 1.033 mg/mL, respectively, and its hydroxyl free radical scavenging effect was higher than that of VC.
However, the free radical scavenging effect of fraction II was lower than those of all three other materials.
Key words：naked oat；globulin；purification；antioxidant
中图分类号：TS201.25 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)01-0031-04
收稿日期：2010-04-22
基金项目：国家现代农业(燕麦)产业技术体系建设专项(nycytx-014)；教育部留学回国人员科研启动基金项目
作者简介：蔺瑞(1983—)，女，硕士研究生，研究方向为植物生物活性物质的分离提取。E-mail：linrui321123@sohu.com
* 通信作者：张美莉( 1 9 6 6 —)，女，教授，博士，研究方向为植物生物活性成分的分离提取及农产品加工。
E-mail：zhangmeili22@sina.com
在世界禾谷类作物中，燕麦总产量位列第 5位[ 1]，
而中国是裸燕麦发源地，我国裸燕麦每年实际种植面积
在 100万 hm2左右，主要分布在华北北部的冀、晋、蒙
高寒山区、西北的六盘山麓和云、贵、川的高纬度、
高海拨、高寒山区 [ 2 ]。
燕麦中蛋白质是谷物中氨基酸最平衡的蛋白质之
一，这些蛋白质中含有 18种氨基酸，其中 8 种是人体
必需氨基酸，且配比合理、人体利用率高，其蛋白质
营养价值可与鸡蛋媲美[3-4]，对于改善人们的营养状况和
提高人们的健康水平有很大的促进作用，特别是有益于
增进智力和骨骼的发育的赖氨酸含量是大米和小麦粉的2
倍以上，具有防贫血和毛发脱落作用的色氨酸含量也高
于大米和小麦粉。因此燕麦蛋白是优质的蛋白质资源，
它的开发和利用对人体的功能保健具有重要的意义[5]。
燕麦蛋白是一种优质的，具有生命活力的谷物蛋
白，其中蕴涵着许多具有生物活性的氨基酸序列，是
天然抗氧化剂的重要来源之一。近年来，燕麦的抗氧
化活性已成为西方发达国家研究的热点之一。
但对裸燕麦球蛋白抗氧化性的研究较少，对其清除
自由基、抗氧化作用机理尚不清楚，亟待深入研究。
本实验以裸燕麦为原料提取球蛋白，通过凝胶分离纯化
测定其分子质量，并筛选出具有较强抗氧化活性的组
分，为进一步开发利用裸燕麦球蛋白资源提供研究基
础，对于推动裸燕麦产业化发展具有重要的实践意义。
2011, Vol. 32, No. 01 食品科学 ※基础研究32
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
裸燕麦取自内蒙古武川县，贮藏于 0～4℃；
SephadexG-100 美国 GE 公司；牛血清白蛋白
(BSA)、二苯基苦味酰基自由基(DPPH)、VC Sigma公
司；三羟甲基氨基甲烷(Tri s )、邻二氮菲、硫酸亚铁、
双氧水、邻苯三酚、巯基乙醇、溴酚蓝、十二烷基
硫酸钠( S D S )、过硫酸铵、甘氨酸、乙二胺四乙酸钠
(EDTA)、考马斯亮蓝R-250、丙烯酰胺(Acr)、甲叉双丙
烯酰胺(Bis)，以上试剂均分析纯 洪之鑫惠试剂公司。
紫外 -可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责
任公司；H2500R-2高速冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪
器开发有限公司；FD-2冷冻干燥机、YC-1层析冷柜 北
京博医康实验仪器公司；HL-1恒流泵、HD-21-1核酸蛋
白检测仪、BSZ-100自动部分收集器 上海青浦沪西仪
器厂；XWT-S小型台式记录仪 上海自动化仪表三厂；
层析柱(1.6cm× 50cm) 上海锦华层析设备厂；DYCZ-
24D垂直电泳槽、DY-602稳流稳压电泳仪、WD-9405A
脱色摇床 北京六一仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 裸燕麦球蛋白的制备和盐析
裸燕麦经去壳、脱毛、磨粉、脱脂后，采用
Mendel等[6]方法制备裸燕麦球蛋白。
分别取 10mL等量球蛋白溶液预先冷却到 4℃，准
确称取并缓慢加入 20 %、30 %、40%、50%、60 %、
70%、80%、90%、100%饱和度所需硫酸铵质量。当
溶液出现浑浊时静置 1h，以 10000× g离心 20min，收
集上清液并测定未沉淀蛋白含量，确定球蛋白的硫酸铵
饱和度。然后用硫酸铵大量沉淀球蛋白，并在 4℃下透
析 48h，冷冻干燥得盐析后球蛋白提取物[7]。
1.2.2 裸燕麦球蛋白纯化条件的选择
采用SephadexG-100凝胶柱纯化盐析后球蛋白提取物。
凝胶通过装柱、除泡、平衡后，缓慢加入经缓冲液透析
后的样品 1.0mL，洗脱条件为：泵速：3.0mL/10min；检
测波长：280nm；走纸速：3cm/h；自动部分收集器：
10min/管。在波长 280nm处测定洗脱液的紫外吸光度，
并收集、浓缩各峰处的洗脱液[ 8 ]。
1.2.2.1 洗脱速度的选择
分别采用洗脱速度 3.0、7.0mL/10min对裸燕麦球蛋
白进行洗脱，通过对照洗脱图谱，确定洗脱流速范围。
1.2.2.2 缓冲液的选择
分别采用蒸馏水(含 0.5mol/L氯化钾)和 pH7.0，
0.2mol/L磷酸缓冲溶液(含 0.5mol/L氯化钾)对样品进行洗
脱，通过对照洗脱图谱选择合适的缓冲液。
1.2.3 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳( S D S -
PAGE)测定分子质量[9]
采用 15 % 的分离胶，5% 的浓缩胶对球蛋白粗提
物、盐析后球蛋白、凝胶过滤层析峰收集蛋白溶液及
标准蛋白进行 SDS-PAGE电泳分析，且上样量 20μL。
恒流 30mA，5h后，用考马斯亮蓝 R-250染色 1h，醋
酸、乙醇脱色过夜，并在凝胶电泳系统成像仪下拍照。
1.3 裸燕麦球蛋白对·OH 和 O 2·清除作用的测定
参考文献[10-11]方法进行测定。
1.4 裸燕麦球蛋白对DPPH自由基清除作用的测定
对金杰等[12]的方法进行改进。在反应体系中依次加
入 2mL 0.1mmol/L DPPH的乙醇溶液、1.0mL试样、1mL
蒸馏水和 2mL无水乙醇，立即混匀于室温下放置 30min
后测定混合溶液在波长 515nm处的吸光度。用等量蒸馏
水做空白对照。清除率按下式计算。
　　
Ai－Aj
清除率 /%=(1－————)× 100
　　 A0
式中：A0为未加样品液的DPPH溶液的吸光度；Ai
为加入样品液后的DPPH溶液的吸光度；Aj为乙醇与样
品液混合后的吸光度。
2 结果与分析
2.1 裸燕麦球蛋白的硫酸铵盐析
硫酸铵是温和的试剂，提纯时即使浓度很高，也
不会引起蛋白质生物活性的丧失。除此之外，硫酸铵
分级蛋白可以除去杂蛋白[13]。图 1显示，随着硫酸铵饱
和度的逐渐增加，未沉淀蛋白量呈现先增加后减小的趋
势，当硫酸铵饱和度为 60%时，未沉淀蛋白量最少为
0.9%，表明溶液中大量蛋白沉淀。从而得到裸燕麦球
蛋白的硫酸铵盐析饱和度为 60%。
图 1 裸燕麦球蛋白硫酸铵盐析浓度曲线
Fig.1 Ammonium sulphate salting-out curve of oat seed globulins
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
未
沉
淀
蛋
白
/%
硫酸铵饱和度 /%
20 40 60 80 100 120
未
沉
淀
蛋
白
/%
2.2 裸燕麦球蛋白纯化条件的选择
2.2 1 洗脱速度的选择
凝胶过滤层析是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白
33※基础研究 食品科学 2011, Vol. 32, No. 01
质的质量进行分离和纯化的。经盐析后的球蛋白经过葡
聚糖多孔网状结构物质，使蛋白质混合物按分子大小的
不同进行分离[14]。由图 2可知，洗脱速度的控制对裸燕
麦球蛋白的分离影响很大，洗脱速度太大，易引起洗
脱峰的重叠；洗脱速度太慢，会造成样品的加剧扩散、
区带变宽、实验时间过长。所以通过对比以下层析图
谱，可以确定洗脱速度在 3～7mL/10min时有较好的分离
效果。
洗脱速度为 3.0mL/10min。
图 3 磷酸盐缓冲溶液洗脱图
Fig.3 Elution curve of oat seed globulins on Sephadex G-100 gel
column with phosphate buffer saline at a flow rate of 3.0 mL/10 min
50
40
30
20
10
0
m
V
洗脱时间 /%
180 150 120 90 60 30 0
2.3 裸燕麦球蛋白 SDS-PAGE电泳分析
SDS-PAGE根据蛋白分子质量亚基的不同而分离蛋
白。图 4显示裸燕麦球蛋白粗提物在 44～14kD上都有条
带分布；经盐析后球蛋白不含条带 23、20、15kD；经
层析后的组分 I条带分布在 44、34～29、25kD，组分
II 条带分布在 25、23、19kD。
2 和 4 .标准蛋白；3 .球蛋白粗提物；1 .盐析后
球蛋白；5. 组分 II收集蛋白；6. 组分 I收集蛋白。
　　图 4 裸燕麦球蛋白的 SDS-PAGE图谱
　Fig.4 SDS-PAGE patterns of crude globulin extract from oat seeds,
its salting-out purification product and fractions I and II
97.2kD
1 2 3 4 5 6
66.4kD
44.3kD
20.1kD
29.0kD
14.3kD
2.4 裸燕麦球蛋白粗提物的抗氧化能力
图 5 裸燕麦球蛋白粗提物抗氧化能力曲线
Fig.5 Logarithmic dependence of hydroxyl, superoxide anion and
DPPH free radical scavenging effects of crude globulin extract from oat
seeds upon concentration
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
·OH 清除率
O 2－·清除率
DPPH自由基清除率
清
除
率
/%
粗提物终质量浓度 /(mg/mL)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
图 5显示了裸燕麦球蛋白粗提物对羟自由基、超氧
阴离子自由基、DPPH自由基有一定的清除作用，清除
率都随质量浓度的增加而上升，呈现量效关系。符合
对数曲线方程分别为：·OH y＝ 10.662lnx+22.12(R2＝
0.9818)；O2· y＝ 11.628lnx+26.43(R2＝ 0.9708)；DPPH
自由基 y =18.394lnx + 29.9(R2＝ 0.9831)，并经计算其
清除·OH、O2·、DPPH自由基的 IC 50分别为 13.67、
7.59、2.98mg/mL，其抗氧化能力：DPPH自由基清除
作用＞ O 2·清除作用>·O H 清除作用。V C 是一种重
要的自由基清除剂，常用来衡量各种活性物质抗氧化能
力的大小，本实验选用 VC作对照。其清除 3种自由基
的能力呈现量效关系符合对数曲线方程(图略)，经计算
VC清除·OH、O2·、DPPH自由基的 IC50分别为 0.14、
0.041、0.023mg/mL。由此可知，裸燕麦球蛋白粗提物
清除 3种自由基能力要弱于 VC。
2.2.2 缓冲液的选择
缓冲液可达到控制 pH值的目的，同时可以消除裸
燕麦球蛋白水解物与凝胶之间可能存在的弱相作用，所
以层析分离时需要选择合适的缓冲液[15 ]。由图 3可知，
pH7.0磷酸缓冲液洗脱获得的图谱为 1个峰，分离效果
不好；而从图 2可以看出，蒸馏水缓冲液洗脱获得的图
谱为两个峰，分离效果很好，并且鉴于蒸馏水的经济
性，考虑使用蒸馏水为最佳的缓冲液。
a.洗脱速度为 3.0mL/10min；b.洗脱速度为 7.0mL/10min。
图 2 蒸馏水缓冲溶液洗脱图
Fig.2 Elution curve of oat seed globulins on Sephadex G-100 gel
column with distilled water at a flow rate of 3.0,7.0 mL/10 min
70
60
50
40
30
20
10
0
m
V
洗脱时间 /%
180 150 120 90 60 30
b
70
60
50
40
30
20
10
0
m
V
洗脱时间 /%
300 270 240 210 180 150 120 90 60
a
Ⅱ
Ⅰ
2011, Vol. 32, No. 01 食品科学 ※基础研究34
2.5 盐析后球蛋白的抗氧化能力
图 6 盐析后裸燕麦球蛋白抗氧化能力曲线
Fig.6 Logarithmic dependence of hydroxyl, superoxide anion and
DPPH free radical scavenging effects of salting-out purified globulin
extract from oat seeds upon concentration
70
60
50
40
30
20
10
0
·OH 清除率
O 2－·清除率
DPPH自由基清除率
清
除
率
/%
粗提物终质量浓度 /(mg/mL)
0 1 2 3 4
由图 6 可知，盐析后球蛋白对羟自由基、超氧阴
离子自由基、D PPH 自由基的清除作用都随质量浓度
的增加而上升，呈现量效关系。符合对数曲线方程分
别为：·OH y=14.6lnx+23.567(R2=0.9825)；O2· y=
20.241lnx+20.225(R2=0.9852)；DPPH自由基 y=17.702lnx+
38.47(R 2=0.9968)，并通过计算其清除·OH、O 2·、
DPPH自由基的 IC50分别为6.11、4.35、1.97mg/mL，即其
抗氧化能力：清除DPPH自由基＞ O2·＞·OH，但都
明显小于VC。而与甜荞球蛋白的抗氧化活性相比较高[16]。
2.6 分离组分 I的抗氧化能力
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
·OH 清除率
O 2－·清除率
DPPH自由基清除率
清
除
率
/%
组分Ⅰ终质量浓度 /(mg/mL)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
图 7 组分 I抗氧化能力曲线
Fig.7 Logarithmic dependence of hydroxyl, superoxide anion and
DPPH free radical scavenging effects of fraction I upon concentration
图 7显示，分离组分 I对羟自由基、超氧阴离子自
由基、DPPH自由基有较好的清除作用，清除率都随质
量浓度的增加而上升，呈现量效关系。符合对数曲线
方程分别为：·OH y=10.835lnx+35.73(R2=0.9099)；O2·
y=7.0548lnx+79.32(R2=0.9775)；DPPH自由基 y=14.441lnx+
49.53(R2=0.9936)，并经计算其清除·OH、O2·、DPPH
自由基的 IC50分别为 3.73、0.016、1.033mg/mL，其抗氧
化能力：O2·清除作用＞DPPH自由基清除作用＞·OH
清除作用，其中对 O 2·清除能力大于 VC 对 O 2·的清
除能力。 　　
2.7 分离组分 II的抗氧化能力
分离组分 I I 对·O H、O 2·、D P PH 自由基 3 种
自由基清除作用不明显，表现为清除率随质量浓度的增
加而缓慢增加(图略)，当组分 II的质量浓度为 5mg/mL
时，对·O H、O 2·、D P P H 自由基的清除率分别为
5.1%、11.4%、20%，低于分离组分 I、盐析后球蛋白、
球蛋白粗提物清除 3种自由基的能力，显示了极低的抗
氧化活性。
通过对裸燕麦球蛋白粗提物、盐析后球蛋白、层析后
分离组分 I和分离组分 II抗氧化能力的比较，可知各样品
对·OH、O2·、DPPH自由基清除作用为：分离组分 I＞
盐析后球蛋白＞球蛋白粗提物＞分离组分 II。其中分离组分
I清除O2·能力大于VC，显示了较高的抗氧化能力。
3 结 论
3.1 SephadexG-100凝胶层析分离裸燕麦球蛋白的条件
如下：洗脱速度在 3～7mL/min，缓冲溶液为蒸馏水，
得到组分 I 和组分 I I，在此条件下分离效果较好。
3.2 SDS-PAGE电泳结果显示：裸燕麦球蛋白粗提物的
分子质量范围分布在 44～14kD；经盐析后球蛋白不含条
带 23、20、15kD；经层析后组分 I的分子质量范围分
布在 44、34～29、25kD，组分 II的分子质量范围分布
在 2 5、2 3、1 9 k D。
3.3 分离组分 I 对·O H、O 2·、D P PH 自由基清除
作用较其他 3个组分的清除作用强，且 IC50分别为 3.73、
0.016、1.033mg/mL，其中对O2·的清除能力大于VC，
显示较高的抗氧化能力。但分离组分 II的抗氧化能力极弱。
参 考 文 献 ：
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